Трансгенные мыши: методология получения и использование

Генная инженерия и трансгеноз. Методология получения трансгенных мышей. Использование ретровирусных векторов. Использование метода микроинъекций ДНК. Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток. Использование трансгенных мышей.

Рубрика Биология и естествознание
Вид реферат
Язык русский
Дата добавления 18.09.2015
Размер файла 32,2 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Трансгенные мыши: методология получения и использование

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ПОНЯТИЕ ТРАНСГЕНОЗА

2. методология получения трансгенных мышей

2.1 Использование ретровирусных векторов

2.2 Метод микроинъекций ДНК

2.3 Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток

3. использование трансгенных мышей

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Трансгенные технологии разрабатывались и совершенствовались на лабораторных мышах. С начала 1980-х гг. в различные линии мышей были введены сотни генов. Эти исследования в значительной мере способствовали установлению механизмов генной регуляции и развития опухолей, природы иммунологической специфичности, молекулярной генетики роста и развития, других фундаментальных биологических процессов. Трансгенные мыши сыграли свою роль в исследовании возможности крупномасштабного синтеза лекарственных веществ, а также в создании трансгенных линий, позволяющих моделировать различные генетические болезни человека.

Наряду с изучением фундаментальных вопросов трансгенеза большое внимание привлекают работы по созданию трансгенных животных-продуцентов рекомбинантных белков, трансгенных сельскохозяйственных животных, устойчивых к заболеваниям или трансгенных животных, имеющих улучшенные продуктивные качества.

Генная инженерия и трансгеноз в частности - сверхсложные отрасли науки, которые уже многого достигли, но горизонты их развития безграничные. Они позволяют заглянуть в самые сокровенные основы нашей жизни, понять (для начала, хотя бы частично) “механику” жизни на молекулярном уровне.

Методами генной инженерии сначала были получены трансгенные микроорганизмы, несущие гены бактерии и гены онкогенного вируса обезьяны, а затем - микроорганизмы, несущие в себе гены дрозофилы, кролика, человека и т. д.

Впоследствии удалось осуществить микробный синтез многих биологически активных веществ, присутствующих в тканях животных и растений в весьма низких концентрациях: инсулина, интерферона человека, гормона роста человека, вакцины против гепатита, а также ферментов, гормональных препаратов, моноклональных антител и т. п.

Вершиной развития генной и клеточной инженерии на данный момент является получение трансгенной мыши, кролика, свиньи, быка и целого ряда других животных; клонирование лягушки, мыши, овцы. Всё ближе подходит биология к работе с человеческим геномом, клонированию человека.

Цель настоящей работы заключалась в изучении понятия трансгеноза, исследовании методологии получения трансгенных мышей и их применении.

Объектом исследования являлись трансгенные мыши.

Предмет исследования: методология получения и использование трансгенных мышей.

1. ПОНЯТИЕ ТРАНСГЕНОЗА

генный инженерия трансгеноз мышь

Организмы, у которых в геноме осуществлены изменения путем парасексуальных операций, называют трансгенными, а методология, которая использует трансгенных животных, называется трансгенозом Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б.Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002..

В общем виде трансгеноз может быть определен как перенос генов от одного организма к другому путем операций in vitro. Трансгеноз, как и любое направление в науке, является очень интересным как для углубления фундаментальных представлений о свойствах живого организма, так и для непосредственно практических потребностей, как их понимает современное общество.

На сегодня трансгеноз превратился в стратегическое направление исследований, что дает ответы на множество фундаментальных вопросов. Например, трансгеноз предлагает универсальный методический подход к исследованию отдельных стадий сложных многостадийных процессов. Это может привести к созданию диаграмм, которые описывают эти сети, подобно тому, как карты метаболических путей описывают последовательности биохимических превращений. Но пока все на стадии разработки методов и накопления информации о работе разных систем в организме. Посредством трансгеноза можно вникнуть в то, как на уровне всего организма работают промоторы, энхансеры, в механизм действия транскрипционных факторов, роль метилирования ДНК, возможно исследовать механизмы эффекта местоположения. Находит применение трансгеноз и в иммунологии, и в области эмбриогенеза, и в исследованиях развития нервной системы и механизмов кроветворения и ангиогенеза, и в исследовании факторов, которые определяют рост и дифференцирование мультипотентных стволовых клеток и, наконец, в области канцерогенеза. Что касается изучения онкогенов, то оно может привести к пониманию взаимодействий, направленных на выбор судьбы клетки в процессе клеточного дифференцирования. Иначе говоря, трансгеноз помогает понять, как клетка осуществляет свой выбор: оставаться ей в состоянии покоя, делиться или умирать.

Трансгенные животные - это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Такая информация представляет собой либо отдельный участок ДНК с собственными (гомологичными) регуляторными последовательностями (эукариотическая транскрипционная единица), либо сконструированный из различных молекул ДНК гибридный (рекомбинантный) ген. Таким образом, трансген - это искусственно введенный и интегрировавшийся в ДНК животных чужеродный ген. Еще один термин, который также будет часто использоваться в данном обзоре, - это трансгенез. Под трансгенезом понимают процесс переноса и интеграции чужеродной генетической информации в геном животных Бондарук В.В., Захарченко В.И., Беляева Р.Х. и др. // Генноинженерные сельскохозяйственные животные, Москва, 2005, с. 138-153..

Генетическое совершенствование животных базируется, главным образом, на мутационной изменчивости, а также комбинационной изменчивости, реализуемой при скрещивании различных пород и популяций животных. Развитие молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии сделало возможным генетическую модификацию животных посредством внедрения в их геном новых генов (трансгенные животные).

Создание новых эффективных методов переноса генов в эмбриональные и соматические клетки животных, а также совершенствование существующих подходов и сегодня остается актуальной задачей мировой биологической науки.

Благодаря трансгенозу уже получена ценная информация о генах хозяев (master-regulatory genes), которые отвечают за регуляцию функционирования больших групп генов. Например, таких, как myo, которые регулируют активность группы генов, специфических для мышц.

При трансгенозе возникает целый ряд проблем, связанных с механизмами согласованного взаимодействия генов и их продуктов в тех случаях, когда гены экспрессируются в одних типах клеток, а их продукты действуют на другие клетки. Часто при этом индуцируется экспрессия других генов путем отправления и приема межклеточных сигналов - мессенджеров - возникают целые каскады взаимозависимых индукций и ингибирований. Для выяснения механизмов таких сложных процессов используется два подхода, которые кажутся логически противоположными.

Один из них заключается в том, чтобы исключить - «нокаутировать» - оба аллеля определенного гена и посмотреть, как живое существо обходится без его продуктов. Этот подход называют методом потери функции (loss function).

Другой подход - напротив, задается вопросом, что будет, если в организм ввести ген, который функционирует и отвечает за синтез некоторого продукта, но этот продукт в чем-то нехарактерен для организма. Это называют методами приобретения функции (gain function). Эти последние методы можно в свою очередь подразделить на три разновидности. Одни методы используют для выяснения того, что будет, если нормальный ген с нормальной структурой начинает ненормально регулироваться. Другие - что произойдет, если сам ген изменит свою структуру, станет мутантным, хотя и останется под нормальным контролем. Третьи - что произойдет, если ввести ген, необычный для данного организма.

В трансгенозе можно выделить три критических этапа: интеграция трансгена, его экспрессия и трансмиссия, то есть перенос через половые клетки потомству.

Коротко опишем схему, которая и сейчас используется в большинстве опытов по созданию трансгенных организмов Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве // Дубровицы, 2003, 128 с..

Путем скрещивания мышей разных линий получают оплодотворенные зиготы. Перед слиянием мужского и женского пронуклеусов в зиготу, в мужской пронуклеус (он больше) путем микроинъекции вводят ДНК, которую хотят встроить в геном. Обработанные таким способом зиготы инкубируют в СО2-инкубаторе. Потом их подсаживают в матку ложнобеременной самки мыши. Она приносит потомство, которое может оказаться трансгенным, если микроинъецированная ДНК монтировалась в геном путем рекомбинации. Принципиальной при трансгенозе является трансмиссия - наследование введенной генетической информации потомками трансгенного животного. Трансгенных потомков (они гетерозиготные по введенному гену) скрещивают с гомозиготными мышами и получают генерацию F1, в которой половина гетерозигот. Потом скрещивают между собой гетерозигот поколения F1 и получают гомозиготных по введенному гену мышей.

С момента появления трансгенной технологии в начале 80-х множество животных было получено путем микроинъекций: трансгенные мыши, нематоды, дрозофилы, морские ежи, лягушки, и обычные сельскохозяйственные животные: свиньи, овцы, кролики, коровы, птицы и рыбы.

Микроинъекции делаются в пронуклеус оплодотворенного мышиного яйца. При таком способе обычно множество молекул ДНК, организованных в тандемы типа голова-к-хвосту («head to tail», конец одной молекулы пристраивается к началу другой), ассоциируют перед интеграцией путем рекомбинаций и встраиваются в одно и то же место на хромосоме. Принципиальное преимущество микроинъекций заключается в том, что они позволяют эффективно создавать трансгенных животных, но существует в этом методе и серьезный недостаток: нельзя вводить гены в клетки на более поздних стадиях, в процессе интеграции происходит множество перегруппировок, в геноме оказывается множество копий ДНК, что встраивается, и, наконец, интеграция происходит случайным образом в произвольное место генома.

Для введения инородной ДНК в геном животного можно использовать рекомбинантные ретровирусы. Преимуществами ретровирусов является то, что интеграция в этом случае происходит в соответствии с известным механизмом, в один сайт на хромосоме встраивается только одна копия и не происходит перегруппировок встроенного материала. Еще одно их достоинство - легкость доставки на разных стадиях развития. Предимплантационный эмбрион может быть обработан либо концентрированными вирусными штоками, либо путем совместного культивирования в монослоях с клеточной линией, которая продуцирует ретровирус. Можно использовать и постимплантационный эмбрион. В последнем случае ретровирусы очень удобны, но клетки зародышевых линий инфицируются с низкой частотой и поэтому эффективность получения трансгенного животного снижается. Недостаток ретровирусных векторов - ограничение размера ДНК, которую можно переносить с их помощью. Только фрагменты, которые не превышают приблизительно 10 000 пар основанной, можно транспортировать в геном таким путем.

Ретровирусы прекрасно подходят для использования в качестве векторов для переноса генетического материала в геном того организма, который генные инженеры намереваются изменить: ретровирусы стабильно встраиваются в геном и вносят в него чужую ДНК. А кроме того, существует еще одно прекрасное качество: можно выбросить вирусные гены (gag, pol, env) и вместо них между двумя LTR вставить то, что генному инженеру нужно, и сберечь при этом потенциал встраивания и переноса чужой для ретровируса информации в геном хозяина.

Как же осуществляется направленное изменение генов? Хотя клетки животных и способны встраивать инородную ДНК по механизму гомологичной рекомбинации, намного более частое встраивание происходит путем случайной рекомбинации между конечными участками линейной инородной ДНК и геномом. Частота гомологичной рекомбинации очень низкая, и в зависимости от локуса может быть - 10 -3 - 10 -7. Приблизительно 100 - 1000 случайных встраиваний происходит на одно гомологичное, и похоже, что это - еще более редкое событие. Направленное встраивание основывается не на увеличении частоты гомологичной рекомбинации, а на селекции тех редких рекомбинантов, что образуются за счет гомологичной рекомбинации.

Направленное замещение генов - это одна из первых схем, в которой ген hprt, который кодирует гипоксантинфосфорибозилтрансферазу и расположен на Х-хромосоме, замещается геном стойкости к неомицину. В случае клеток животных используют производное неомицина G418. Замещение приводит к инактивации гена, к его нокауту. Мы говорим о нокаутируемых по любому гену животных, когда они не содержат данного гена в функционально пригодном состоянии. Поскольку в данном случае ген, который замещается, расположен на Х-хромосоме, то в клетках, взятых от мужской особи, он гемизиготный, то есть представлен в клетке единственным аллелем. Поэтому его нокаут упрощается. Если в случае генов, расположенных на аутосомах для нокаута необходимо инактивировать обе гомологичные копии, то здесь - только одну. Другим преимуществом этого гена для проведения нокаута является простота селекции клеток, мутантных по нему, они могут расти на среде, которая содержит 6-тіогу-анін, тогда как клетки, которые содержат нормальный фермент, на такой среде погибают.

Вообще, селекцию клеток, успешно трансформируемых путем введения инородной генетической информации, обычно осуществляют так: необходимую конструкцию вводят в клетку вместе с геном-маркером, который легко идентифицировать после того, как он попал внутрь клетки, которая трансформируется. Попадание гена-маркера свидетельствует о том, что, скорее всего, вместе с ним проникнул и необходимый ген. Возможны два варианта использования маркера.

В первом из них, идеологически и методически более простом, используют так называемую доминантную селекцию. Этот принцип давно и широко используется. В плазмиде pBR322 содержится два гена стойкости к антибиотикам. Если плазмида проникает в бактериальную клетку, которая чувственная к этим антибиотикам, то она становится стойкой к ним благодаря экспрессии генов стойкости, содержащиеся в плазмиде. Это и есть доминантная селекция в случае бактериальных клеток. Точно такую же селекцию можно использовать и для эукариотических клеток, и мы уже использовали ее, когда вводили в клетку рекомбинантные ретровирусы, содержащие ген стойкости к неомицину. Клетки, в которые попал рекомбинантный ретровирус, становились стойкими к этому антибиотику и могли расти на содержащей его среде. Клетки же, которые не получили в свой геном ретровирус, оставались нежизнеспособными на этой среде и погибали Ларионов О., Добровольский В., Лагутин О. // «Новые направления биотехнологии», Пущино, 2004, 127..

В другом случае для селекции используют мутантные соматические клетки. Выбирают один из путей метаболизма, где некоторый продукт В, без которого клетки погибают, может синтезироваться по двум путям: из предшественника А и из предшественника С. Получают мутацию, которая не позволяет продукту В образовываться из А. Подбирают ингибитор, препятствующий превращению предшественника С в продукт В. Такие мутантные клетки не могут расти на среде с ингибитором. Однако, если их трансформировать и ввести в них ген, который преодолеет мутацию и позволит продукту В образовываться, то на среде с ингибитором будет снова происходить рост клеток. Так клетки, трансформируемые конструкциями, которые содержат ген, преодолевший мутации, можно отличить от нетрансформируемых, точнее не просто отличить, а отобрать, селекционировать. Если ген, который “перебарывает” мутацию, ввести в вектор вместе с тем геном, который вы хотите вставить в клетки, то они будут попадать в клетки вместе. Отбирая клетки, способны расти на среде с ингибитором, вы можете надеяться, что эти клетки содержат и нужный вам ген. Очень часто для создания пригодных мутантов используют метаболические пути синтеза нуклеотидов. Они хорошо изучены и позволяют осуществлять принцип селекции мутантных соматических клеток.

Однако, на уровне целостного организма животного проблема определения того, монтировался ли необходимый ген в геном и экспрессируется ли он, значительно осложняется. Проблему можно бы было решить намного проще, если бы удалось проводить селекцию не на уровне уже полученного животного, а на уровне эмбриональной клетки. В этом случае можно бы было использовать богатый арсенал методов селекции, накопленный генетикой соматических клеток. Достижения генетики животных, эмбриологии, молекулярной и клеточной биологии создали такую возможность.

Один из вариантов использования селекции на этом уровни обеспечивают эмбриональные ствольные клетки (ЭСК). Эта новая технология революционизировала трансгеноз. Общая схема получения ЭСК такая: внутреннюю клеточную массу из 4-5 дневной предимплантационной бластоцисты помещают на монослой клеток, которые поставляют матрикс для прикрепления и ростовые факторы (это так называемые фидерные, питательные клетки). Ростовые факторы поддерживают плюрипотентный характер ствольных клеток, ингибируя их дифференцирование. В таких условиях клетки внутренней клеточной массы пролиферируют и через определенное время их удаляют микропипеткой. Получены клетки диспергируют и высевают на новый фидерный слой. Выросшие колонии исследуют под микроскопом и отбирают те из них, которые имеют морфологию, характерную для ЭСК. Колонии, отвечающие требованиям, ресуспендируют и высевают на фидерный слой. В итоге получают колонии ЭСК, сохраняющих плюрипотентность и способны давать химерных животных. Например, чтобы получить химерную мышь, эмбриональные клетки от черной гомозиготной мыши вводят у бластоцисту белой мыши, гомозиготной по аллелю albino. Если подсадить эту бластоцисту ложнобеременной мыши и позволить ей родить, то потомки будут химерными, то есть будут содержать как клетки - потомки черной гомозиготы, так и клетки - потомки белой гомозиготы. Кожа этих мышей будет пятнистой. Эта пятнистость и является признаком химеризма.

Скрестим полученных химер с гомозиготными альбиносами. Среди потомков получим какое-то количество черных мышей. Эти черные мыши вышли в результате того, что часть подсаженных эмбриональных стволовых клеток от черной мыши включила информацию, которая содержится в них, в клетки зародышевого пути потомков. Это очень важный результат, показывающий, что такой путь можно использовать для создания трансгенных животных Гольдман И.Л., Разин С.В., Эрнст Л.К. и др. // Биотехнология, 2004, № 2, с. 3-12.

Теперь можно использовать ЭСК для того, чтобы ввести в них инородную ДНК. Это можно сделать разными способами, например, електропорацией или посредством ретровирусов. Обычно используют первый способ. Потом можно селекционировать те клетки, которые получили и стабильно поддерживают инородную ДНК. Отобрав нужные клетки in vitro, их вводят мыши точно так, как это описывалось выше. Трансдуцированные клеточные клоны сохраняют плюрипотентный характер.

В итоге, вместо того чтобы отбирать трансгенных животных, осуществляется селекция ствольных клеток с использованием развитых методов генетики соматических клеток.

Чрезвычайно важной для достижения той цели, с которой создаются трансгенные животные, является проблема воспроизведенной и тканеспецифической экспрессии инородных генов. Экспрессия эукариотического гена зависит от многих факторов. В регуляцию экспрессии принимают участие так называемые цис-действующие элементы - энхансеры (усилители экспрессии) и промоторы. Ткань, в которой происходит экспрессия, часто определяется комбинацией тканеспецифичного энхансера с определенным промотором. Зачастую нужно создавать такие условия, чтобы ген при нормальных условиях не экспрессировался, а включался только тогда, когда это нужно экспериментатору. Такую индуцируемую экспрессию можно обеспечить за счет использования промоторов, которые индуцируются. Например, существуют низкомолекулярные, богатые цистеином внутриклеточные белки металотионеины. Они связывают ионы тяжелых металлов и защищают организм от их действия. Экспрессия генов, кодирующих металотионеины, индуцируется в присутствии тяжелых металлов. Промоторы этих ген ов часто используют для того чтобы вызывать экспрессию трансгена в нужное время. В ряде случаев было показано, что экспрессия инородных генов в трансгенном животном может быть стимулируемой, если в корм добавлять соли тяжелых металлов. Промоторы генов, которые подлежат гормональной регуляции, также можно использовать с подобной целью. Примером может служить LTR мышиного вируса опухоли молочной железы. Результаты показывают - активность генов можно модулировать in vivo внешними сигналами, жаль только, что эти стимулы имеют токсичные эффекты, что снижает их ценность.

Между тем энхансерыы и промоторы - это еще не все, что нужно для активации транскрипции. Об этом нам говорят опыты на трансгенных животных. Когда гены встраиваются в геном случайным образом, в подавляющем большинстве случаев они экспрессируются не так, как стоило бы ожидать исходя из структуры и известных функций регуляторных элементов, которые к ним присоединяют в надежде получить желаемую экспрессию в желаемых тканях и в желаемое время. Это означает, что на экспрессию генов влияют не только присоединенные регуляторные конструкции, но и другие регуляторные элементы, которые в хромосоме хозяина расположены рядом со встроенным геном. Также не может не иметь значения для экспрессии и состояния хроматина в месте, куда попал ген.

Генная инженерия и трансгеноз в частности - сверхсложные отрасли науки, которые уже многого достигли, но горизонты их развития безграничные. Они позволяют заглянуть в самые сокровенные основы нашей жизни, понять (для начала, хотя бы частично) “механику” жизни на молекулярном уровне Баурин В.В., Мирошниченко О.И., Захарченко В.И. и др. // Генноинженерные сельскохозяйственные животные, Москва, 2005, с. 154-165..

2. МЕТОДОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

Введение чужеродной ДНК мышам можно осуществить разными методами: 1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента; 2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйцеклетки; 3) введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.

2.1 Использование ретровирусных векторов

Более простым способом доставки чужеродных генов в геном животного-реципиента является использование векторов на основе вирусов. В этом случае эмбрионы на ранней (восьмиклеточной) стадии развития инкубируют в культуральной среде в присутствии фибробластов, в которых образуются рекомбинантные ретровирусы, и после заражения такими вирусами эмбрионы пересаживают псевдобеременным самкам мышей, где они продолжают свое развитие. Кроме простоты одним из преимуществ данного способа введения ДНК является то, что в геном клеток зародышей интегрируется, как правило, одна копия исследуемого гена, фланкированного длинными концевыми повторами вирусной хромосомы, что может способствовать эффективной экспрессии гена. Однако к недостаткам метода следует отнести необходимость проведения дополнительных генно-инженерных манипуляций при подготовке ретровирусного вектора, ограниченную емкость вектора (размер вставки - до 10 т.п.о.), вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии, и мозаицизм образующихся трансгенных животных, которые состоят из клеток как содержащих, так и не содержащих трансгены Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве // Дубровицы, 2003, 128 с..

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность.

2.2 Метод микроинъекций ДНК

В настоящее время для создания трансгенных мышей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следуюшем

1.Увеличение числа яйцеклеток, в которых будет инъецирована чужеродная ДНК, путем стимуляции гиперовуляции у самок-доноров. Сначала самкам вводят сыворотку беременной кобылы, а спустя примерно 48 ч -- хорионический гонадотропин человека. В результате гиперовуляции образуется примерно 35 яйцеклеток вместо обычных 5--10.

2.Скрещивание с самцами самок с гиперовуляцией и их умерщвление. Вымывание из яйцеводов оплодотворенных яйцеклеток.

3.Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйцеклетки -- как правило, сразу после выделения. Часто вводимая трансгенная конструкция находится в линейной форме и не содержит прокариотических векторных последовательностей.

У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермия (мужской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским пронуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно гораздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно перемещать, ориентировать нужным образом и фиксировать. Опытный экспериментатор за день может инокулиронать несколько сотен яйцеклеток.

После введения ДНК от 25 до 40 яйцеклеток имплантируют микрохирургическим путем в «суррогатную» мать, у которой вызывают ложную беременность скрещиванием с вазэктомированным самцом. У мышей спаривание - это единственный известный способ подготовки матки к имплантации. Поскольку вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из яйцеклеток «суррогатной» матери не оплодотворяется. Эмбрионы развиваются только из введенных яйцеклеток, и мышата рождаются спустя примерно 3 нед после имплантации.

Для идентификации трансгенных животных выделяют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий Зиновьева Н., Безенфельдер У., Мюллер С. и др.// Биотехнология, 2005, с. 3-11.

Описанный подход кажется на первый взгляд относительно простым, однако он требует четкой координации разных этапов. Даже высококвалифицированному специалисту удается получить жизнеспособных трансгенных животных в лучшем случае лишь из 5% инокулированных яйцеклеток. Ни один из этапов эксперимента не эффективен на все 100%, поэтому для микроинъекций необходимо использовать большое число оплодотворенных яйцеклеток. Например, при получении трансгенных мышей после инъекции ДНК выживают только 66% оплодотворенных яйцеклеток; мышата развиваются примерно из 25% имплантированных яйцеклеток, причем трансгенными из них оказываются лишь 25%. Таким образом, из 1000 имплантированных оплодотворенных яйцеклеток развивается от 30 до 50 трансгенных мышат. Кроме того, введенная ДНК может интегрировать в любое место в геноме, и зачастую множество ее копий включаются в один сайт. И наконец, не все трансгенные мышата будут обладать нужными свойствами. В организме некоторых особей трансген может не экспрессироваться из-за неподходящего окружения сайта интеграции, а в организме других число копий чужеродного гена может оказаться слишком большим, что может привести к гиперпродукции белка и нарушению нормальных физиологических процессов. И все же, несмотря на все это, метод микроинъекций используют для получения линий мышей, несущих функциональные трансгены, довольно часто.

2.3 Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ЕS). ЕS-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных. Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных системКузнецов А.В., Кузнецова И.В. // Онтогенез, 2005, Т.26, № 4, с. 300-309. .

Рекомбинантные гены вводят в такие клетки любым из вышеупомянутых способов, а кроме того, электропорацией или другими стандартными методами, применяемыми для доставки генов в культивируемые соматические клетки. При этом вместе с исследуемыми генами возможно введение селектируемых маркеров, которые позволяют проводить отбор клеток, экспрессирующих данные маркеры и, следовательно, гарантированно содержащих сцепленные с ними исследуемые гены. Отобранные таким образом клетки переносят в бластоцисты развивающихся эмбрионов или используют для получения агрегационных химер объединением их с клетками восьмиклеточных эмбрионов с последующей пересадкой эмбрионов псевдобеременным самкам.

При трансфекиии ЕS-клеток в культуре вектором, предназначенным для интеграции в специфический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДНК встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ЕS-клеток интеграции вообще не происходит. Для увеличения числа клеток первого типа используют так называемую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции клеток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт Кузнецова И.В., Кузнецов А.В., Сигаева В.А. и др. // Биотехнология, 2003, с. 2-5..

Сайт-мишень должен находиться в такой области геномной ДНК, которая не кодирует важных белков, чтобы интеграция чужеродной ДНК не повлияла на процессы развития или клеточные функции. Кроме того, существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансляцию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно.

3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

Трансгенные мыши могут служить модельными системами для изучения болезней человека и тест-системами для исследования возможности синтеза продуктов, представляющих интерес для медицины. Используя целых животных, можно моделировать и возникновение патологии, и ее развитие. Однако мышь -- не человек, хотя она тоже относится к классу млекопитающих, поэтому данные, полученные на трансгенных моделях, не всегда можно экстраполировать на человека в том, что касается медицинских аспектов. Тем не менее в некоторых случаях они позволяют выявить ключевые моменты этиологии сложной болезни. Принимая во внимание все это, ученые разработали «мышиные» модели таких генетических болезней человека, как болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, образование опухолей, гипертония, нейродегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной системы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие Сингер М. Гены и геномы / М.Сингер, П. Берг. М.: Мир, 2006..

Мы много уже знаем о том, что мутации приводят к раку, аномалиям в развитии, наследственным заболеваниям и к старению. Мутации также лежат в основе эволюции. Понятно, что очень важно было бы проследить за тем, как появляются мутации на уровне целого организма. До появления трансгеноза это делали в лучшем случае на уровне клеточных культур.

Возможность простого анализа мутаций на уровне целого организма привлекательна и тем, что можно было бы посмотреть, как мутации появляются в разных органах и тканяхКолесников В.А., Зеленина И.А., Семенова М.Л. и др. // Онтогенез, 2006, № 6, 467-480. .

Использование трансгенных мышей дало возможность прослеживать за повреждениями ДНК, репарацией этих повреждений, появлением мутаций и раковых опухолей в одном организме. Иными словами просматривать всю цепочку - от повреждения ДНК, например, химическими агентами до физиологического проявления последствий этих повреждений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биотехнологию можно назвать самой модной отраслью последнего десятилетия. Ее обороты растут завидными темпами, но гораздо быстрее растут ожидания, что отражается в объемах инвестиций и количестве вновь возникающих биотехнологических фирм. В то же время достижения в этой области то и дело становятся источником общественных страхов, предметом дискуссий и протестов. Наверное, за всю историю индустриального общества не найдется другой отрасли, вызывавшей к себе столь полярное отношение.

Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (трансгеноза) основана на введении клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши с помощью микроинъекции, имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных стволовых клеток и трансфекции их клонированным геном. При этом вводимая конструкция должна интегрироваться в геном стволовых клеток. Клетки, несущие ген-мишень в определенном хромосомном сайте, отбирают и культивируют, а затем вводят их в мышиные эмбрионы на ранних стадиях развития. Мышиные эмбриональные стволовые клетки плюрипотентны, т. е. могут дать начало клеткам любого типа, в том числе и клеткам зародышевой линии. Таким образом были получены мыши, синтезирующие только человеческие антитела. Их использовали в качестве модельных систем для изучения генетических болезней человека. Модификация генов у мышей заполонила все области биомедицинской науки. Влияние этого подхода на понимание функции генов и приносимая им польза человечеству будет расти и расти.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баурин В.В., Мирошниченко О.И., Захарченко В.И. и др. // Генноинженерные сельскохозяйственные животные, Москва, 2005, с. 154-165.

2. Бондарук В.В., Захарченко В.И., Беляева Р.Х. и др. // Генноинженерные сельскохозяйственные животные, Москва, 2005, с. 138-153.

3. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б.Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002.

4. Гольдман И.Л., Разин С.В., Эрнст Л.К. и др. // Биотехнология, 2004, № 2, с. 3-12

5. Ермишин А.П. Генетически модифицированные организмы. Мифы и реальность / А.П. Ермишин. Мн.: Техналогія, 2004.

6. Зеленина И.А., Семенова М.Л., Алимов А.А. и др. // Генетика, 2001, Т. 27, № 12, с. 2182-2186.

7. Зиновьева Н., Безенфельдер У., Мюллер С. и др.// Биотехнология, 2005, с. 3-11

8. Зиновьева Н., Безенфельдер У., Мюллер С. и др.// С.-х. биология,2003, № 6, с. 31-34.

9. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве // Дубровицы, 2003, 128 с.

10. Колесников В.А., Алимов А.А., Барминцев В.А. и др. // Генетика, 2000; Т. 26, № 12, с. 2122-2126.

11. Колесников В.А., Зеленина И.А., Семенова М.Л. и др. // Онтогенез, 2006, № 6, 467-480.

12. Кузнецов А.В., Кузнецова И.В. // Онтогенез, 2005, Т.26, № 4, с. 300-309.

13. Кузнецова И.В., Кузнецов А.В., Сигаева В.А. и др. // Биотехнология, 2002, т. 11-12, с.2-5.

14. Ларионов О., Добровольский В., Лагутин О. // «Новые направления биотехнологии», Пущино, 2004, 127.

15. Сингер М. Гены и геномы / М.Сингер, П. Берг. М.: Мир, 2006.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

  • Основные методы введения рекомбинантных ДНК в клетки. Генетически модифицированные микроорганизмы и их использование. Получение трансгенных растений, устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды. Создание и применение трансгенных животных.

    методичка [476,5 K], добавлен 13.09.2012

  • Использование трансгенных организмов: изучение роли определенных генов и белков; получение новых сортов растений и пород животных; в биотехнологическом производстве плазмид и белков. Выведение флуоресцентных свиней и генетический модифицированных кошек.

    презентация [676,7 K], добавлен 25.12.2012

  • История изучения стволовых клеток. Изолирование линий эмбриональных стволовых клеток человека и животных. Эмбриональные, гемопоэтические, мезенхимальные, стромальные и тканеспецифичные стволовые клетки. Использование дезагрегированных эмбрионов.

    реферат [32,5 K], добавлен 13.12.2010

  • Понятие и сущность генно-модифицированных и трансгенных организмов, их влияние на организм человека и на окружающую среду. Анализ современного положения генно-модифицированных продуктов в России, а также анализ их положительных и отрицательных сторон.

    презентация [924,1 K], добавлен 19.12.2010

  • Использование клеток, не существовавших в живой природе, в биотехнологических процессах. Выделение генов из клеток, манипуляции с ними, введение в другие организмы в основе задач генной инженерии. История генной инженерии. Проблемы продуктов с ГМО.

    презентация [2,2 M], добавлен 21.02.2014

  • Генная инженерия: история возникновения, общая характеристика, преимущества и недостатки. Знакомство с новейшими методами генной инженерии, их использование в медицине. Разработка генной инженерии в области животноводства и птицеводства. Опыты на крысах.

    курсовая работа [2,5 M], добавлен 11.07.2012

  • Использование летучими мышами эхолокации, сложных голосовых сообщений для ухаживаний и для опознавания друг друга, обозначения социального статуса, определения территориальных границ. Размножение, рождение малышей и забота о потомстве у летучих мышей.

    реферат [15,9 K], добавлен 11.10.2012

  • Производство продуктов микробного синтеза первой и второй фазы, аминокислот, органических кислот, витаминов. Крупномасштабное производство антибиотиков. Производство спиртов и полиолов. Основные типы биопроцессов. Метаболическая инженерия растений.

    курсовая работа [233,2 K], добавлен 22.12.2013

  • Генная инженерия как метод биотехнологии, который занимается исследованиями по перестройке генотипов. Этапы процесса получения рекомбинантных плазмид. Конструирование клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции.

    презентация [819,2 K], добавлен 20.11.2011

  • Методы трансгенеза в животноводстве. Использование половых клеток семенников. Факторы повышения экспрессии трансгенов в организме животных. Особенности пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro. Перспективы генно-инженерных работ в животноводстве.

    реферат [38,6 K], добавлен 26.09.2009

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.