Генная и клеточная инженерия

32

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генная и клеточная инженерия. Опасность современных биотехнологий

1. Генная и клеточная инженерия. Опасность современных биотехнологий

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

· специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

· быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

· конструирование рекомбинантной ДНК;

· гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

· клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

· введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

История генетической инженерии. Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50 - 60-х годов 20 века были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа. Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бой¬ер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

Получение генномодифицированных (трансгенных) сортов растений и продуктов питания

Введение генов в растительные клетки. Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами. Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения. Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно, впрочем, трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы - хлоропласты и митохондрии.

В последнее время был разработан и успешно применен также комбинированный метод трансформации, названный агролистическим. При этом чужеродная ДНК вводится в ткани каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Вводимая ДНК включает как Т-ДНК вектор с целевым и маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности, поставленные под эукариотический промотор. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном, как и при обычной агробактериальной трансформации.

После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.

Достижения генной инженерии растений. Первые трансгенные растения (растения табака со встроенными генами из микроорганизмов) были получены в 1983 г. Первые успешные полевые испытания трансгенных растений (устойчивые к вирусной инфекции растения табака) были проведены в США уже в 1986 г.

После прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой "Calgen", а также гербицид-устойчивая соя компании "Monsanto". Уже через 1-2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса, хлопчатника.

В настоящее время получением и испытанием генетически модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире с совокупным капиталом более ста миллиардов долларов. В 1999 г. трансгенные растения были высажены на общей площади порядка 40 млн. га, что превышает размеры такой страны, как Великобритания. В США генетически модифицированные растения (GM Crops) составляют сейчас около 50% посевов кукурузы и сои и более 30-40% посевов хлопчатника. Это говорит о том, что генно-инженерная биотехнология растений уже стала важной отраслью производства продовольствия и других полезных продуктов, привлекающей значительные людские ресурсы и финансовые потоки. В ближайшие годы ожидается дальнейшее быстрое увеличение площадей, занятых трансгенными формами культурных растений.

Первая волна трансгенных растений, допущенных для практического применения, содержала дополнительные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредителям, порче при хранении, стрессам).

Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие "лекарственные" белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.

Запасные белки основных культурных видов кодируются семейством близкородственных генов. Накопление запасных белков семян - сложный биосинтетический процесс. Первая генноинженерная попытка улучшения свойства одного растения путем введения гена запасного белка от другого была, проведена Д. Кемпом и Т. Холлом в 1983 г. в США. Ген фазеолина бобов с помощью Ti-плазмиды был перенесен в геном подсолнечника. Результатом этого опыта было лишь химерное растение, получившее название санбин. В клетках подсолнечника были обнаружены иммунологически родственные фазеолиновые полипептиды, что подтверждало факт переноса гена между растениями, относящимися к различным семействам

Более реальной задачей для генетической инженерии считается улучшение аминокислотного состава белков.

Растения могут производить и белки животного происхождения. Так, встраивание в геном растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus химерного гена, состоящего из части гена запасного 25-белка арабидопсиса и кодирующей части для нейропептида -- энкефалина, приводило к синтезу химерного белка до 200 нг на 1 г семени. Два структурных белковых домена были связаны последовательностью, узнаваемой трипсином, что давало возможность в дальнейшем легко изолировать чистый энкефалин.

В другом эксперименте удалось после скрещивания трансгенных растений, в одном из которых был встроен ген гамма-субъединицы, а во втором - ген каппа-субъединицы иммуноглобулина, получить у потомства экспрессию обеих цепей. В результате растение формировало антитела, составляющие до 1,3% суммарного белка листьев. Также было показано, что в растениях табака могут собираться полностью функциональные секреторные моноклональные иммуноглобулины. Предполагается, что на основе таких моноклональных антител, продуцируемых трансгенными растениями, удастся создать действительно антикариесную зубную пасту. Из других белков животного происхождения, которые представляют интерес для медицины, показана продукция в растениях человеческого в-интерферона.

Разработаны также подходы, позволяющие получать бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. Получен картофель, экспрессирующий олигомеры нетоксичной субъединицы в-токсина холеры. Эти трансгенные растения могут быть использованы для получения дешевой вакцины от холеры.

Жиры. Важнейшим сырьем для получения разного рода химических веществ являются жирные кислоты -- основной компонент растительного масла. По своей структуре это углеродные цепи, которые обладают различными физико-химическими свойствами в зависимости от своей длины и степени насыщения углеродных связей. В 1995 году была закончена экспериментальная проверка и получено разрешение от федеральных властей США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-членными жирными кислотами также и до 45% 12-членной жирной кислоты - лаурата. Это вещество широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики.

Полисахариды. Проводится работа по созданию трансгенных растений картофеля и других крахмалнакапливающих культур, в которых это вещество будет находиться в основном в виде амилопектина, то есть разветвленной форме крахмала, или же в основном только в виде амилозы, то есть линейных форм крахмала. Раствор амилопектина в воде более жидкий и прозрачный, чем у амилозы, которая при взаимодействии с водой образует ригидный гель. Так, например, крахмал, состоящий в основном из амилопектина, по-видимому, будет иметь спрос на рынке производителей различных питательных смесей, где сейчас в качестве наполнителя используется модифицированный крахмал. Генетической модификации могут подвергаться также геномы пластид и митохондрий. Такие системы позволяют значительно увеличить содержание продукта в трансгенном материале.

Создание гербицидоустойчивых растений. В новых, интенсивных сельскохозяйственных технологиях гербициды применяются очень широко. Это связано с тем. что на смену прежним экологически опасным гербицидам широкого спектра действия, обладающим токсичностью для млекопитающих и длительно сохраняющимся во внешней среде, приходят новые, более совершенные и безопасные соединения. Однако они обладают недостатком -- подавляют рост не только сорняков, но и культурных растений. Такие высокоэффективные гербициды, как, глифосат, атразины интенсивно изучаются на предмет выявления механизма толерантности к ним некоторых сорняков. Так, на полях, где широко используют атразин, довольно часто появляются атразинустойчивые биотипы у многих видов растении.

Изучение механизма устойчивости к гербицидам с целью получения методами генетической инженерии культурных растений, обладающих этим признаком, включает следующие этапы: выявление биохимических мишеней действия гербицидов в растительной клетке: отбор устойчивых к данному гербициду организмов в качестве источников генов устойчивости: клонирование этих генов: введение их в культурные растения и изучение их функционирования

Существуют четыре принципиально различных механизма, которые могут обеспечивать устойчивость к тем или иным химическим соединениям, включая гербициды: транспортный, элиминирующий, регуляционный и контактный. Транспортный механизм устойчивости заключается в невозможности проникновения гербицида в клетку. При действии элиминирующего механизма устойчивости вещества, попавшие внутрь клетки, могут разрушаться с помощью индуцируемых клеточных факторов, чаще всего деградирующих ферментов, а также подвергаться тому или иному виду модификации, образуя неактивные безвредные для клетки продукты. При регуляционной резистентности белок или фермент клетки, инактивирующийся под действием гербицида, начинает усиленно синтезироваться, ликвидируя таким образом дефицит нужного метаболита в клетке. Контактный механизм устойчивости обеспечивается изменением структуры мишени (белок или фермент), взаимодействием с которым связано повреждающее действие гербицида

Установлено, что признак гербицидоустойчивости является моногенным, то есть признак детерминируется чаще всего одним-единственным геном. Это очень облегчает возможность использования технологии рекомбинантной ДНК для передачи этого признака. Гены, кодирующие те или иные ферменты деструкции и модификации гербицидов, могут быть с успехом использованы для создания гербицидоустойчивых растении методами генетической инженерии.

Традиционные методы селекции создания сортов, устойчивых к гербицидам, очень, длительны и малорезультативны. Наиболее широко применяемый за рубежом гербицид глифосат (коммерческое название Roundup) подавляет синтез важнейших ароматических аминокислот, воздействуя на фермент 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазу (ЕПШФ-синтаза). Известные случаи устойчивости к этому гербициду связаны либо с повышением уровня синтеза этого фермента (регуляционный механизм), либо с возникновением мутантного фермента, нечувствительного к глифосфату (контактный механизм). Из устойчивых к глифосфату растений был выделен ген ЕПШФ-синтазы и поставлен под промотор вируса мозаики цветной капусты. С помощью Ti-плазмиды эта генетическая конструкция была введена в клетки петунии. При наличии одной копии гена в регенерированных из трансформированных клеток растениях синтезировалось фермента в 20 - 40 раз больше, чем в исходных растениях, но устойчивость к глифосфату увеличилась только в 10 раз.

К числу наиболее распространенных гербицидов, используемых при обработке зерновых культур, относится атразин. Он подавляет фотосинтез, связываясь с одним из белков фотосистемы II и прекращая транспорт электронов. Устойчивость к гербициду возникает в результате точечных мутаций в этом пластохинон связывающем белке (замена серина на глицин), вследствие чего он теряет способность взаимодействовать с гербицидом. В ряде случаев удалось осуществить перенос гена мутантного белка в чувствительные к атразину растения с помощью Ti-плазмиды. Интегрированный в хромосому растений ген устойчивости был снабжен сигнальной последовательностью, которая обеспечивала транспорт синтезируемого белка в хлоропласты. Химерные растения проявляли значительную устойчивость к таким концентрациям атразина, которые вызывали гибель контрольных растений с геном белка дикого типа. Некоторые растения способны инактивировать атразин путем отщепления остатка хлора ферментом глутатион-S-трансфераза. Этот же фермент инактивирует и другие родственные гербициды триазинового ряда (пропазин, симазин и др.).

Существуют растения, естественная устойчивость которых к гербицидам основана на детоксикации. Так, устойчивость растений к хлорсульфурону может быть связана с дезактивацией молекулы гербицида путем его гидроксилирования и последующего гликозилирования введенной гидроксильной группы. Создание растений, устойчивых к патогенам и вредителям Устойчивость растений к тем или иным патогенам чаще всего является сложным мультигенным признаком.

Одновременная передача нескольких локусов трудна даже методами генной инженерии, не говоря о классических методах селекции. Более простым является другой путь. Известно, что у устойчивых растений при атаке патогенов изменяется метаболизм. Накапливаются такие соединения, как Н2О2, салициловая кислота, фитоаллексины. Повышенный уровень этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами.

Вот один из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений. Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы (этот фермент разрушает салициловую кислоту), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген Н2О2 может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

В фитовирусологии широко известен феномен индуцированной перекрестной устойчивости растений к вирусным инфекциям. Сущность этого явления состоит в том, что заражение растения одним штаммом вируса предотвращает последующую инфекцию этих растений другим вирусным штаммом. Молекулярный механизм подавления вирусной инфекции пока неясен. Показано, что для иммунизации растений достаточно введения отдельных вирусных генов, например генов капсидных белков. Так, ген белка оболочки вируса табачной мозаики перенесли в клетки табака и получили трансгенные растения, у которых 0,1% всех белков листьев был представлен вирусным белком. Значительная часть этих растений при инфицировании вирусом не проявляла никаких симптомов заболевания. Возможно, что синтезирующийся в клетках белок оболочки вируса мешает вирусной РНК нормально функционировать и формировать полноценные вирусные частицы. Установлено, что экспрессия капсидного белка вируса табачной мозаики, вируса мозаики люцерны, вируса огуречной мозаики, Х-вируса картофеля в соответствующих трансгенных растениях (табак, томаты, картофель, огурцы, перцы) обеспечивает высокий уровень их защиты от последующей вирусной инфекции. Причем у трансформированных растений не отмечалось снижения фертильности, нежелательного изменения ростовых и физиологических характеристик исходных экземпляров и их потомства. Полагают, что индуцированная устойчивость растений к вирусам обусловлена особым антивирусным белком, очень похожим на интерферон животных. Представляется возможным методом генетической инженерии усилить экспрессию гена, кодирующего этот белок, путем его амплификации или подстановки под более сильный промотор.

Следует отметить, что использование генетической инженерии для защиты растений от различных патогенных микроорганизмов в значительной мере сдерживается недостаточностью знаний о механизмах защитных реакций растений. Для борьбы с насекомыми-вредителями в растениеводстве используются химические средства -- инсектициды. Однако они оказывают вредное влияние на млекопитающих, убивают и полезных насекомых, загрязняют окружающую среду, дороги, и кроме того, насекомые довольно скоро приспосабливаются к ним. Известно более 400 видов насекомых, устойчивых к используемым инсектицидам. Поэтому все большее внимание привлекают биологические средства борьбы, обеспечивающие строгую избирательность действия и отсутствие адаптации вредителей к применяемому биопестициду.

Уже довольно давно известна бактерия Bacillus thuringiensis, продуцирующая белок, являющийся очень токсичным для многих видов насекомых, в то же время безопасный для млекопитающих. Белок (дельта-эндотоксин, CRY-белок) продуцируется различными штаммами В. thuringiensis. Взаимодействие токсина с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин--насекомое. В природе найдено большое количество штаммов В. thuringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых. Препараты В. thuringiensis в течение десятилетий использовали для контроля насекомых на полях. Безопасность токсина и его составных белков для человека и других млекопитающих полностью доказана. Встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не поедаемые насекомыми.

Кроме видоспецифичности по действию на насекомых встраивание прокариотических генов дельта-токсинов в геном растений даже под контролем сильных эукариотических промоторов не привело к высокому уровню экспрессии. Предположительно такое явление возникло в связи с тем, что эти бактериальные гены содержат значительно больше адениновых и тиминовых нуклеотидных оснований, чем растительная ДНК. Эта проблема была решена путем создания модифицированных генов, где из природного гена вырезали и добавляли те или иные фрагменты с сохранением доменов, кодирующих активные части дельта-токсина. Так, например, с помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к колорадскому жуку. Получены трансгенные растения табака, способные синтезировать токсин. Такие растения были нечувствительны к гусеницам Manduca sexta. Последние погибали в течение 3 суток контакта с токсинпродуцирующими растениями. Токсинообразование и обусловленная им устойчивость к насекомым передавалась по наследству как доминантный признак.

В настоящее время так называемые Bt-растения (от В. thuringiensis) хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур, которые выращивают на полях США.

В связи с возможностями генной инженерии конструировать энтомопатогенные растения на основе токсина микробного происхождения еще больший интерес к себе вызывают токсины растительного происхождения. Фитотоксины являются ингибиторами белкового синтеза и осуществляют защитную функцию, направленную против насекомых-вредителей микроорганизмов и вирусов. Лучше всех среди них изучен рицин, синтезируемый в клещевине: его ген клонирован и установлена нуклеотидная последовательность. Однако высокая токсичность рицина для млекопитающих ограничивает генноинженерные работы с ним только техническими культурами, не используемыми в пищу человека и на корм животным. Токсин, вырабатываемый фитолаккой американской, эффективен против вирусов и безвреден для животных. Механизм его действия заключается в инактивации собственных рибосом при проникновении в клетки различного рода патогенов, в том числе фитовирусов. Пораженные клетки некротизируются, предотвращая размножение патогена и его распространение по растению. В настоящее время проводятся исследования по изучению гена этого белка и передаче его в другие растения.

Вирусные болезни широко распространены среди насекомых, поэтому для борьбы с насекомыми-вредителями можно использовать природные вирусы насекомых, препараты которых называют вирусными пестицидами. В отличие от ядохимикатов они обладают узким спектром действия, не убивают полезных насекомых, они быстро разрушаются во внешней среде и не опасны для растений и животных. Наряду с вирусами насекомых используются как биопестициды некоторые грибы, поражающие насекомых-вредителей. Применяемые сейчас биопестициды являются природными штаммами энтомопатогенных вирусов и грибов, однако не исключена возможность создания в будущем методами генетической инженерии новых эффективных биопестицидов.

Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям. Растения очень часто подвергаются воздействию различных неблагоприятных факторов окружающей среды: высокие и низкие температуры, недостаток влаги, засоление почв и загазованность среды, недостаток или, напротив, избыток некоторых минеральных веществ и т. д. Этих факторов множество, поэтому и способы защиты от них многообразны -- от физиологических свойств до структурных приспособлений, позволяющих преодолевать их пагубное действие.

Устойчивость растений к тому или иному стрессовому фактору является результатом воздействия множества разных генов, поэтому говорить о полной передаче признаков толерантности от одного вида растения другому генноинженерными методами не приходится. Тем не менее у генетической инженерии имеются определенные возможности для повышения устойчивости растений. Это касается работы с отдельными генами, контролирующими метаболические ответы растений на стрессовые условия, например сверхпродукцию пролина в ответ на осмотический шок, на действие засоления, синтез особых белков в ответ на тепловой шок и т. д. Дальнейшее углубленное изучение физиологической, биохимической и генетической основы ответной реакции растения на условия среды, несомненно, позволит применять методы генетической инженерии для конструирования устойчивых растений.

Пока можно отметить лишь косвенный подход для получения морозоустойчивых растений, основанный на генноинженерных манипуляциях с Pseudomonas syringae. Этот микроорганизм, сосуществующий с растениями, способствует их повреждению ранними заморозками Механизм явления связан с тем, что клетки микроорганизма синтезируют особый белок, локализующийся во внешней мембране и являющийся центром кристаллизации льда. Известно, что формирование льда в воде зависит от веществ, могущих служить центрами образования льда. Белок, вызывающий формирование кристаллов льда в различных частях растения (листья, стебли, корни), является одним из главных факторов, ответственных за повреждение тканей растений, чувствительных к ранним заморозкам. Многочисленные эксперименты в строго контролируемых условиях показали, что стерильные растения не повреждались заморозками вплоть до --6--8° С, тогда как у растений, имеющих соответствующую микрофлору, повреждения возникали уже при температурах --1,5--2° С. Мутанты этих бактерий, потерявшие способность синтезировать белок, вызывающий формирование кристаллов льда, не повышали температуру образования льда, и растения с такой микрофлорой были устойчивы к заморозкам. Штамм таких бактерий, распыленный над клубнями картофеля, конкурировал с обычными бактериями, что приводило к повышению морозоустойчивости растений. Возможно, такие бактерии, созданные с помощью методов генной инженерии и используемые в качестве компонента внешней среды, будут служить для борьбы с заморозками.

Повышение эффективности биологической азотфиксации. Хорошо изучен фермент ответственный за восстановление молекулярного азота до аммония. -- нитрогеназа. Структура нитрогеназы одинакова у всех азотфиксирующих организмов. При фиксации азота непременным физиологическим условием является защита нитрогеназы от разрушения под действием кислорода. Лучше всех среди азотфиксаторов изучены ризобии, образующие симбиоз с бобовыми растениями, и свободноживущая бактерия Klebsiella pneumoniae. Установлено, что у этих бактерий за фиксацию азота ответственно 17 генов -- так называемых nif-генов. Все эти гены сцеплены друг с другом и расположены в хромосоме между генами ферментов биосинтеза гистидина и генами, определяющими усвоение шикимовой кислоты. У быстрорастущей ризобии nif-гены существуют в форме мегаплазмиды, содержащей 200--300 тысяч пар нуклеотидов.

Среди генов азотфиксации выявлены гены, контролирующие структуру нитрогеназы, белковый фактор, принимающий участие в транспорте электронов, регуляторные гены. Регуляция генов азотфиксации довольно сложна, поэтому генноинженерный перенос азотфиксирующей функции от бактерий непосредственно высшим растениям в настоящее время уже не обсуждается. Как показали эксперименты, даже в самом простом эукариотическом организме -- дрожжах не удалось добиться экспрессии nif-генов, хотя они и сохранялись в течение 50 генераций.

Эти опыты показали, что диазотрофность (азот-фиксация) свойственна исключительно прокариотическим организмам, и nif-гены не смогли преодолеть барьер, разделяющий прокариоты и эукариоты, из-за слишком сложной своей структуры и регуляции генами, расположенными вне nif-области. Возможно, более удачным окажется перенос nif-генов с помощью Ti-плазмид в хлоропласты, поскольку механизмы экспрессии генов в хлоропластах и в клетках прокариот близки. В любом случае нитрогеназа должна быть защищена от ингибирующего действия кислорода. Кроме того, фиксация атмосферного азота -- очень энергоемкий процесс. Вряд ли растение под влиянием nif-генов может так кардинально изменить свой метаболизм, чтобы создать все эти условия. Хотя не исключено, что в будущем методами генетической инженерии можно будет создать более экономно работающий нитрогеназный комплекс.

Более реально использование генноинженерных методов для решения следующих задач: повышение способности ризобии колонизировать бобовые растения, повышение эффективности фиксации и ассимиляции азота путем воздействия на генетический механизм, создание новых азотфиксирующих микроорганизмов путем введения в них nif-генов, передача способности к симбиозу от бобовых растений к другим.

Первостепенной задачей генетической инженерии для повышения эффективности биологической фиксации азота является создание штаммов ризобии с усиленной азотфиксацией и колонизирующей способностью. Колонизация бобовых растений ризобиями протекает очень медленно, лишь единичные из них дают начало клубенькам. Это происходит потому, что местом инвазии ризобии является только одна небольшая область между точкой роста корня и ближайшим к ней корневым волоском, находящимся на стадии формирования. Все остальные части корня и развившиеся корневые волоски растения нечувствительны к колонизации. В ряде случаев сформировавшиеся клубеньки оказываются неспособными фиксировать азот, что зависит от многих растительных генов (выявлено не менее пяти), в частности от неблагоприятного сочетания двух рецессивных генов.

Традиционными методами генетики и селекции удалось получить лабораторные штаммы ризобий с более высокой колонизирующей способностью. Но они в полевых условиях испытывают конкуренцию со стороны местных штаммов. Повышение их конкурентоспособности, видимо, можно осуществить генноинженерными методами. Повышение эффективности процесса азотфиксации возможно применением генноинженерных приемов, основанных на увеличении копий гена, усилении транскрипции тех генов, продукты которых образуют «узкое» место в каскадном механизме азотфиксации, путем введения более сильных промоторов и т. п. Важно повышение коэффициента полезного действия самой нитрогеназной системы, осуществляющей непосредственное восстановление молекулярного азота в аммиак.

Повышение эффективности фотосинтеза. С4-растения характеризуются высокими темпами роста и скоростью фотосинтеза, у них практически отсутствует видимое фотодыхание. У большинства сельскохозяйственных культур, относящихся к С3-растениям, высокая интенсивность фотодыхания. Фотосинтез и фотодыхание -- тесно связанные процессы, в основе которых лежит бифункциональная активность одного и того же ключевого фермента -- рибулозобисфосфат-карбоксилазы (РуБФК). РуБФ-карбоксилаза может присоединять не только С02, но и 02, то есть осуществляет реакции карбоксилирования и оксигенирования. При оксигенировании РуБФ образуется фосфогликолат, который служит основным субстратом фотодыхания -- процесса выброса С02 на свету, в результате чего теряется часть фотосинтетических продуктов. Низкое фотодыхание у С4-растений объясняется не отсутствием ферментов гликолатного пути, а ограничением оксигеназной реакции, а также реассимиляцией С02 фотодыхания.

Одной из задач, стоящих перед генетической инженерией, является исследование возможности создания РуБФК с преобладающей карбоксилазной активностью.

Получение растений с новыми свойствами. В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с "antisense RNA" (перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180°. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется.

Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям.

Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен - это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.

Cтратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений. Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях - для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt т.д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений.

В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему "лишних косточек", например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

Обезоруженную, лишенную онкогенов Ti-плазмиду ученые активно используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерционного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты (явление сайлесинга - замолкания генов). Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу обнаружить и клонировать соответствующий ген. В настоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены клонированы. М.А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу. Не менее интересен и другой аспект работ - получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров - это получение растений петунии с разноцветными цветками. На очереди голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.

Проблемы биобезопасности трансгенных растений

Одним из главных возражений против употребления "трансгенных" продуктов питания является наличие во многих из них генов устойчивости к антибиотику (в частности, к канамицину), которые содержались в исходной конструкции ДНК в качестве селективных.

Предполагается, что эти гены устойчивости могут при переваривании пищи передаваться эндогенной микрофлоре, в том числе патогенной, в результате чего микробы могут приобрести резистентность к данному антибиотику. Однако в реальности вероятность такого события ничтожно мала - многочисленные эксперименты и наблюдения в природе относительно подобного горизонтального переноса генов до сих пор давали только отрицательные результаты.

Что касается возможной токсичности или аллергенности трансгенных растений, то здесь применяют те же жесткие стандарты, как и для полученных традиционным путем новых сортов культурных растений или новых видов продуктов питания. Никаких особых отличий трансгенных растений от обычных по этим параметрам ожидать не приходится (разве что в лучшую сторону при блокировании синтеза токсинов или аллергенов), да и действительно, как правило, не наблюдается на практике.

Проблема возможного ущерба для окружающей среды имеет несколько аспектов. Во-первых, существует опасение, что устойчивые к гербицидам культурные растения могут при межвидовом опылении передавать эти гены близкородственным сорнякам, которые могут превратиться в неистребимые суперсорняки (superweeds). Хотя вероятность такого нежелательного развития событий для большинства сельскохозяйственных культур очень мала, генные инженеры и ученые-аграрии активно разрабатывают подходы для исключения подобной опасности. Здесь, правда, надо отметить, что данный вопрос также не нов, так как в практике сельского хозяйства уже давно используется ряд устойчивых к гербицидам сортов, полученных путем обычной селекции. При этом никакой экологической катастрофы широкое использование таких устойчивых сортов до сих пор не вызвало.

Тем не менее, и в этом случае, чтобы отвести любые возражения от трансгенных растений, пробуют, например, вводить в растения не один, а сразу несколько генов устойчивости к разным гербицидам. Передача нескольких генов сорнякам гораздо менее вероятна, чем одного гена. Кроме того, мультигербицидная устойчивость позволит чередовать разные гербициды при обработке посевов, что не даст возможности для распространения какого-либо определенного гена устойчивости в сорняках.

Предлагается также вводить гены устойчивости не в ядерный, а в хлоропластный геном. Это может предотвратить нежелательный дрейф генов с помощью пыльцы, так как хлоропласты наследуются только по материнской линии.

Еще один генно-инженерный путь борьбы с сорняками без использования генов резистентности к гербицидам вообще - биотрансгенный. Речь идет об использовании мелких животных, например, кроликов, для поедания сорняков на полях. При этом, чтобы оградить от поедания культурные растения, в них можно ввести какой-либо ген, делающий их непривлекательными (запах, вкус) для данного животного. Такой биотрансгенный подход сразу снял бы большинство выдвигаемых сейчас возражений против трансгенных культур.

Близкие по сути экологические возражения касаются трансгенных растений со встроенными "инсектицидными" генами, способных, как считают, спровоцировать у насекомых-вредителей возникновение массовой резистентности. Здесь также предложены действенные способы для уменьшения этой опасности, например, использование генов нескольких разных токсинов и/или индуцибельных промоторов, быстро активирующихся при нападении насекомых на растение. Данная проблема в общем не нова, так как многие из инсектицидов, используемых сейчас на "генном уровне", давно применяют в виде чистого вещества для опрыскивания посевов.

Еще одно нежелательное следствие использования трансгенных растений с генами инсектицидов заключается в том, что пыльца этих растений может быть токсичной и для полезных насекомых, которые данной пыльцой питаются. Некоторые экспериментальные данные говорят о том. что такая опасность действительно существует, хотя о ее возможных масштабах говорить пока трудно. Однако и здесь уже предложены и испытаны адекватные генно-инженерные решения, например, использование трансгеноза через хлоропластную ДНК, или промоторов, не работающих в пыльце.

Введение генов в клетки млекопитающих

Манипуляции с клетками млекопитающих можно разделить на 2 большие группы: эксперименты с соматическим клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат - получение трансгенных организмом.

Генетическая транформация соматических клеток млекопитающих. Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют для получения различных веществ. Хотя культуры клеток животных, особенно при массовом выращивании, гораздо менее экономичны, чем бактериальные дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом - способностью осуществлять мелкие, но весьма важные модификации белков - продуктов гена млекопитающих. Например, для эффективного функционирования ряда белков необходимо присоединение к ним цепочек из молекул углеводов или липидов. Образование и присоединение таких цепочек - обычный процесс для клеток млекопитающих, тогда как бактериальная клетка не способна производить подобные модификации.

Помимо создания клеток-продуцентов, трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, а при необходимости и человека, что имеет огромное значение для медицинской генетики.

Культуры клеток млекопитающих могут оказаться эффективным источником выделения некоторых вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. Получение таких вакцинных культур клеток осуществимо при помощи техники рекомбинантных ДНК и эффективных векторов экспрессии для клеток млекопитающих и человека. При использовании ДНК-вакцин в организм вводится не антиген, а ген, кодирующий синтез этого антигена. Ген встраивается в плазмиду, а плазмида вводится организм путем обыкновенной инъекции.

ДНК-вакцины имеют хорошие перспективы в животноводстве. Достоинством таких вакцин является очень маленький объем - для иммунизации одной мыши достаточно 10-50 мкг плазмиды, одной коровы - 200-300 мкг. Плазмида сохраняется в организме до 1 года. В стадии клинических испытаний в настоящее время находятся ДНК-вакцины против микоплазм, возбудителя туберкулеза, сальмонеллеза, лейшманиоза.

Развитие злокачественной опухоли в организме обычно подавляет иммунитет. Проблема в том, чтобы подхлестнуть иммунную систему в целом и направить ее действие против раковых клеток. Исследователи из Медицинской школы в Энн-Арборе (Мичиган) придумали метод борьбы с раком. В опухолевые клетки толстой кишки подопытных мышей ввели гены, кодирующие белки другой линии мышей. Это можно осуществить с помощью липосом или вируса. После появления на внешней стороне клеточной мембраны этих белков иммунная система атаковала такие клетки. 20% больных мышей выздоровели, у 70% опухоль уменьшилась, в контрольной группе все умерли. Лимфоциты боролись не только с «меченными» клетками опухоли, но и клетками метастаз, следовательно, иммунная система «проснулась». В настоящее время ведутся эксперименты на людях с раком кожи.

Генотерапия

Лечение заболеваний с помощью генов получило название генотерапии. Сейчас в мире насчитывается порядка 400 проектов, посвященных лечению с помощью генотеропии.

Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии являются важнейшей предпосылкой для разрешения клинических испытаний.

Существует два типа генотерапии: заместительная и корректирующая. Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК. При корректирующей терапии предполагается замена дефектного гена нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка.

В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту.

Примером может служить лечение комбинированного иммунодефииицита. Комбинированный иммунодефицит может быть результатом дефекта гена аденозиндезаминазы. Впервые попытка лечения такого больного методами генотерапии была предпринята в США в 1990 г. У больного ребенка извлекли Т-лимфоциты, трансформировали ретровирусным вектором, введя нормальный ген аденозиндезаминазы и вернули клетки в организм. Введение приходится повторять. Более эффективна аналогичная трансформация стволовых клеток костного мозга.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. В настоящее время не существует общедоступного метода культивирования клеток легких, поэтому при легочных заболеваниях единственный способ доставить чужеродный ген - это ввести его прямо в организм. Муковисцидоз - весьма распространенное среди людей белой расы тяжелое наследственное заболевание легких, которое поражает, например, в семьях из Центральной Европы одного новорожденного из 2500 и для которого установлен дефектный ген, кодирующий белок-регулятор трансмембранной проводимости. Основное проявление дефектного гена - пневмония. Поражаются все эпителиальные клетки. Основная проблема - как доставить ген в клетки, покрытые слизью, которая препятствует трансформации. Неповрежденную копию "гена заболевания", включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в форме аэрозоля в дыхательные пути больного.

Для коррекции нарушения при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна (заболевании мальчиков, связанном с дефектами Х-хромосомы) нормальный ген, кодирующий белок дистрофии, пытались прямо вкалывать в мышечные волокна, используя либо "голую" ДНК, либо аденовирусный вектор. Другие исследователи трансплантировали больному миобласты после генетической коррекции. Ранее неподвижный ребенок приобретал способность двигаться! К сожалению, во всех этих опытах удается получить только временный терапевтический эффект, и процедура введения гена должна неоднократно повторяться.

Список наследственных заболеваний, которые пытаются или планируют лечить генами, велик. Это и ревматоидный артрит, и фенилкетонурия, и заболевания, связанные с недостатком гормонов (инсулина, эритропоэтина, гормона роста). В случае хронической анемии, связанной с дефицитом эритропоэтина, на основании опытов на животных предлагается принципиально новый подход к лечению. Так как каждая из наших клеток содержит один и тот же геном, можно заставить фибробласты кожи, которые в норме не производят эритропоэтина, синтезировать этот гормон. Для этого нужно ввести в геном новую контролирующую область и тем самым снять запрет со считывания (экспрессии) гена эритропоэтина, присутствующего, но "молчащего" в фибробластах.

Практически в любой области медицины либо начаты клинические испытания лечения наследственных заболеваний с помощью генотерапии, либо в опытах на животных разрабатываются подходы к такому лечению. По мере усовершенствования методов доставки генов и контроля их экспрессии список заболеваний, к которым можно применять генотерапию, будет безусловно расширяться.

Генотерапия применима не только к наследственным заболеваниям. Предстоит решить проблему лечения генами "чумы XX века" -- синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), возникающего при заражении вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ представляет собой ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса. Предложено множество хитроумных способов борьбы со СПИДом с помощью привнесенных генов. Все они основаны на новейших данных о строении и функционировании генома ретровируса. Например, вводя прямо в мышцы больного ретровирусные векторы, несущие отдельные гены ВИЧ, ученые рассчитывали на то, что гены ВИЧ после внедрения в ДНК хромосом хозяина смогут дать информацию для синтеза вирусных белков и произойдет "противоСПИДная" иммунизация больного этими белками. Однако еще не получено ощутимых результатов, которые сулили бы успех в борьбе с вирусом дикого типа, коварство которого заключается в его изменчивости.

Огромные перспективы открывает использование генотерапии для лечения онкологических заболеваний. Многолетние усилия ученых привели к пониманию того, что рак -- это генетическое заболевание и его развитие происходит многостадийно, в результате серии генетических нарушений, накапливающихся в клетке. Следовательно, каждый из таких отдельных генетических эффектов может стать точкой приложения генотерапевтического подхода.