Влияние алкогольной интоксикации на активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

В проэструсе этанол в дозе 1 г/кг не вызывал изменений в активности ФМСФ-КП в гипофизе и яичниках.

Таблица 6. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в диэструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В гипоталамусе и стриатуме через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента была на 24% и 36% выше, если доза этанола составляла 4 г/кг, то активность фермента была на 52% и 61% соответственно выше по сравнению с контрольной группой животных.

На стадии проэструса в надпочечниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента была на 25%, а через 4 часа на 19% выше, чем в контроле. Повышение активности ФМСФ-КП согласуется с данными об увеличении синтеза и секреции энкефалинов, в-эндорфина, АКТГ, пролактина при острой алкгольной интоксикации [94, 158, 241] и позволяет предположит причастность этого фермента к процессингу регуляторных пептидов.

Этанол в дозе 4 г/кг снижал активность фермента относительно контрольной группы в гипофизе, надпочечниках и яичниках через 0,5 часа в 2,2, 1,9 и 5,5 раз соответственно. В гипоталамусе, стриатуме и яичниках при введении этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа наблюдалась активация ФМСФ-КП на 52%, 61% и 63% соответственно по отношению к контрольной группе.

Таким образом, на стадии проэструса при введении этанола в дозе 1 г/кг наиболее существенные изменения в активности ФМСФ-КП происходили в стриатуме, а при введении этанола в дозе 4 г/кг - в яичниках. Кроме того, этанол в большей дозе вызывал более значимые сдвиги в активности фермента, что согласуется с мембранотропным эффектом этанола, сила которого увеличивается с ростом концентрации алкоголя [10,19, 88].

В проэструсе обнаружено достоверное отличие в действии, которое оказывают разные дозы алкоголя: в гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг ФМСФ-КП активируется сильнее, чем при инъекции этанола в дозе 1 г/кг. Кроме того, в яичниках через 0,5 часа под влиянием этанола в дозе 4 г/кг активность фермента уменьшалась, а при внутрибрюшинной инъекции этанола в дозе 1 г/кг не отличалась от контрольных значений; через 4 часа после воздействия этанола в дозе 4 г/кг наблюдалось увеличение активности фермента, а при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 1 г/кг отличий от контроля зафиксировано не было.

Согласно результатам дисперсионного анализа в проэструсе зависимость активности ФМСФ-КП от времени после воздействия в гипофизе и надпочечниках наблюдается только при введении этанола в дозе 4 г/кг (табл. 7). В гипоталамусе на стадии проэструса активность фермента не зависела от времени. В стриатуме зависимость обнаружена только при введении физиологическго раствора (активность ФМСФ-КП с течением времени уменьшается), тогда как в яичниках активность фермента

Таблица 7. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в проэструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

изменялась с течением времени при введении как физраствора, так и растворов этилового спирта.

На стадии эструса после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП в гипофизе была выше, чем в контрольной группе животных через 0,5 и 4 часа на 61%, а через 18 часов на 133%. Через 0,5 и 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента больше, чем в контроле: в надпочечниках на 47% и 78%, а в яичниках в 5,2 и 5,1 раза соответственно. В гипоталамусе активность ФМСФ-КП возрастает через 4 и 18 часов после инъекции алкоголя в дозе 1 г/кг на 35% и 68% соответственно.

В эструсе введение этанола в дозе 4 г/кг не изменяло активность ФМСФ-КП в гипофизе через 0,5 часа после инъекции, уменьшало активность фермента через 4 часа на 25% и повышало через 18 часов на 124% по отношению к контрольной группе животных. В гипоталамусе под действием той же дозы этанола активность фермента увеличивалась только через 18 часов после оказанного воздействия на 82%. В стриатуме и надпочечниках активность ФМСФ-КП имела U-образную зависимость от времени после введения этанола (доза 4 г на кг): повышение активности через 0,5 часа на 66% и 25% и через 18 часов на 82% и 58% и снижение активности через 4 часа на 46% и 28% соответственно по отношению к контрольным крысам. В яичниках через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП снижалась на 36%, через 4 часа не было достоверных отличий, а через 18 часов - повышение активности в 5,8 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, на стадии эструса при введении этанола наиболее существенные изменения в активности ФМСФ-КП происходили в гипофизе и яичниках.

Обнаружены статистически значимые различия во влиянии различных доз этанола. Так в гипофизе алкоголь в дозе 1 г/кг через 0,5 и 4 часа после инъекции повышал активность ФМСФ-КП, а в дозе 4 г/кг, напротив, понижал по сравнению с контрольной группой животных. В гипоталамусе через 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола меньшая доза вызывала активацию фермента в отличие от большей, под действием которой активность по отношению к контролю не менялась. В стриатуме и надпочечниках две дозы этанола также оказывали разное влияние: при введении этанола в дозе 1 г/кг через 4 часа не было изменений в активности ФМСФ-КП, в то время как его инъекция в дозе 4 г/кг вызывала снижение активности фермента.

Таким образом, в эструсе, также как и на стадии диэструса, введение этанола в меньшей дозе либо не вызывало изменений в активности ФМСФ-КП, либо приводило к ее увеличению, в то время как инъекция большей дозы могла приводить и к снижению активности фермента.

Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции при введении физраствора и различных доз этанола на стадии эструса показал, что в гипофизе и стриатуме зависимость от времени обнаруживалась при инъекции физиологического раствора и этанола в дозе 4 г/кг, однако активность ФМСФ-КП не зависела от времени после введения этанола в дозе 1 г/кг (табл.8).

Таблица 8. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в эструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В гипоталамусе зависимость от времени наблюдалась только при введении этанола в дозе 4 г/кг, а в надпочечниках ее не выявили. В яичниках на стадии эструса при введении физраствора активность возрастала при переходе от 0,5 часа к 4 часам, а к 18 часам снижалась до исходного уровня. При введении этанола в дозе 1 г/кг активность фермента резко возрастала к 0,5 часа, оставалась на высоком уровне вплоть до 4 часов и несколько снижалась к 18 часам, но все же оставалась выше исходной

Следует отметить, что активность ФМСФ-КП при введении растворов этанола сильно изменялась в зависимости от стадии эстрального цикла, таким образом, ответная реакция на острую алкогольную интоксикацию, вероятно, определяется стадией эстрального цикла.

Так в гипофизе, яичниках (доза 1 г на кг) и надпочечниках (доза 4 г на кг) через 0,5 часа после инъекции этанола самая высокая активность ФМСФ-КП была в диэструсе, самая низкая в проэструсе и промежуточной по своему значению в эструсе. В гипофизе через 4 часа, в гипоталамусе через 0,5 часа, а в стриатуме и надпочечниках через оба этих промежутка времени после введения этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП была достоверно выше в диэструсе и эструсе по отношению к проэструсу. Через 18 часов после инъекции этанола в дозе 1г/кг в гипофизе активность фермента на преовуляторной стадии цикла была более высокой, чем после овуляции, а через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП в диэструсе была выше, чем на других стадиях.

В гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП была достоверно выше в эструсе, чем в проэструсе и диэструсе. В том же отделе головного мозга через 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента в эструсе больше, чем в диэструсе. При введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа активность ФМСФ-КП была достоверно выше в эструсе по сравнению с проэструсом. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках после инъекции этанола (доза 4 г/кг) через 18 часов, а в последнем органе и через 4 часа в эструсе фермент был более активен, чем в диэструсе. В надпочечниках через 4 часа и в яичниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг активность фермента в проэструсе и эструсе была ниже по сравненению с диэструсом.

Интересно отметить, что если в норме достоверные изменения активности ФМСФ-КП в зависимости от стадии эстрального цикла были обнаружены только в яичниках, то при введении физраствора или этанола такая зависимость появлялась во всех исследованных органах. Причем, как правило, в диэструсе и эструсе активность фермента была выше, чем в проэструсе. Разнонаправленные изменения активности ФМСФ-КП, наблюдаемые на разных стадиях эстрального цикла, возможно, свидетельствуют о различном уровне алкогольной мотивации крыс на разных этапах полового цикла.

Итак, при введении этанола наиболее значительные изменения в активности ФМСФ-КП были обнаружены в гипофизе и яичниках, тем самым подтверждает тезис о том, что первое место в реестре эндокринопатий при острой алкогольной интоксикации занимает поражение гипофизарно-гонадальной системы.

На стадии диэструса активность фермента зависела от дозы вводимого этанола во всех отделах, кроме надпочечников, в эструсе такая зависимость не обнаруживалась только в яичниках, а в проэструсе была выявлена в гипоталамусе и яичниках. Зависимость активности ФМСФ-КП от времени в гипофизе при введении физраствора обнаруживалась на всех стадиях эстрального цикла, а при введении этанола (доза 4 г на кг) - только в эструсе, в яичниках активность фермента изменялась с течением времени, как при инъекции физраствора, так и этилового спирта. В гипоталамусе зависимость активности ФМСФ-КП от времени выявлена в диэструсе при введении физраствора, и в эструсе при введении этанола в дозе 4 г/кг, в стриатуме активность фермента зависела от времени только в эструсе после инъекции раствора хлорида натрия и этанола (доза 4 г на кг). В надпочечниках подобная зависимость выявлена в диэструсе после инъекции как физраствора, так и этилового спирта и в проэструсе при введении физиологического раствора.

Таким образом, внутрибрюшинное введение этанола приводит к изменению активности ФМСФ-КП, причем характер этих изменений определяется отделом, в котором исследуется активность ФМСФ-КП, стадией эстрального цикла, дозой вводимого этанола и временем, через которое проводится определение активности фермента.

3.1.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самок крыс

В гипофизе, надпочечниках и гонадах активность фермента была ниже чувствительности метода определения, поэтому в случае карбоксипептидазы M исследование проводили только в гипоталамусе и стриатуме. В гипоталамусе и стриатуме не обнаружено зависимости активности КПМ от стадии эстрального цикла (табл. 9). Возможно, что в этих отделах КПМ участвует в регуляции базального уровня биологически активных пептидов в ходе полового цикла, но, вероятно, не влияет на циклические изменения их уровня.

Таблица 9. Активность КПМ на разных стадиях эстрального цикла в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).

б) Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс при внутрибрюшинном введении физиологического раствора

На стадии диэструса введение физиологического раствора не оказывало влияния на активность КПМ в гипоталамусе. Однако в стриатуме через 0,5 часа после инъекции физраствора активность КПМ возрастала на 88%, а через 4 часа снижалась на 45% по сравнению с интактными животными (рис.3).

На стадии проэструса в гипоталамусе через 4 часа и в стриатуме через 0,5 часа после введения изотонического раствора NaCl активность КПМ была ниже на 25% и 49% соответсвенно, чем в норме.

В гипоталамусе на стадии эструса активность фермента через 4 часа после введения физраствора снижалась на 24% по отношению к интактной группе животных. В стриатуме активность КПМ не менялась при введении физиологического раствора.

Таким образом, наиболее существенное влияние ввведение физраствора оказывало на активность КПМ в стриатуме в диэструсе и проэструсе. Через 18 часов после инъекции физиологического раствора активность фермента достоверно не изменялась ни в гипоталамусе, ни в стриатуме.

При изучении зависимости активности КПМ от разных стадий эстрального цикла после введения физиологического раствора обнаружено, что в стриатуме через 0,5 часа после воздействия активность фермента в диэструсе и эструсе была достоверно выше, чем в проэструсе. Через 4 часа в том же отделе головного мозга активность КПМ в диэструсе оказалась ниже при сравнении с проэструсом и эструсом. Через 18 часов после внутрибрюшинной инъекции физраствора активность на стадии эструса была выше, чем в диэструсе. Разнонаправленные изменения активности КПМ на разных стадиях эстрального цикла, возможно, свидетельствуют о том, что устойчивость к стрессу у самок изменяется в ходе полового цикла [45].

В гипоталамусе при введении физиологического раствора активность КПМ не изменялась в зависимости от стадии эстрального цикла.

Таким образом, введение физраствора приводит к появлению зависимости активности фермента от стадии эстрального цикла в стриатуме, но не в гипоталамусе.

в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс

Активность КПМ на стадии диэструса в гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг была на 43% выше, а через 18 часов на 39% ниже по сравнению с контрольной группой животных. В стриатуме при введении этанола в дозе 1 г/кг через 4 часа наблюдалось увеличение активности фермента на 118% по отношению к контрольным крысам (рис.3).

На стадии диэструса введение этанола в дозе 4 г/кг не влияло на активность КПМ в гипоталамусе. В стриатуме через 4 и 18 часов инъекция этанола (доза 4 г на кг) приводила к увеличению активности фермента в 3,4 и 1,4 раза соответственно по сравнению с контролем.

В диэструсе обнаружены достоверные отличия во влиянии различных доз этанола в гипоталамусе и стриатуме. При этом в гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг происходило возрастание активности фермента, а при введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПМ не изменялась относительно контроля. В стриатуме через 0,5 и 4 часа после введения алкоголя в дозе 1 г/кг активность фермента была достоверно ниже, чем при инъекции этанола в дозе 4 г/кг.

Согласно результатам дисперсионного анализа в диэструсе зависимость активности КПМ от времени после воздействия в гипоталамусе обнаружена только при введении этанола в дозе 1 г/кг: активность фермента постепенно снижалась при переходе от 0,5 к 18 часам. В стриатуме только при введении физиологического раствора активность фермента зависела от времени: наблюдалось повышение к 0,5 часам и возвращение к исходному уровню к 4 часам, в интервале 4-18 часов активность КПМ статистически достоверно не изменялась (табл. 10).

В проэструсе в гипоталамусе выявлены отличия в активности КПМ от контрольной группы только при введении этанола в дозе 1 г/кг: через 0,5 часа после оказанного воздействия активность фермента уменьшалась по сравнению с контрольными животными на 53%.

В стриатуме на стадии проэструса через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг наблюдалось снижение активности фермента на 53%, а при введении этанола в дозе 4 г/кг - увеличение через 0,5 часа в 2,8 раза по отношению к контрольной группе животных.

Таблица 10. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ в диэструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

Достоверные различия между двумя дозами этилового спирта выявлены как в гипоталамусе, так и в стриатуме на стадии проэструса. Если введение этанола дозе 4 г/кг не изменяло активность фермента, то его введение дозе 1 г/кг приводило к уменьшению активности КПМ относительно контроля. В стриатуме через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4г/кг происходило повышение активности, а при введении этанола в дозе 1 г/кг изменений активности КПМ не было, через 4 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность фермента достоверно не изменялась, однако при введении этанола в дозе 1 г/кг наблюдалось уменьшение активности по сравнению с контролем.

Дисперсионный анализ не выявил зависимости активности КПМ от времени в стриатуме на стадии проэструса. В гипоталамусе такая зависимость наблюдалась только при введении этанола в дозе 1 г/кг: при переходе к 0,5 часам активность КПМ понижалась, оставаясь на этом уровне вплоть до 4 часов (табл.11).

Таблица 11. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ в проэструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

На стадии эструса в гипоталамусе через 0,5 и 4 часа не выявлено достоверных отличий в активности КПМ от контроля при введении этанола в дозе 1 г/кг. Только через 18 часов обнаруживалось снижение активности фермента на 39% по сравнению с контрольными самками. В гипоталамусе при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПМ достоверно не изменялась.

В стриатуме в эструсе при введении этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг активность фермента через 0,5 часа после инъекции составляла 58% и 39% от контрольных величин; между двумя этими дозами этанола обнаружено статистически достоверное отличие. Через другие промежутки времени инъекция этанола не оказывала влияния на активность КПМ.

Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции показал отсутствие статистически значимой зависимости КПМ на стадии эструса (табл.12).

Активность КПМ при внутрибрюшинном введении зависела от стадии эстрального цикла. Так в гипоталамусе при инъекции этанола в дозе 1 г/кг через 0,5 часа и в стриатуме через 4 часа после воздействия активность КПМ была достоверно выше в эструсе и диэструсе по сравнению с проэструсом. В гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в том же количестве самая

Таблица 12. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ в эструсе (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

высокая активность фермента была в диэструсе, самая низкая - в проэструсе. Через 18 часов после инъекции этанола в дозе 4 г/кг в гипоталамусе и в дозе 1г/кг в стриатуме отмечалась более высокая активность фермента в эструсе по сравнению с диэструсом. В стриатуме через 0,5 часа после введения алкоголя в дозе 1 г/кг активность КПМ на стадии диэструса была выше, чем в проэструсе. При введении этанола в дозе 4 г/кг в стриатуме через 4 часа наблюдалось достоверное повышение активности фермента в диэструсе и эструсе относительно проэструса.

Таким образом, введение этанола вызывает более существенные изменения активности КПМ в стриатуме, чем в гипоталамусе. В обоих исследованных отделах активность фермента зависела от дозы вводимого этанола. Зависимость активности КПМ от времени выявлена в гипоталамусе на стадии диэструса и проэструса (при введении этанола в дозе 1г/кг) и в стриатуме на стадии диэструса (при введении физраствора). Кроме того, в гипоталамусе и стриатуме появляется зависимость активности фермента от стадии эстрального цикла, чего не наблюдалось в норме. Интересно отметить, что, как правило, активность КПМ на стадии диэструса и эструса была достоверно выше, чем в проэструсе.

3.2. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях самцов крыс

3.2.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самцов крыс

а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самцов крыс

Полученные данные о распределении активности КПН в тканях самцов крыс представлены в таблице 13.

Таблица 13. Активность КПН в тканях самцов в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).

Максимальная активность фермента у самцов обнаружена в гипофизе, в гипоталамусе активность была примерно в 2 раза ниже, в стриатуме почти в 3 раза ниже, а в надпочечниках и семенниках в 6 раз и 9 раз соответственно ниже, чем в гипофизе.

При сравнении активности КПН у самцов и самок на разных стадиях эстрального цикла обнаружено, что в норме активность фермента в гипофизе не отличается у самок в стадии диэструса и у самцов, но достоверно выше у самок в проэструсе и эструсе на 168% (р<0,001) и 51% (p<0,01) соответственно по сравнению с самцами.

В активности КПН в гипоталамусе и надпочечниках нет половых отличий. В стриатуме отличия зафиксированы между самками на стадии эструса и самцами, причем у первых активность была выше на 24% (p<0,05), чем у последних.

В яичниках активность КПН на стадии проэструса достоверно выше на 224% (p<0,05) по сравнению с семенниками. Вероятно, что КПН, участвуя в обмене пептидов, вовлекается в формирование половых различий, которые существуют в уровне многих биологически активных пептидов [44, 90].

б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов

В гипофизе активность КПН возрастала после введения физиологического раствора через все исследованные промежутки времени: через 0,5 часа на 113%, через 4 часа на 60% и через 18 часов на 106% по сравнению с интактной группой самцов (рис. 4), что согласуется с представлениями об увеличении синтеза АКТГ в ответ на стресс, которым можно считать инъекцию физраствора.

В гипоталамусе через 4 часа после инъекции физраствора наблюдалось снижение активности КПН на 21%, а в стриатуме через тот же промежуток времени происходило увеличение активности фермента относительно интактной группы животных. Приведенные нами данные о повышении активности КПН после введения физраствора в гипофизе и стриатуме согласуются с полученными ранее [38].

В надпочечниках и семенниках не выявлено влияния внутрибрюшинного введения физиологического раствора на активность КПН.

То есть инъекция физраствора приводит к изменению функционирования пептидэргических систем гипофиза, гипоталамуса и стриатума самцов крыс.

При введении физраствора наблюдаются половые отличия в изменении активности КПН. Так у самок через 0,5 часа после инъекции физиологического раствора на стадии диэструса во всех изучаемых отделах активность фермента не меняется, в проэструсе в гипофизе и надпочечниках, а на стадии эструса в гипофизе и стриатуме уменьшается по сравнению с нормой. У самцов же инъекция физраствора вызывает увеличение активности КПН только в гипофизе по сравнению с нормой, но не в других отделах.

Через 4 часа после введения изотонического раствора NaCl происходит увеличение активности КПН в гипофизе у самцов и самок в стадии диэструса, и уменьшение активности фермента в проэструсе и эструсе по отношению к интактной группе животных. В гипоталамусе у самцов и самок на стадии диэструса инъекция физраствора приводила к снижению активности КПН, в то время как у самок в эструсе и проэструсе активность фермента не отличалась от таковой у интактных животных. Введение физраствора вызывало увеличение активности КПН в стриатуме у самцов, однако у самок активность фермента не изменялась относительно нормы. Через 4 часа после инъекции физиологического раствора активность КПН у самок в диэструсе и проэструсе уменьшалась, но оставалась на прежнем уровне у самцов и самок в эструсе по сравнению с интактной группой крыс. В гонадах внутрибрюшинное введение физраствора не влияло на активность КПН.

Через 18 часов после инъекции физиологического раствора активность фермента у самок не изменилась относительно нормы ни в одном из исследованных отделов, у самцов такие изменения наблюдались только в гипофизе, где происходило увеличение активности КПН.

Таким образом, у особей разного пола при введении физраствора наиболее существенные изменения в активности фермента обнаруживались в гипофизе. Следует отметить, что характер изменений активности КПН в гипофизе и стриатуме был различным: у самцов активность фермента увеличивалась, а у самок в подавляющем большинстве случаев уменьшалась. Кроме того, если у самцов при введении физиологического раствора активность фермента в надпочечниках оставалась на прежнем уровне, то у самок через 0,5 часа в проэструсе и через 4 часа в диэструсе и проэструсе после воздействия активность КПН была ниже нормы. Возможно, это связано с половыми особенностями в ответе организма на стресс, коим, вероятно, для крыс является введение физраствора. Интересно также отметить, что единственным органом, в котором на активность энкефалинконвертазы не влияло введение физраствора у животных обоего пола были гонады.

в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс

В гипофизе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность КПН была выше на 46%, в то же время через 18 часов она была ниже на 23% по сравнению с контролем. При введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа в гипофизе выявлено уменьшение активности КПН в 2 раза по отношению к контрольной группе животных, однако через другие промежутки времени активность фермента не изменялась под влиянием инъекции этанола (рис. 4).

В гипоталамусе через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 1 г/кг активность КПН была на 10% и 25% соответственно выше, чем у контрольных животных. Введение этанола в дозе 4 г/кг приводило к увеличению активности фермента в гипоталамусе через 0,5 и 4 часа на 16% и 14% соответственно и к уменьшению активности через 18 часов на 12% по отношению к контрольным самцам. Повышение активности

КПН в гипофизе и гипоталамусе самцов согласуется с данными об увеличении уровня КРФ, в-эндорфина при острой алкогольной интоксикации [19, 86].

В стриатуме через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность КПН уменьшалась на 20%, а через 18 часов возрастала на 34% относительно контроля. Через 0,5 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг активность КПН была на 20% выше, а через 4 часа на 31% ниже контрольных величин.

В надпочечниках инъекция этанола в дозе 1 г/кг не влияла на активность КПН, однако в дозе 4 г/кг приводила к увеличению активности фермента через 0,5 часа на 48% и к уменьшению через 4 часа на 199% по сравнению с контролем.

В семенниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг активность КПН была ниже, чем у контрольных животных на 37% и 33% соответственно, активность также снижалась через 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг на 30%.

Таким образом, наиболее существенные изменения в активности КПН у самцов при инъекции этанола в дозе 1 г/кг были зафиксированы в гипофизе, а при введении этанола в дозе 4 г/кг - в надпочечниках. Введение этанола (доза 1 г на кг) не оказывало влияния на активность КПН в надпочечниках, через все исследованные промежутки времени.

Обнаружены достоверные отличия во влиянии разных доз этанола на активность КПН. Так в гипофизе через 0,5 часа, в надпочечниках через 4 часа, в яичниках через 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг активность КПН уменьшалась, а после инъекции этилового спирта в дозе 1 г/кг активность фермента достоверно не изменялась относительно контрольных животных. В стриатуме также обнаружены достоверные отличия между двумя дозами этилового спирта: через 0,5 часа после воздействия большая доза этанола сильнее активировала фермент, чем меньшая, через 18 часов наблюдалась обратное влияние двух доз этанола.

При введении физиологического раствора или этилового спирта в любой дозе в гипофизе наблюдалась зависимость активности КПН от времени (табл. 14). При введении физраствора активность фермента увеличивалась через 0,5 часа, несколько снижалась к 4 часам, а к 18 часам возвращалась к уровню, характерному для 0,5 часа. После инъекции этанола в дозе 1 г/кг наблюдалось повышение активности КПН в гипофизе вплоть до 4 часов, а затем снижение к 18 часам. При введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПН через 0,5 часа не отличалась от таковой у интактных самцов, повышалась при переходе к 4 часам, в интервале 4 -18 часов активность КПН статистически достоверно не изменялась.

Таким образом, зависимость активности КПН от времени у самцов была обнаружена в гипофизе, как при введении физраствора, так и при введении этилового спирта и в надпочечниках, но только после инъекции этанола в дозе 4 г/кг.

Интересно отметить, что через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг происходит увеличение активности КПН у самцов в гипоталамусе и снижение активности фермента в семенниках, у самок на стадии диэструса в гипофизе активность фермента также увеличивалась, но не подвергалась изменениям в проэструсе по отношению к контрольной группе животных.

Таблица 14. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПН (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

На стадии проэструса изменение активности энкефалинконвертазы было зафиксировано только в гипофизе, где она уменьшалась относительно контроля. В эструсе активность КПН увеличивалась относительно контроля не только в гипоталамусе, но и в гипофизе, стриатуме и надпочечниках. Активность КПН в гонадах у самок оставалась на прежнем уровне, в отличие от самцов.

Через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность КПН в гипофизе у самцов и самок на стадии эструса возрастала, а в диэструсе и проэструсе снижалась относительно контрольной группы животных. В гипоталамусе у самцов активность КПН уменьшалась, а у самок на стадии диэструса увеличивалась и оставалась неизменной в проэструсе и эструсе по сравнению с контролем. Обнаружены разнонаправленные изменения активности у самок в эструсе и самцов в стриатуме: у первых активность КПН увеличивалась, а у вторых уменьшалась. В надпочечниках и гонадах у самцов и самок на стадии проэструса и эструса активность КПН не изменялась, однако в диэструсе и проэструсе активность КПН увеличивалась по сравнению с контролем.

Через 18 часов после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 1 г /кг происходило увеличение активности КПН в гипофизе у самцов и у самок на стадии эструса, в диэструсе активность фермента оставалась на прежнем уровне по отношению к контрольной группе животных. В стриатуме у самцов активность КПН повышалась после введения этанола, но оставалась на прежнем уровне у самок относительно контроля. На стадии эструса у самок возрастала активность КПН в надпочечниках, однако не подвергалась изменениям у самцов и самок на стадии диэструса. Введение этанола не вызывало изменений активности феремента у животных разного пола в гипоталамусе и гонадах.

Этиловый спирт через 0,5 часа после внутрибрюшинного введения в дозе 4 г/кг приводит к изменению активности КПН у самцов во всех изученных отделах, однако у самок в эструсе такие изменения отсутствовали. В гипоталамусе у самцов и самок на стадии диэструса активность фермента увеличивалась, а на стадии проэструса и эструса оставалась на прежнем уровне по отношению к контролю. В стриатуме через 0,5 часа после инъекции у самцов активность КПН возрастала, но оставалась неизменной у самок. В надпочечниках у самцов и самок на стадии проэструса активность КПН увеличивается. В яичниках на стадии проэструса активность КПН возрастала после инъекции этанола (доза 4 г на кг), но снижалась в семенниках относительно контрольных значений.

У самцов и самок на стадии диэструса и эструса в гипофизе через 4 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг отсутствовали изменения в активности КПН, но они имелись у самок в диэструсе, где активность фермента уменьшалась по сравнению с контролем. В гипоталамусе у самцов, а также у самок в диэструсе активность КПН увеличивалась, однако в эструсе обнаруживалось уменьшение, а в проэструсе изменения в активности фермента отсутствовали по сравнению с контрольной группой животных. В стриатуме на стадии диэструса и проэструса достоверных изменений активности КПН не обнаружено через 4 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг, но у самцов и самок в эструсе активность фермента снижалась по отношению контрольным значениям. У самцов под влиянием инъекции этилового спирта отмечалось уменьшение активности КПН в надпочечниках, однако у самок не было обнаружено изменений в активности фермента относительно контроля. В гонадах введение этанола в дозе 4 г/кг не оказывало воздействия на активность КПН.

Через 18 часов после воздействия этанола (доза 4 г на кг) происходило увеличение активности КПН в гипофизе у самок в диэструсе по сравнению с контрольной группой животных, но у самцов и самок в эструсе активность фермента не подвергалась изменениям. В гипоталамусе наблюдалось снижение активности КПН у самцов и самок на стадии диэструса, а в эструсе уровень активности фермента оставался прежним по сравнению с контрольными крысами. Через 18 часов после инъекции этилового спирта в дозе 4 г/кг активность КПН в стриатуме и надпочечниках не изменялась относительно контроля у особей разного пола. В половых железах отмечаются разнонаправленные изменения в активности фермента: у самок в эструсе - увеличение, а у самцов - снижение по отношению к контрольной группе животных.

Таким образом, активность КПН у особей разного пола изменяется под влиянием инъекции этанола. Однако за счет того, что у особей женского пола многие биохимические показатели, физиологическое состояние, а, следовательно, и активность ферментов в норме и при различных патологических состояниях зависит во многом от стадии эстрального цикла, в которой пребывает животное [45, 193, 247], активность КПН при введении этанола изменяется в зависимости от стадии эстрального цикла. При этом, в одном и том же отделе, но на разных этапах полового цикла активность фермента при инъекции этилового спирта может претерпевать прямопротивоположные изменения, которые могут как совпадать с теми изменениями, которые наблюдаются у самцов, так и не совпадать. Следует также отметить, что при введении этанола у самок наблюдались более существенные изменения активности КПН, чем у самцов при введении этилового спирта, что согласуется с данными о том, что при данном воздействии у самок наблюдается более существенное изменение уровня гонадотропных гормонов, АКТГ и кортикостероидов [217].

3.2.2. Изучение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях самцов крыс

а) Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях интактных самцов крыс

Полученные данные о распределении активности ФМСФ-КП в тканях самцов крыс представлены в таблице 15.

Максимальная активность фермента у самцов обнаружена в надпочечниках, в гипофизе активность была в 3,2 раза ниже, в гипоталамусе и стриатуме примерно в 6 раз ниже, а в семенниках в 10 раз ниже, чем в гипофизе. Приведенные нами данные о распределении активности ФМСФ-КП в тканях самцов хорошо согласуются с полученными ранее другими исследователями [35, 91].

Стоит отметить, что активность ФМСФ-КП в гипофизе и половых железах у самцов достоверно меньше, чем у самок на любой из стадий эстрального цикла.

Таблица 15. Активность ФМСФ-КП в тканях самцов в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).

В надпочечниках у самцов активность фермента достоверно выше на 42% (p<0,05), чем у самок в стадии диэструса. В гипоталамусе и стриатуме половых отличий в активности ФМСФ-КП не обнаружено. Таким образом, вероятно, данный фермент вовлекается в детерминацию различий в уровне регуляторных пептидов у самок и самцов [90].

б) Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов

Через 0,5 часа после инъекции физраствора в гипофизе не наблюдалось изменений в активности фермента, однако через 4 и 18 часов активность ФМСФ-КП возрастала на 56% и 40% соответственно относительно интактной группы животных. В гипоталамусе увеличение активности ФМСФ-КП обнаруживалось только через 0,5 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора на 23% по сравнению с нормой. В стриатуме, надпочечниках и яичниках введение физраствора не влияло на активность ФМСФ-КП (рис. 4).

Через 0,5 часа после введения физраствора активность ФМСФ-КП у самцов подвергалась изменениям только в гипоталамусе, где активность фермента увеличивалась относительно интактной группы животных. У самок же ни на одной из стадий эстрального цикла активность фермента не изменялась в этом отделе. На стадии диэструса введение физиологического раствора приводило к возрастанию активности ФМСФ-КП в стриатуме, надпочечниках и яичниках, на стадии проэструса - к уменьшению активности в стриатуме и к ее увеличению в яичниках по отношению к норме. На стадии эструса активность ФМСФ-КП через 0,5 часа после введения физраствора изменялась только в гипофизе, где она снижалась по сравнению с интактной группой животных.

Через 4 часа после инъекции физиологического раствора наблюдалось увеличение активности ФМСФ-КП у самцов только в гипофизе относительно нормы, в других отделах активность фермента не изменялась. У самок в гипофизе на стадии диэструса активность ФМСФ-КП, напротив, уменьшалась, а в проэструсе и эструсе не изменялась по сравнению с интактной группой крыс. В стриатуме на стадии проэструса активность фермента снижалась по отношению к норме. В яичниках на всех стадиях эстрального цикла активность ФМСФ-КП достоверно увеличивалась относительно нормы.

Через 18 часов после введения изотонического раствора NaCl у самцов, как и через 4 часа после воздействия, активность ФМСФ-КП в гипофизе была выше, чем в норме. У самок в эструсе активность фермента после введения физраствора в этом отделе, напротив, была выше, чем у интактной группы животных. Снижение активности ФМСФ-КП у самок на стадии эструса отмечалось также в гипоталамусе, стриатуме и яичниках по сравнению с нормой. В то время как в диэструсе в надпочечниках и яичниках активность ФМСФ-КП возрастала по отношению к интактной группе самок.

Таким образом, введение физраствора приводило к более существенному изменению активности фермента у самок, чем у самцов, причем, у самок эти изменения затрагивали не только гипофиз и гипоталамус, но и другие исследуемые отделы. Кроме того, характер изменения активности ФМСФ-КП был разным у самцов и самок.

в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс

Инъекция этанола в дозе 1 г/кг изменяла активность ФМСФ-КП в гипофизе только через 18 часов после воздействия: она уменьшалась на 25% относительно контроля. Введение этанола в дозе 4 г/кг не влияло на активность фермента в гипофизе (рис. 5).

В гипоталамусе после введения этанола в дозе 1 г/кг через 4 и 18 часов активность фермента была выше, чем у контрольной группы животных на 28% и 10% соответственно, при введении этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа активность ФМСФ-КП также была выше, чем в контроле на 41%.

В стриатуме инъекция этанола не вызывала изменений в активности фермента. В надпочечниках активность ФМСФ-КП увеличивалась через 4 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг и через 4 и 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг на 20%, 45% и 18% соответственно по сравнению с контрольной группой самцов. В семенниках активность ФМСФ-КП достоверно возрастала только через 18 часов после инъекции этанола (доза 4 г на кг) в 2,7 раза по отношению к контролю. Такое отсроченное во времени изменение активности ФМСФ-КП, по сравнению с КПН, возможно, указывает на участие этих двух ферментов в биосинтезе различных нейропептидов.

Интересно отметить, что в гипофизе и стриатуме активность ФМСФ-КП через 4 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг была достоверно выше, чем если этиловый спирт вводился в дозе 1 г/кг. В семенниках, напротив, через 0,5 часа после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента больше была, чем в том случае, если этанол вводился в дозе 4 г/кг. В надпочечниках также отмечено достоверное отличие во влиянии двух доз: через 18 часов после инъекции этанол в меньшей дозе не вызывал изменений в активности ФМСФ-КП, однако в большей дозе приводил к увеличению активности фермента относительно контроля.

Таким образом, наиболее существенные изменения в активности фермента наблюдались при введении этанола (доза 4 г на кг) в семенниках. Через 0,5 часа после инъекции этанола в любой из двух доз активность фермента оставалась на прежнем уровне во всех исследованных отделах. Через другие промежутки времени в тех отделах, где этанол вызывал изменения в активности ФМСФ-КП, характер этих изменений, в подавляющем большинстве случаев заключался в увеличении активности фермента.

Активность ФМСФ-КП зависела от времени после воздействия в гипофизе: она увеличивалась к 0,5 часа и продолжала нарастать вплоть до 4 часов после введения физраствора, затем к 18 часам активность фермента снижалась до уровня 0,5 часа, после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП возрастала к 0,5 часа, затем несколько снижалась, но оставалась на уровне более высоком, чем у интактных самцов, в интервале от 4 до 18 часов, после введения этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП имела тенденцию к росту в первые четыре часа, в промежутке 4-18 часов активность фермента не изменялась (табл. 16).

В гипоталамусе активность ФМСФ-КП зависела от времени после введения физраствора и этилового спирта в дозе 4 г/кг, однако при введении этанола в дозе 1 г/кг динамики в изменении активности фермента во времени не было обнаружено. После введения физраствора активность ФМСФ-КП возрастала к 0,5 часа, снижалась до исходного уровня к 4 часам и вновь немного увеличивалась к 18 часам. При инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность фермента имела тенденцию к увеличению в первые четыре часа, а к 18 часам она несколько снижалась.

В стриатуме зависимость активности фермента от времени наблюдалась только при введении этанола в дозе 4 г/кг. Причем характер этих изменений был идентичен тем, которые происходили в гипоталамусе при введении той же дозы этанола.

Таблица 16. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП (значения отношения Фишера F_Ф и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).

В семенниках достоверное влияние времени на активность ФМСФ-КП также обнаружено только после введении этанола в дозе 4 г/кг. При этом через 0,5 часа активность фермента снижалась ниже уровня, характерного для интактных крыс, затем активность увеличивалась и к 18 часам была выше, чем в норме.

Таким образом, при введении этилового спирта активность ФМСФ-КП зависела от времени в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме и семенниках (в последних трех случаях только при инъекции этанола в большей дозе). У самцов, в отличие от самок, в надпочечниках активность фермента при введении этанола не зависела от времени.

Через 0,5 часа после воздействия этанол в дозе 1 г/кг не вызывал изменений в активности ФМСФ-КП у самцов, но приводил к увеличению активности фермента в гипофизе и половых железах у самок на стадии диэструса, в эструсе активность увеличивалась не только в вышеназванных отделах, но и в надпочечниках относительно контроля. На стадии проэструса наблюдалось увеличение активности ФМСФ-КП в стриатуме и уменьшение активности фермента в надпочечниках.

Через 4 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг на стадии диэструса у самок во всех изученных отделах активность ФМСФ-КП возрастала по сравнению с контрольной группой животных, на стадии эструса активность фермента увеличивалась только в гипофизе, а в проэструсе - в гипоталамусе и стриатуме. В то время как у самцов изменения наблюдались только в двух отделах: в гипоталамусе и надпочечниках, где активность фермента возрастала относительно контроля.

Через 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг у самок в диэструсе не наблюдалось изменений в активности фермента, а в эструсе во всех исследованных отделах происходило увеличение активности фермента по сравнению с контрольной группой животных. У самцов в гипофизе в отличие от самок активность ФМСФ-КП уменьшалась, а в гипоталамусе активность фермента, так же как и у самок на стадии эструса, возрастала по отношению к контролю.

При введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа после его введения у самцов не было выявлено изменений в активности ФМСФ-КП. У самок же на стадии диэструса в яичниках активность фермента увеличивалась, в проэструсе - уменьшалась в гипофизе, надпочечниках и яичниках, на стадии эструса в яичниках также наблюдалось снижение активности фермента, однако в надпочечниках и стриатуме активность ФМСФ-КП возрастала по отношению к контрольной группе животных.

Через 4 часа после инъекции этанола (доза 4 г на кг) у самцов активность ФМСФ-КП не подвергалась изменениям в гипофизе и половых железах. У самок на стадии диэструса в гипофизе активность фермента увеличивалась, уменьшалась в эструсе и только в проэструсе оставалась на прежнем уровне относительно контрольных значений. В яичниках активность ФМСФ-КП на стадии эструса, как и в семенниках, не подвергалась изменениям, но увеличивалась в диэструсе и эструсе относительно контроля. Однонаправленные изменения в активности ФМСФ-КП обнаружены через 4 часа после введения этилового спирта в дозе 4 г/кг в гипоталамусе у самцов и самок в диэструсе и проэструсе по отношению к контрольной группе крыс. В стриатуме у самцов и самок на стадии проэструса активность фермента также возрастала, однако у самок в стадии эструса она уменьшалась по сравнению с контролем. На стадии диэструса и проэструса инъекция этанола не вызывала у самок изменений в активности ФМСФ-КП, но приводила к уменьшению активности фермента в эструсе, а у самцов вызывала увеличение активности ФМСФ-КП относительно контрольной группы животных.

Через 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг у самок на стадии диэструса активность фермента уменьшалась в гипофизе и гипоталамусе, а на стадии эструса, наоборот, наблюдалось увеличение активности фермента во всех изученных отделах по сравнению с контролем. У самцов только в надпочечниках и семенниках активность ФМСФ-КП возрастала и не изменялась в других исследованных отделах относительно контрольной группы животных.

Таким образом, этанол вызывал изменения в активности ФМСФ-КП у крыс обоего пола, однако более существенно активность фермента менялась у самок по сравнению с самцами. Характер изменений в активности фермента у самцов и самок мог быть как одно-, так и разнонаправленным и зависел от времени, через которое проводилось исследование, дозы этанола, стадии полового цикла и отдела, в котором определялась активность ФМСФ-КП.

3.2.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самцов крыс

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самцов крыс