Природа лучевого поражения клеток

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

ПРИРОДА ЛУЧЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ КЛЕТОК

радиация клетка организм ядро облучение

Сильные дозы радиации убивают клетки живого организма. Малые дозы не разрушают клетку полностью, но существенно изменяют ее. Выделяют два вида радиационной гибели клеток: интерфазная (до вступления клеток в митоз) и митотическая. В первом случае предполагают, что смерть наступает в результате окисления липидов клетки и образования радиотоксинов, которые вызывают иммунные реакции, склеивание клеток и их разрушение, а также торможение клеточного деления и повреждения хромосомного аппарата. Во втором случае наступает либо гибель потомков мутантных клеток вследствие их нежизнеспособности, либо невозможности расхождения хромосом в анафазу вследствие изменений структуры ДНК клеток. Какое поколение потомков таких клеток погибнет, зависит от значимости потерянного генетического материала.

Первичное радиационное повреждение клеточных структур может осуществляться двумя способами:

1. Путем непосредственной передачи энергии у-квантами и нейтронами биологически активным молекулам-мишеням (прямое действие). При этом лучевое повреждение необязательно должно реализоваться в месте поглощения энергий, так как возможна передача поглощенной энергии как внутри молекул, так и от одной молекулы к другой. Поэтому поражение молекулы-мишени может произойти в результате миграции энергии на некоторое расстояние от места ее поглощения. Прямое действие лучей заключается в расщеплении ими молекул белка и повреждении ДНК в ядрах клеток при «пулеобразном» попадании в эти объекты живого организма. Причем, вероятность попадания лучей в ядро клетки прямо зависит от размера ионизирующей частицы.

2. Путем взаимодействия биологически активных молекул с промежуточными продуктами, образующимися под действием ионизирующих излучений. Это косвенное влияние излучения на организм и проявляется оно в виде ионизации молекул воды, а также молекул кислорода, содержащегося в клетках. Образовавшиеся ионы Н⁺, ОН и ион-радикал 0₂ окисляют молекулы белка и разрушают его.

При анализе причин радиационного поражения клетки следует, прежде всего, рассмотреть вопрос об относительной радиочувствительности двух основных ее компонентов -- ядра и цитоплазмы.

Результаты абсолютного большинства многочисленных исследований дали весьма убедительные доказательства о несравненно большей радиочувствительности ядра и решающей роли его поражения в исходе облучения клетки.

Наиболее существенные повреждения клетки возникают именно в ядре, основной молекулой которого является ДНК. Ядро у млекопитающих проходит четыре фазы деления; из них наиболее чувствителен к облучению митоз, точнее его первая стадия -- поздняя профаза. Клетки, которые в момент облучения оказываются в этой стадии, не могут вступить в митоз, что проявляется первичным снижением митотической активности спустя 2 ч после облучения. Клетки, облученные в более поздних стадиях митоза, или завершают цикл деления без каких-либо нарушений, или в результате инверсии обменных процессов возвращаются в профазу. Нарушения ДНК могут вести к атипическому течению клеточного деления и появлению хромосомных аберраций. Неделящиеся клетки пребывают в длительной интерфазе, оставаясь по большей части вне влияния тех доз излучения, которые вызывают репродуктивный отказ делящихся клеток.

Более точные экспериментальные доказательства определяющей роли ядра в клеточной радиочувствительности наглядно представлены в исследованиях Б. Л. Астаурова, использовавшего для этой цели феномен андрогенеза (мужского партеногенеза) -- возможности развития организма из мужской зародышевой клетки без процесса оплодотворения.

Б. Л. Астауровым было продемонстрировано получение потомства тутового шелкопряда, состоящего только из самцов, по всем признакам повторяющих отца, путем предварительного облучения готовой к оплодотворению и кладке яиц самки бабочки при дозе 500 Гр (доза, смертельная для самки и ядерного аппарата еще не отложенных яиц). Однако гибель такой обреченной бабочки происходит не сразу, и она могла копулировать с необлученным самцом и отложить яйца. Отложенные после копуляции яйца подвергали тепловому воздействию для побуждения партеногенетического развития. Из таких яиц выходили гусеницы, маркированные только признаками отца, а после окукливания вылуплялись только самцы, которые повторяли признаки отца.

Причина получения такого андрогенетического потомства состоит в следующем: у тутового шелкопряда в каждую яйцеклетку проникает несколько сперматозоидов, но с женским пронуклеусом сливается ядро лишь одного из них. Так как женский пронуклеус в яйцеклетке был разрушен в результате облучения, то его место заняло ядро одного из проникших в такое облученное ядро сперматозоидов, а ядро сперматозоида приняло на себя роль второго ядерного оплодотворяющего комплекса, что привело к образованию нормального диплоидного ядра, у которого, однако, оба набора хромосом получены от отца. Огромный по сравнению с ядром объем материнской плазмы, также подвергшийся облучению, никак не сказался на жизнеспособности потомства.

Прямые доказательства большей радиочувствительности ядра по сравнению с цитоплазмой были получены позже и другими исследователями в опытах с прицельным облучением ядра на объектах, в клетках которых оно строго фиксировано. Оказалось, например, что попадание лишь одной а-частицы в ядро оплодотворенного яйца наездника вызывает гибель зародыша, которая в случае облучения цитоплазмы яйца регистрируется после прохождения 15 млн. частиц.

Особый интерес представляют также эксперименты, в которых с помощью микропучка протонов (90% частиц находилось в поле диаметром 5 мкм) было показано, что структурные повреждения хромосом в клетках наступают уже после непосредственного их облучения 15--20 протонами, в то время как при облучении различных участков цитоплазмы сотнями тысяч частиц его влияния не обнаружено.

И. Орд и К. Даниелли в опытах на амебах с помощью микрохирургического метода показали, что пересадка ядер от особей, облученных при дозе 150 Гр, при которой выживает 5% клеток, вызывала примерно такой же летальный эффект (выживало 4% реципиентов). Если же облучению подвергали цитоплазму даже в дозе 250 Гр, после чего в нее трансплантировали необлученное ядро, то эффекта вообще не наблюдалось; все 100% амеб делились и давали жизнеспособное потомство.

(По Тихомирову: В опытах на амебах, яйцах земноводных и на водорослях получено обратное соотношение: например, при трансплантации облученного ядра амебы в необлученную протоплазму было обнаружено восстанавливающее действие цитоплазмы на ядро, а вливание небольшого количества облученной цитоплазмы в клетку вызывало появление типичных признаков радиационного поражения ядра, в том числе разрывы и фрагментацию хромосом.

Такие противоречивые, результаты свидетельствуют о том, что при облучении различных организмов взаимодействие между ядром и цитоплазмой в клетках осуществляется по-разному и радиочувствительность клетки определяется не только чисто механическим повреждением хромосом при попадании одной или нескольких ионизирующих частиц, как это трактуется теорией мишени, но и нарушениями биохимических процессов).

Баком и Александером в США и А. М. Кузиным и его сотрудниками в нашей стране была выдвинута гипотеза, объясняющая лучевое повреждение биологических систем нарушением пространственной координации ферментов в облучаемых объектах. Под действием облучения проницаемость клеточных мембран нарушается, ферменты высвобождаются из мест их локализации и, соединяясь с субстратами, начинают их разрушать. При малых дозах это проявляется в усилении общего обмена веществ, что может вызвать даже стимуляцию некоторых сторон жизнедеятельности. При очень высоких дозах нарушения обмена приобретают патологический характер -- происходит разрушение жизненно важных макромолекул клетки, что приводит к ее гибели. Так как ядерная оболочка оказывается хорошо проницаемой для белковых молекул, то ферменты, высвобождаемые в цитоплазме, могут проникать в ядро и вызывать повреждение ядерных структур, а ферменты, локализованные в ядре, могут диффундировать в цитоплазму и действовать на ее структуру. Поэтому вопрос о том, что чувствительнее -- ядро или цитоплазма, -- в известной мере утрачивает свой первоначальный смысл: ответственными за поражение клетки могут быть оба эти компонента.

Степень выраженности реакций зависит от того, на какой стадии жизненного цикла клетки произведено облучение.

В общих чертах радиочувствительность клеток и тканей описывается законом Бергонье -- Трибондо, сформулированным в 1906 г в следующем виде: действие ионизирующих излучений на клетки проявляется тем сильнее, чем выше их способность к размножению и чем менее предопределены их морфология и функции.

Известно, что скорость деления клеток на разных стадиях развития тканей и организмов весьма различна. В сформировавшихся организмах клетки некоторых тканей вообще прекращают деление или делятся очень медленно; к ним относятся клетки центральной нервной системы, почек, печени и костных тканей. К быстроделящимся принадлежат клетки кожи, слизистых оболочек, костного мозга. Медленно размножающиеся и неделящиеся клетки, как правило, оказываются более устойчивыми к облучению и погибают только под действием достаточно высоких доз. В таких клетках происходят глубокие структурные изменения: набухание цитоплазмы, ядра и ядрышек, деполимеризация ДНК и образование крупных капелек, изменяется морфология ядерных структур, в дальнейшем происходит разрушение ядра и его составных частей под действием различных гидролизующих ферментов.

С увеличением скорости деления радиочувствительность клеток при остром облучении повышается, и в них обнаруживаются новые явления, обусловленные вступлением клеток в стадию митоза.

По Баку и Александеру, в делящихся клетках возможны следующие нарушения:

1) временная задержка митоза, обусловленная временным нарушением механизма расхождения хромосом;

2) прекращение деления с сохранением жизнеспособности клеток;

3) изменение функциональной способности клеток;

поломки хромосом и гибель клетки после одного или нескольких делений;

отмирание клетки без вступления в митоз, спустя длительное время после облучения. Такие клетки продолжают расти и, достигая иногда гигантских размеров, дегенерируют;

мгновенная гибель клетки под лучом (вследствие разрушения внутриклеточных белков) при дозах, измеряемых сотнями тысяч рад.

Нарушениями, специфичными для делящихся клеток, являются задержка митоза, прекращение деления и поломки хромосом.

В условиях одномоментного (острого) облучения задержка митоза у части клеток наступает под действием дозы в несколько рад; максимальная радиочувствительность, определяемая по задержке митоза, соответствует стадии профазы, т. е. начальному периоду ядерного цикла, когда в ядре начинают обнаруживаться видимые хромосомные нити, а оболочка ядра и ядрышко исчезают. При малых дозах задержка деления является временной, и спустя несколько часов митотический индекс (процент клеток в митозе) становится выше исходного. К этому моменту наряду с нормально делящимися, т. е. неповрежденными клетками, в митоз вступают клетки, деление которых было задержано, в результате чего возникает компенсаторная волна в изменении митотического индекса. С ростом дозы амплитуда этой волны уменьшается, и при очень высоких дозах митотический индекс становится ниже исходного, так как часть клеток прекращает деление, утрачивая способность к размножению. Предполагается, что причинами задержки митоза могут быть разрушение веществ, стимулирующих митоз, или образование веществ тормозящих деление, нарушение синтеза нуклеиновых кислот, нарушение механизма расхождения хромосом во время деления и, наконец, повреждение хромосом.

Поломки хромосом, вызываемые облучением и визуально наблюдаемые в делящихся клетках, обнаруживаются при относительно малых дозах.

Наибольшая радиочувствительность клеток, определяемая через повреждение хромосом, соответствует концу интерфазы, т. е. предмитотическому периоду.

Известно несколько типов повреждений. Под действием излучения может произойти разрыв хромосомы на две или несколько частей. Если разрываются две или несколько хромосом, расположенных рядом, то возникающие при этом фрагменты могут соединиться, давая начало новым структурам, отличающимся от исходных хромосом, так как между ними происходит обмен участками. При множественных разрывах хромосом некоторые фрагменты остаются невоссоединенными, т. е. свободными, образуя так называемые микроядра; при делении они не расщепляются, а целиком переходят в одну из дочерних клеток и в дальнейшем не функционируют. Неправильное воссоединение фрагментов хромосом приводит также к образованию межхромосомных мостов, препятствующих нормальному расхождению хромосом к полюсам клетки в стадии анафазы.

Фрагментация и другие поломки хромосом приводят к неправильному распределению генетического материала в дочерних клетках. Утрата клетками части наследственного вещества и прочие хромосомные нарушения, вызываемые ионизирующей радиацией, являются, по-видимому, одной из причин меньшей устойчивости делящихся клеток к излучению. Другая причина повышенной радиочувствительности быстро размножающихся клеток в условиях острого облучения связана с наличием особо радиочувствительной стадии в делящейся клетке. При ускорении темпа деления доля клеток, находящихся в каждый данный момент в этой радиочувствительной стадии, увеличивается.

К одной из разновидностей радиационных хромосомных изменений, визуально не обнаруживаемых, относятся точковые мутации, проявляющиеся в изменении наследственных признаков у облученных клеток и организмов. Однако точковые мутации вызываются, по-видимому, не разрывами хромосом, а изменением химического строения составляющих их молекул ДНК под влиянием биохимических сдвигов в облучаемых клетках.

В соответствии с законом Бергонье--Трибондо радиочувствительность клеток и тканей зависит не только от частоты клеточного деления, но и от степени их дифференциации. Известно, что организмы более чувствительны к облучению на ранних стадиях развития, особенно на ранних стадиях клеточного деления яйца. Однако при облучении даже в очень высоких дозах деление клеток эмбрионов прекращается не сразу, и погибают они лишь при достижении критической стадии, в которой начинают проявляться процессы дифференциации. Максимальная радиочувствительность обычно соответствует облучению в предгаструляционный период, после которого критической для выживания является стадия гаструлы. В дальнейшем с развитием процесса дифференциации устойчивость к облучению возрастает. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что главная причина повышенной радиочувствительности организмов и тканей в эмбриональных стадиях развития заключается в нарушении регуляторных процессов, ответственных за дифференциацию, а не в ограничении клеточного деления и роста, играющем второстепенную роль. Считается, что нарушение регуляторных процессов обусловлено повреждением клеточных ядер, так как синтез веществ, стимулирующих процессы дифференциации клеток и управление их активностью, осуществляется, по-видимому, под контролем генетического аппарата клеток.

Приведенные примеры, перечень которых можно было бы продолжить, наглядно демонстрируют несравненно большую радиочувствительность ядра по сравнению с цитоплазмой, однако они не отвергают роль последней в радиационном поражении ядерного аппарата.

Интерфазные поражения. В опытах на насекомых было показано, что гибель клетки до деления связана с подавлением синтеза нуклеиновых кислот. Эти данные позволили авторам рассматривать интерфазную форму гибели как разновидность одного из необратимых повреждений ядра, называемых в радиационной генетике доминантными деталями. Однако упоминавшаяся выше широко известная интерфазная форма поражения клеток млекопитающих, в частности лимфоцитов, морфологически выражающаяся в виде пикнотизации ядра, согласно данным Э. Я. Граевского, может быть предотвращена воздействием ряда агентов (гипертонический раствор, агматин, соли синильной кислоты), после чего облученный лимфоцит сохраняет жизнеспособность, что противоречит возможности отнесения такой формы поражения ядра к доминантным леталям.

Облучение вызывает разрывы молекулы ДНК, образование щелочно-лабильных связей, потерю оснований и изменения их состава, изменения нуклеотидных последовательностей, сшивки ДНК -- ДНК и ДНК -- белок, нарушения комплексов ДНК с другими молекулами.

Различают одиночные разрывы, когда связь между отдельными атомными группировками нарушается в одной из нитей двунитчатой молекулы ДНК, и двойные, когда разрыв происходит сразу в двух цепях, что приводит к распаду молекулы на куски. При любом разрыве нарушаются считывание информации с молекулы ДНК и пространственная структуру хроматина.

Одиночные разрывы не приводят к поломкам молекулы ДНК, так как ее куски прочно удерживаются на месте водородными, гидрофобными и другими связями с противоположной нитью ДНК, и, кроме того, структура довольно хорошо восстанавливается мощной системой репарации. С увеличением дозы излучения, кроме того, возрастает вероятность перехода одиночных разрывов в двойные, так как увеличивается возможность того, что отдельные разрывы в противоположных цепях возникают друг против друга. При действии излучений с небольшой плотностью ионизации (у- и рентгеновское излучение, быстрые электроны) 20--100 одиночных разрывов вызывают один двойной. Плотноионизирующие излучения вызывают значительно больший процент двойных разрывов. Такие виды лучевого поражения макромолекул удается регистрировать непосредственно после облучения в виде хромосомных аберраций. (Расчеты показывают, что уже при дозе 1 Гр в каждой клетке человека повреждается 5000 оснований молекул ДНК, возникает 1000 одиночных и 10--100 двойных разрывов, каждый из которых может стать причиной возникновения аберрации).

Исходя из этих представлений, выживаемость клеток во многих случаях может быть хорошо описана с помощью так называемой линейно-квадратичной модели, предложенной К. Г. Чедвиком и Г. П. Линхаутсом. Разрабатывая модель авторы исходили из того, что при облучении клеток летальными являются двойные разрывы ДНК, которые появляются либо в результате одновременного разрыва обеих спиралей ДНК одной ионизирующей частицей, либо в результате совпадения двух независимо образовавшихся одиночных разрывов комплементарных спиралей, оказавшихся напротив друг друга. Согласно модели выживаемость клеток S/S₀ равна ехр (--бD--в D, где D -- поглощенная доза, а а и в -- параметры, характеризующие вероятность индукции и репарации двойных и одиночных разрывов ДНК в рассматриваемых клетках.

Кроме образования разрывов, в облученной ДНК нарушается структура оснований, прежде всего тимина, что увеличивает число генных мутаций. Отмечается образование сшивок между ДНК и белком нуклеопротеидного комплекса.

Помимо структурных нарушений ДНК в облученной клетке имеет место нарушение регуляции, прежде всего выдачи в цитоплазму информации с ДНК, а также функционирования многочисленных внутриклеточных мембран. В этом проявляется роль внеядерных органелл, а также сложных взаимоопределяющих влияний ядра и цитоплазмы.

Многие сложные процессы клеточного метаболизма проходят именно на мембранах, так как они позволяют обеспечить нужное пространственное разделение реагирующих молекул. По мере увеличения дозы гамма - излучения наблюдается подавление механизмов активного и пассивного транспорта, нарушается проницаемость ионов калия. (по Кудряшеву). Нарушаются ДНК-мембранные взаимодействия, происходит денатурация и деструкция макромолекул, нарушение их функций в облученных клетках (Владимиров, 1972). Основным свойством гамма - лучей является их способность разрушать слаженность биологических реакций, их взаимосвязь, порядок, повреждать регуляторные функции системы. Живая система лишившись «контроля» перестает существовать (Хансон, Комар, 1985).

Наиболее радиочувствительным процессом при гамма - излучении является процесс свободно-радикального перекисного окисления ненасыщенных липидов - липопероксидация (Владимиров, Арчаков,1972). Гамма - излучения интенсифицирует пероксидацию липидов, в результате образуется избыток липидных токсических веществ, наступает деструкция мембраны. Надежность живых систем в отношении поражающего действие гамма лучей обеспечивается активностью защитных ресурсов системы - биогенных аминов, тиолов, гормонов, эндогенных антиокислительных и антирадикальных систем (Гончаренко, Кудряшов, 1980).

Для жизненной функции клеток решающее значение имеют белки и нуклеиновые кислоты. Белки -- главный органический компонент цитоплазмы. Некоторые белки относятся к структурным элементам клетки, другие -- к имеющим важное значение ферментам. Радиационное повреждение белков состоит в уменьшении их молекулярной массы в результате фрагментации полипептидных цепочек, в изменении растворимости, нарушении вторичной и третичной структуры, агрегировании и т. п. Биохимическим критерием радиационного повреждения ферментов является утрата ими способности осуществлять специфические реакции. Радиационное повреждение эндоплазматического ретикулума приводит к уменьшению синтеза белков. Поврежденные лизосомы высвобождают катаболические ферменты, способные вызвать изменения нуклеиновых кислот, белков и мукополисахаридов. Нарушение структуры и функции митохондрий снижает уровень окислительного фосфорилирования.

Наконец, важным последствием облучения является изменение эпигеномной (не связанной с ядерным материалом) наследственности клетки, носителем которой служат различные цитоплазматические органеллы. При этом снижается функциональная активность потомков облученных клеток, что может быть одной из причин отдаленных последствий облучения.

Важная особенность действия ионизирующих излучений на биологические объекты состоит в том, что радиобиологический эффект может быть существенно модифицирован при наличии других веществ, присутствующих в облучаемом объекте во время облучения или вводимых после него. Такими свойствами обладают многие вещества, входящие в состав живых клеток. В частности, к их числу относится кислород, в присутствии которого лучевое повреждение обычно заметно усиливается по сравнению с тем случаем, когда облучение проводится в анаэробных условиях.

Среди веществ, модифицирующих эффект облучения, имеются и такие соединения, в присутствии которых лучевое повреждение проявляется в меньшей степени, чем в их отсутствие. Наиболее выраженными защитными свойствами обладают вещества, содержащие SH-группу (такие, как цистеин, цистеамин, глутатион и др.). С точки зрения теории косвенного действия, защита обусловлена конкуренцией между протекторами и биологическими макромолекулами за свободные радикалы.

Поскольку количество радикалов, образующихся в клетках при облучении сублетальными дозами, относительно невелико, наличие внутриклеточных веществ, способных конкурировать с биологическими макромолекулами в реакциях со свободными радикалами, создает химическую защиту, снижая тем самым степень радиационного повреждения этих молекул.

Химическая защита возможна не только при косвенном действии излучения. Установлено, что повреждение молекул, вызываемое прямым действием, также существенно снижается в присутствии различных примесей. Защита от прямого повреждения осуществляется двумя способами:

а) межмолекулярной передачей поглощенной энергии от молекулы-мишени к молекуле защитного вещества, испытывающей затем радиационное изменение;

б) в результате взаимодействия поврежденной биологически активной молекулы с молекулой защитного вещества и восстановления поврежденной молекулы до исходного состояния, если ее первичное повреждение не было необратимым.

Размещено на www.allbest.ru