Размещено на http://allbest.ru

25

Размещено на http://allbest.ru

Курсовая работа

Получение рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста

Список сокращений

васкулярный эндотелиальный фактор

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor)

VEGFR-1 - мембранный рецептор 1 сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular endothelial growth factor receptor)

VEGFR-2 - мембранный рецептор 2 сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular endothelial growth factor receptor)

FGF-1, -2 - фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor)

FGFR - рецептор фактора роста фибробластов

PDGF - тромбоцитарный фактор роста (platelet derived growth factor)

PDGFR - рецептор тробмоцитарного фактора роста

HIF-1 - фактор, индуцируемый при гипоксии (hypoxic inducible factor)

Ang-1,-2 - ангиопоэтины

PAS - семейство доменов (PER-ARNT-SIM)

Per - белок кодируемый геном Drosophila melanogaster, отвечающий за биоритмы организма (period circadian protein)

Arnt - аryl hidrocarbon receptor nuclear translocator protein

SIM - single minded protein

bHLH - семейство факторов транскрипции («спираль-петля-спираль») (basic Helix-Loop-Helix)

pVHL - опухолевый супрессор (von Hippel Lindau)

Tie-2 - мембранный киназный рецептор (Tunica interna endothelial kinase-2)

MAPK - митоген-активированная киназа (mitogen-activated protein kinase)

PI3K- фосфатидилинозитол 3-киназа (phosphatidylinositol 3-kinase)

Grb2 - белок сателлит фактора роста (Growth factor receptor-bound protein 2)

FRS-2 - субстрат рецептора фактора роста фибробластов (Fibroblast growth factor receptor substrate 2)

Ras - сигнальный белок, принадлежащий семейству малых гуанозинтрифосфатаз

Raf - сигнальный белок, серин/треонин-специфичная протеин-киназа

ERK - внутриклеточная сигнальная киназа (extracellular-regulated kinase)

MEK - митоген-активированная киназа киназа (Mitogen-activated protein kinase kinase)

Src - семейство протоонкогенных тирозин киназ

C-Kit - поверхностный цитокиновый рецептор

ECM - межклеточный матрикс (extracellular matrix)

ATP - аденозин-5`-трифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИПТГ - изопропилтио--D-галактозид

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Трис - трис(гидроксиметил)метиламин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

DTT - 1,4-дитиотреитол

dNTP - дезоксирибонуклеозид-5`-трифосфаты

SDS - додецилсульфат натрия

TEMED - N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин

Amp - ампициллин

Введение

Современные достижения биотехнологии в области работы с рекомбинантными ДНК открывают большие возможности для получения разнообразных белковых молекул, с нужной биологической активностью. Одной из важнейших проблем нового века является рост числа онкологических заболеваний. В связи с этим, важной задачей представляется разработка новых эффективных целевых препаратов. За последние 30 лет антиангиогенная терапия стала важной методикой в борьбе со злокачественными новообразованиями. Клинические данные продемонстрировали, что гуманизированные моноклональные антитела - препарат бевацизумаб - прицельно действующий на ключевой фактор ангиогенеза, а именно - сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), могут увеличить продолжительность жизни больных метастатическим колоректальным раком при назначении в качестве терапии первой линии в комбинации с химиопрепаратами [1]. В данной работе мы обсудим функции и значение VEGF, чтобы показать, что VEGF является обоснованной точкой приложения действия противоопухолевой терапии. Цель данной курсовой работы состояла в разработке методики получения рекомбинантного сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF). Для решения поставленной цели были определенны следующие задачи:

1. Осуществить химико-ферментативный синтез гена белка VEGF₁₆₅, и клонировать в экспрессирующий вектор pET23d(+).

2. Получить высокоэффективный штамм-продуцент E.coli (ER2566)/pERVEGF₁₆₅, продуцирующий рекомбинантный сосудистый эндотелиальный фактор роста.

1. Литературный обзор

васкулярный эндотелиальный фактор

Факторы роста

Общие сведения

Факторы роста -- это белковые субстанции, способные стимулировать рост, пролиферацию и/или дифференцировку живых клеток [2].

Факторы роста обычно представляют собой небольшие полипептиды, которые стимулируют или ингибируют пролиферацию определенных типов клеток [3]. Как правило, они секретируются одними клетками и действуют на другие клетки, хотя иногда бывает так, что они действуют на те же клетки, которые их секретируют [4]. Эти факторы важны для процессов развития эмбриона и также для поддержания клеточного баланса у взрослого организма. Например, для уравновешенного обновления клеток кожи, кишечника и кроветворной системы [5]. Они действуют на свои клетки-мишени, которые отличаются от других клеток рецепторами, экспонированными на поверхности клеточных мембран и характерными именно для данного типа клеток. Так, некоторые белки этой группы в зависимости от типа клеток-респондентов могут индуцировать дифференцировку и подавлять пролиферацию [6]. Кроме того, к ним относят регуляторные полипептиды, модулирующие подвижность клеток, но не обязательно влияющие на деление клеток [5].

В конечном счете, клетка выходит из фазы отдыха G0 и начинает делиться. Интегральная картина взаимодействий множества факторов с множеством клеток сложна, тем более, что часто даже отдельно взятый ростовой фактор обладает несколькими функциями.

Факторы роста не только промотируют клеточное деление, а так же ингибируют их пролиферацию. Роль ингибитора, в частности, выполняют члены большого семейства ростовых факторов - TGF-бета [7].

Несмотря на огромное разнообразие охарактеризованных факторов роста и колоссальную разницу клеточных ответов [8], можно сформулировать общие правила регуляции:

1. Для поддержания жизни нормальных клеток высших организмов абсолютно необходимо их взаимодействие с уникальной комбинацией специфических ростовых факторов.

2. Одна и та же клетка может взаимодействовать с несколькими факторами роста; один и тот же фактор роста может оказывать влияние на разные типы клеток.

3. Уровень экспрессии данного ростового фактора, а также восприимчивость и характер ответа являются специфичными для каждого данного типа клеток.

В основе раковых заболеваний лежат нарушения контроля пролиферации, а также взаимодействий клеток друг с другом. Часто неопластическая трансформация затрагивает имеющуюся в клетке собственную программу регуляции - реакции на ростовые факторы [9]. С этим, так или иначе, связаны функции большинства онкогенов.

Классификация факторов роста

Факторы роста классифицируют по их биологической активности. Индивидуальные ростовые факторы представлены большими семействами структурно и эволюционно родственных белков. Основные семейства ростовых факторов представлены ниже [10-21].

· Косные морфогенетические белки (BMPs)

· Эпидермальный фактор роста (EGF)

· Эритропоэтин (EPO)

· Фактор роста фибробластов (FGF)

· Колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF)

· Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF)

· Фактор роста гепатоцитов (HGF)

· Инсулин-подобный фактор роста (IGF)

· Миостатин (GDF-8)

· Фактор роста нервов (NGF) и другие нейротрофины

· Тромбоцитарный фактор роста (PDGF)

· Тромбопоэтин (TPO)

· Трансформирующий ростовой фактор альфа(TGF-б)

· Трансформирующий ростовой фактор beta(TGF-в)

· Фактор некроза опухоли альфа(TNF-б)

· Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)

· Плацентарный фактор роста (PlGF)

· IL-1- Кофактор для IL-3 и IL- 6. Активатор Т клеток.

· IL-2- Фактор роста Т- клеток. Стимулятор синтеза IL-1. Активатор B и NK - клеток.

· IL-3- Стимулирует пролиферацию всех не лимфоидных клеток.

· IL-4- Ростовой фактор активированных B клеток, а также тучных клеток.

· IL-5- Индуцирует дифференцировку активированных B клеток и эозинофилов.

В данной курсовой работе было рассмотрено одно из представленных семейств ростовых факторов, а именно васкулярный эндотелиальный фактор роста. Описаны основные белки семейства, их биологическая роль с учётом молекулярной структуры и представлены принципы их направленной модификации с целью изменения спектра биологического действия.

2. Васкулярно-эндотелиальный фактор роста VEGF

Общие сведения

VEGF - один из членов семейства структурно близких между собой белков, которые являются лигандами для семейства рецепторов VEGF [21]. VEGF влияет на развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и выживание незрелых кровеносных сосудов (сосудистая поддержка), связываясь с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 VEGF и рецептором-2 VEGF) и активируя их [22]. Эти рецепторы экспрессируются клетками эндотелия стенки кровеносных сосудов. Связывание VEGF с этими рецепторами запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию, подробнее о механизме внутриклеточной передачи сигнала будет сказано в разделе «VEGF рецепторы».

Классификация и разновидности VEGF

Существует два подхода к классификации членов семейства VEGF. Историческая классификация и на основе альтернативного сплайсинга пре мРНК. Согласно исторической классификации в семейство VEGF белков выделяют VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D и плацентарный фактор роста [21]. Наиболее важным из них является VEGF A, другие были обнаружены позднее VEGF-A, и до их открытия, VEGF А назывался просто VEGF. Так же к этому семейству белков причисляют кодируемый вирусами VEGF подобный белок, получивший название VEGF E и васкулярный эндотелиальный фактор роста из змеиного яда VEGF F. Помимо вышеописанной классификации, семейство VEGF белков делят на два больших подсемейства в соответствии с положением сайта сплайсинга восьмого экзона пре-мРНК [23]. Проксимальный сайт сплайсинга обозначают VEGFxxx, а дистальный сайт сплайсинга VEGFxxxb. Данный домен имеет важное функциональное значение, определяя про- ангиогенные (проксимальный сайт сплайсинга) или анти ангиогеные (дистальный сайт сплайсинга) свойства белка [23]. Кроме того, альтернативный сплайсинг экзона 6 и 7 изменяет их сродство к гепарину и нейрофилину, например: VEGF121, VEGF_121b, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₅, VEGF_165b, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆, где число показывает количество аминокислотный остатков. Тогда как экзоны 2-5 являются общими для всех и определяют сродство к VEGF рецепторам 1 и 2 (Рис.1).

Рис. 1 Схема вариантов альтернативного сплайсинга пре-мРНК VEGF с указанием количество остатков аминокислот полипептидной цепи и функций доменов, кодируемые указанными экзонами [23].

Васкулярно-эндотелиальный фактор роста (VEGF 165)

VEGF165 представляет собой гомодимер с молекулярной массой 19 165 Да, и изоэлектрической точкой 7,429, каждый мономер которого образован семью в-складчатыми листами, и двумя б-спиралями, соединенных тремя дисульфидными мостиками (Рис.2) [24].

Рис. 2 Структура димера VEGF 165 [3].

Стабилизация димера происходит при реверсивном расположении мономеров, и образовании двойной дисульфидной связи [25].

Васкулярно-эндотелиальный фактор роста (b) VEGF 165b

Впервые VEGF 165b был выделен из эпителиальных клеток почек. Эта разновидность васкулянного эндотелиального фактора роста распространена в нормальных клетка, но абсолютно отсутствует в клетка опухоли. VEGF 165b имеет такое же сродство к VEGFR-2 как и VEGF 165, но не связывается с нейрофилином, и обладает слабой аффиностью к гепарину [26].

Аминокислотная последовательность VEGF 165b идентична аминокислотной последовательности VEGF 165 за исключением 6 аминокислотных остатков на С - конце, так как их кодирует не 8 экзон, а экзон 9 [26] (Рис 3).

Рис 3. На схеме представлены различия мРНК VEGF 165 и VEGF 165b.

Рис 4. Структура С-конца VEGF 165. Стрелка показывает дисульфидную связь образованную 160 и 146 аминокислотными остатками цистеина [26].

Экзон 8 кодирует последовательность Cys-Asp-Lys-Pro-Arg-Arg, тогда как экзон 9 кодирует последовательность Ser-Leu-Thr-Arg-Lys-Asp. Это приводит к формированию различных третичных структур. 160 аминокислотный остаток (Cys) в молекуле VEGF 165 формирует дисульфидную связь с 146 цистеином (Рис 4).

Значимое отличие первичной структуры VEGF 165 b от VEGF 165 заключается в том, что вместо цистеина в 160 положении (VEGF 165) расположен серин (VEGF 165 b), тем самым отсутствует возможность образования S-S связи [27] (Рис 5).

Рис 5. С-концевая аминокислотная последовательность VEGF 165 и VEGF 165b [23].

В результате снижается сродство к гепарину и нейрофилину-1. Тем самым 160 цистеин играет важную роль в связывании с гепарином и нейрофилином-1[27].

Участие VEGF в ангиогенезе.

Ангиогенез -- процесс образования новых кровеносных сосудов в органе или ткани. В норме в организме процессы ангиогенеза протекают с умеренной интенсивностью и активизируются только при регенерации повреждённых тканей, канализации тромбов, ликвидации очагов воспаления, образовании рубца и тому подобных процессах восстановления, а также при росте и развитии организма [28].

При ангиогенезе эндотелиальные клетки выходят из свойственного им состояния покоя (скорость удвоения их популяции возрастает почти в 100 раз), начинают делиться и образуют эндотелиальную почку, которая прорывает базальную мембрану и внедряется в соединительную ткань [29]. Активацию эндотелиальных клеток обеспечивают факторы роста, которые образуются в опухоли и в самих эндотелиальных клетках, а также компоненты внеклеточного матрикса [30]. Прекращение действия этих факторов возвращает эндотелиальные клетки в состояние покоя. Начальным этапом VEGF опосредованного ангиогенеза является взаимодействие ростовых факторов с соответствующими поверхностными рецепторами мембраны эндотелиальных клеток [22].

VEGF рецепторы

Существует несколько типов VEGF рецепторов VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 и ко-рецепторы гепарин и нейрофилин-1(рис 6) [22].

Рис 6. Схема VEGF рецепторов с соответствующими лигандами.

VEGF-А связывается с VEGFR-1, VEGFR-2. Так же многие белковые формы альтернативного сплайсинга гена VEGF-А, обладают сродством к нейрофилину-1 и внеклеточному матриксу, особенно гепарину [21]. VEGF-B обладает сродством только с VEGFR-1, тогда как VEGF-С и VEGF-D являются лигандами для VEGFR-2 и VEGFR-3 [31]. Вирусный VEGF-E и VEGF-F яда змеи активируют только VEGFR-2. VEGFR являются мембранными тирозинкиназными рецепторами. VEGFR-1 активирует формирование только кровеносных, а VEGFR-3 лимфатических сосудов [32]. Тогда как VEGFR-2 участвует в формирование, как кровеносных сосудов, так и лимфатических.



Рис. 7 Сайты фосфорилирования и передачи сигнала от VEGF рецепторов [33].

При активации рецепторов VEGF участвуют также «вспомогательные» белки. FRS2, как и в случае FGFR рецептора, фосфорилированные по тиозиновым, сериновым и треониновым остаткам, связывают адапторные белки Grb2 и Shp2 (тирозинфосфатазу) и запускают внутриклеточный сигнальный каскад PKCг, PI3K, Src и Crk (Рис 7) [33].

Наиболее яркими примерами патологий, связанных с ангиогенезом, являются атеросклероз [34], язвенная болезнь [35] и некоторые аутоиммунные заболевания. Существуют косвенные указания на нарушения нормальных процессов ангиогенеза при ряде патологий развития и при опухолеобразовании [36].

Из выше приведённого литературного обзора видно, какую важную роль играет VEGF в процессе ангиогенеза, а понимание механизмов взаимодействия данного ростового фактора с соответствующими рецепторами открывает перспективы, направленной модификацией белка, с целью создания новых лекарственных субстанций.

Материалы

· Реактивы

В работе использованы трис, акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, персульфат аммония, ТЕМЕД, уксусная кислота, этанол, SDS, бромфеноловый синий, 2-меркаптоэтанол, агар (Difco), дрожжевой экстракт (Sigma), ИПТГ (Sigma), бакто-триптон (Difco).

· Олигонуклеотиды

PR-1 : tataccatggcgccgatgg

PR-2 : ggtgctcgagttagcgacg

V-1 : tataccatggcgccgatggcggaaggcggtggcca

V-2 : gaaccatcacgaagttgtgaaatttatggatgtttaccagcgttc

V-3 : ttactgccatccgattgaaaccctggttgatattttt

V-4 : caggaatacccggatgaaattgaatacatttttaaaccg

V-5 : Tcttgcgttccgctgatgcgttgcggcggt

V-6 : tgctgtaacgatgaaggcctggaatgcgttccgaccga

V-7 : agaatctaacattaccatgcagattatgcgtatt

V-8 : aaaccgcatcagggccagcatattggcgaaatgtct

V-9 : tttctgcagcataacaaatgcgaatgccgtccgaaaa

V-10 : aagatcgtgcgcgtcaggaaaacccgtgcgg

V-11 : cccgtgctctgaacgtcgcaaacatctgtttgttc

V-12 : aggacccgcagacctgcaaatgctcttgtaaaaacaccg

V-13 : attctcgttgcaaagcgcgtcagctggaactgaacgaac

V-14 : gtacctgccgttgtgataaaccgcgt

V-15 : ctcgagttagcgacgcggtttatca

V-16 : caacggcaggtacgttcgttcagttccagc

V-17 : tgacgcgctttgcaacgagaatcggtgtttttacaagagc

V-18 : atttgcaggtctgcgggtcctgaacaaacagatgtttg

V-19 : cgacgttcagagcacgggccgcacggg

V-20 : ttttcctgacgcgcacgatcttttttcggacggcatt

V-21 : cgcatttgttatgctgcagaaaagacatttcg

V-22 : ccaatatgctggccctgatgcggtttaatacgcat

V-23 : aatctgcatggtaatgttagattcttcggtcggaacgcat

V-24 : tccaggccttcatcgttacagcaaccgccgcaacg

V-25 : catcagcggaacgcaagacggtttaaaaatgtattc

V-26 : aatttcatccgggtattcctgaaaaatatcaaccagggtttc

V-27 : aatcggatggcagtaagaacgctggtaaacatccataaatttca

V-28 : caacttcgtgatggttctggccaccgccttccgccatcggcg

Олигонуклеотиды были синтезированы на заказ фирмой Евроген.

Т4-ДНК-лигаза (Fermentas, #EL0014), Т4-полинуклеотидкиназа (Fermentas, #EK0031), Taq ДНК-полимераза (Fermentas), эндонуклеазы рестрикции NcoI, XhoI.

· Плазмидный вектор

pET23d(+) (Novagen)

· Бактериальные штаммы

E.coli ER2566 ( [F^- lamda^- fhuA2 [lon] ompT lacZ:: T7 gene1 gal sulA11 D(mcrC- mrr)114::IS10 R(mcr-73::miniTn10-- TetS)2 R(zgb-210::Tn10) (TetS) endA1 [dcm])

Лабораторное оборудование

В работе использовали напольные центрифуги с охлаждением К-24 (MLW, Германия), G-21 и J-21 (Beckman); Настольная центрифуга Denville 260D (Denville Scientific, США), (Heraeus); амплификатор (Gene-Cycler) (Bio-Rad); сухой термостат DVE (Heraeus); качалку с термостатируемой камерой Certomat (ETH); источники постоянного тока: 2197 Power Supply (LKB), 2002 Power Supply (LKB), 2301 Macrodrive-l (LKB), 2301 Macrodrive-5 (LKB), Electrophoresis Power Supply EPS500/400 (Pharmacia); ультразвуковой дезинтегратор (Branson) MSE, pH-метр PB-11 (Sartorius); Спектрофотометр SmartSpec Plus (Bio-Rad, США); ламинарный шкаф Gelaire (Flow Lab.); УФ-трансиллюминатор (Desaga); весы аналитические (Mettler PM460); автоматические микропипетки (Gilson, Eppendorf).

· Буферы и растворы

50ТАЕ (50-кратный буфер для электрофореза ДНК в агарозе):

2 М трис-ацетат, рН 8,0, 1 М Na-ацетат, 0,9 М NaCl, 50 мМ ЭДТА.

40% акриламид/1,3% N,N'-метилен-бисакриламид в воде.

YT-бульон: 0,8 % бакто-триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 0,5 % NaCl.

Буферные системы для денатурирующего белкового электрофореза:

Буфер для приготовления образцов - 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 3% SDS, 20% глицерин, 3% 2-меркаптоэтанол, 0,05% бромфеноловый синий;

LTB (буфер для разделяющего геля) 375 мМ трис-HCl, рН 8,8, 0,1%SDS;

UTB (буфер для концентрирующего геля) 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 0,1% SDS.

10ЧБуфер для Taq-полимеразы: 67 мМ трис-HCl, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01 % TWEEN-20, 1,5 мМ MgCl₂.

10Ч Буфер для ДНК-лигазы фага Т4: 25 мМ трис-HCl, рН 7,8, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ДТТ, 0,4 мМ рАТР.

10 ЧБуфер для полинуклеотидкиназы фага Т4: 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ ДТТ.

Буфер для эндонуклеаз рестрикции (NcoI, XhoI) : 10X Buffer Tango™ (Fermentas) : 33 мМ трис-ацетат (pH 7,9 при 37°C), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,1 мг/мл БСА.

Методы

· Химико-ферментативный синтез гена VEGF₁₆₅.

- Синтез гена VEGF₁₆₅ проводился химико-ферментативным способом из синтетических олигонуклеотидов (V-1 - V-28). Олигонуклеотиды (V-2 - V12, V-16 - V-28) были смешаны в эквимолярном соотношении по 200 пмоль, и фосфорилированы в реакционной смеси объемом 80 мкл, содержащей 2 мкл 5мМ АТФ, 10 единиц полинуклеотидкиназы фага Т4 (Fermentas), 2 мкл 10х буфера для Т4-полинуклеотидкиназы, 75 мкл воды. Реакцию проводили в течение 1,5 часа при 37⁰С. По окончании ферментативной реакции все реакционные смеси были прогреты 10 минут при 75⁰С для инактивации Т4-полинуклеотидкиназы. Далее фосфорилированные нуклеотиды были смешаны c растворами, содержащими по 200 пмоль нефосфолирированных олигонуклеотидов (V-1, V-15). Далее проводилась денатурация олигонуклеотидов при температуре 95 °С в течении 5 минут и отжиг при медленном охлаждении до комнатной температуры.

Лигирование олигонуклеотидов проводилось при 4 °С в течении 24 часов в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл 5 мМ ATФ, 2 мкл 10х буфера для Т4-ДНК-лигазы и 5 ед. Т4-ДНК-лигазы (Fermentas, #EL0014).

· Амплификация

Амплификацию синтезированного гена проводили с помощью полимеразной цепной реакции в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей в качестве матрицы 10 нг лигазной смеси, 0,2 мкмоль каждого праймера (PR-1, PR-2), 5 мкл 10 буфер для Taq-ДНК-полимеразы, dNTP (каждый в концентрации 0,4 мМ), 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Инкубацию проводили в ДНК-амплификаторе в следующем режиме: 1) денатурация 40 сек. при 93°С, отжиг 40 сек. при 58°С, элонгация 30 сек. при 72°С (5 циклов), 2) денатурация 30 сек. при 93°С, отжиг 30 сек. при 60°С, элонгация 30 сек. при 72°С (24 цикла). Продукт ПЦР очищали при помощи набора для очистки ПЦР-продуктов MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, #27106).

· Молекулярное клонирование

- Ферментативный гидролиз эндонуклеазами рестрикции проводили в 20 мкл инкубационной смеси содержащей: 2 мкл буфера 10X Buffer Tango™ (Fermentas), по 10 ед. каждой рестриктазы (NcoI и XhoI), 1 мкг плазмидного вектора pET23d(+), 15 мкл воды. Реакцию проводили в течении 1,5 часов при 37°С.

- Лигирование проводили в 20 мкл инкубационной смеси содержащей: 2 мкл буфера для ДНК-лигазы фага Т4, 2 мкл 5 мМ ATФ, 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и 10 мг вектора pET23d(+) обработанного соответствующими рестриктазами, 5 мг очищенного ПЦР продукта. Реакционную массу оставляли на ночь при +4°С.

· Выделение и очистка плазмидной ДНК

Очистка плазмидной ДНК проводилась с использованием набора DNA Purification System (Promega), по протоколу фирмы изготовителя. Далее очищенная плазмидная ДНК pER-VEGF₁₆₅ использовалась для трансформации компетентных клеток.

· Приготовление компетентных клеток и их трансформация.

Получение компетентных клеток: Порцию YT-бульона (50 мл) засевали 0,25 мл ночной культуры штамма ER2566 и выращивали при 37°С с аэрацией до величины A₅₅₀ 0,5 - 0,7. Полученную суспензию охлаждали во льду 10 мин (все последующие операции проводили при температуре около 0°С) и центрифугировали в стерильных стаканах 15 мин при 4000g при 4°С. Осадок суспендировали в 25 мл 0,1 М хлорида кальция, инкубировали 0,5 ч, центрифугировали и затем суспендировали в 5 мл 0,1 М хлорида кальция, содержащего 20% глицерина. Суспензию компетентных клеток расфасовывали по 0,2 мл и хранили при -70°С.

Трансформация клеток: Суспензию компетентных клеток E.coli штамма ER2566 (200 мкл) размораживали во льду и добавляли 0,002 г плазмиды pER-VEGF₁₆₅. Инкубировали во льду 1 ч, затем выдерживали 2 мин при 42°С (тепловой шок), далее помещали в лед на 10 мин, добавляли 5 мл YT-бульона и инкубировали 1 ч при 37°С со встряхиванием. Суспензию рассевали на селективные чашки (Аmр 100 мкг/мл) с YT-агаром, и помещали на инкубацию при 37⁰С на 12 часов.

· Приготовление лизатов клеток для белкового электрофореза:

Выросшие колонии клеток ER2566 с рекомбинантной плазмидой pER VEGF₁₆₅ переносили в 3 мл среды LB, содержащей Аmр (50 мкг/мл) и выращивали при 37°С до величины А₆₀₀ 0,5, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ, инкубировали 4 ч при 37°С. Клетки отделяли центрифугированием (1 мин, 10000g), ресуспендировали в буфере для приготовления образцов и подвергали ультразвуковой обработке (22 кГц, 3-5 с). Аликвоты (4 мкл) наносили на электрофорез, предварительно прогрев на кипящей водяной бане в течение 10 мин, для электрофоретического разделения в денатурирующих условиях.

· Белковый электрофорез клеточных лизатов

Электрофорез клеточных лизатов клонов в денатурирующих условиях проводили в системе LKB (Швеция). Использовали двуступенчатый гель: верхний (концентрирующий) - 3.5% ПААГ в буфере UTB, нижний (разделяющий) - 15% ПААГ в буфере LTВ. В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор “PageRuler Protein Prestained Ladder" (Fermentas) c молекулярными массами : 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17, 11 кДа.

Размеры гелей составляли 9120,05 см. Денатурирующий белковый электрофорез проводили в 1 трис-глициновом буфере с SDS при постоянной силе тока 22 мА. Электрофорез вели до тех пор, пока бромфеноловый синий не достигал конца геля. После электрофореза гель помещали на 5-10 мин в фиксирующий раствор (20% уксусная кислота, 50% этанол), затем в течение 10-20 мин прокрашивали водным раствором, содержащим 0.2% кумасси R-250, 10% уксусной кислоты, 10% изопропанола при 60°С. Гель отмывали 5% раствором уксусной кислоты.

Результаты и обсуждение

Синтез искусственного гена VEGF₁₆₅

Аминокислотная последовательность был взята из статьи Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003 Jun;9(6):669-76. [37]. Последовательность представлена на рис.8.

Оптимизация кодонов последовательности гена VEGF 165 для эффективной прокариотическиой экспрессии была проведена в соответствии с данными, представленными в базе данных "Codon-Usage Database" для Escherichia coli [http://www.kazusa.or.jp/codon/]

Рис.8 Аминокислотная и нуклеотидная последовательность VEGF₁₆₅. полужирным шрифтом выделены триплеты нуклеотидов, под ними трёхбуквенные обозначения аминокислот.

Синтез искусственного гена VEGF₁₆₅ осуществляли химико-ферментативным способом из перекрывающихся олигонуклеотидов, составляющих структуру цепей полинуклеотидного дуплекса. Ниже приведена схема расположения и нумерация олигонуклеотидов (Рис.9).

Рис.9 Схема синтеза искусственного гена VEGF₁₆₅

Предварительно нами было проведено ферментативное фосфорилирование полинуклеотидкиназой фага Т4 олигонуклеотидов за исключением концевых V-1 и V-15. Последующим отжигом и лигированием ДНК-лигазой фага Т4 олигонуклеотидов (V-1 - V-28), получили искусственный ген VEGF₁₆₅.

Амплификацию лигазной смеси проводили при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами PR-1 и PR-2, содержащими сайты рестриктаз NcoI и XhoI соответственно. Очистка ПЦР-продукта осуществлялась с помощью набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, #27106) (Рис 10).

Рис. 10. Электрофореграмма продуктов ПЦР.

Дорожка №1 t отжига праймеров 60^оC

Дорожка №2 t отжига праймеров 58^оC

В качестве экспрессионного вектора был выбран плазмидный вектор pET-23d(+). Данный вектор содержит в полилинкерной последовательности сайты рестрикции NcoI (ccatgg) и XhoI (ctcgag), по которым и была произведена вставка амплифицированного гена VEGF₁₆₅ с учетом корректной рамки считывания (Рис.11)



Рис.11 а) Схема получения плазмиды pER VEGF₁₆₅

б) Полилинкерная последовательность плазмиды pET23d(+)

После расщепления эндонуклеазами рестрикции NcoI и XhoI вектор лигировали с очищенным продуктом ПЦР, обработанным теми же рестриктазами. В результате чего была получена рекомбинантная плазмида pER VEGF₁₆₅.

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.coli ER2566. Суспензию трансформированных клеток рассевали на чашки с селективной средой. Клоны, полученные при высевании трансформированных клеток на агаризованную среду с добавлением ампициллина, пересевали в жидкую среду с добавлением ампициллина для выращивания и отбора рекомбинантов.

Отбор рекомбинантов осуществляли по результатам электрофореза клеточных лизатов клонов в ПААГ представленного на рис. 12.

Рис.12 Электрофореграмма суммарных клеточных лизатов различных клонов.

Номер дорожки на геле соответствует номеру клона. №1- маркер масс.

Для последующей работы были отобраны клоны №2, №3, №4. Выделение плазмиды для последующей трансформации компетентных клеток E.сoli ER2566 осуществлялось из отобранных клонов с помощью набора Promega (по протоколу производителя). Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы по методу Сенгера (в компании Евроген). Анализ нуклеотидной последовательности плазмиды pER VEGF₁₆₅ подтвердил правильность вставки гена VEGF₁₆₅.

Полученные клетки штамма-продуцента высевались на питательную среду для определения оптимального времени продуцирования целевого продукта.

Результаты данного эксперимента после индуцирования штамма-продуцента представлены на электрофореграмме (15% SDS-ПААГ) на рис. 13.

На основе полученной электрофореграммы сделали вывод об оптимальности четырёх часовой инкубации клеточной культуры после индуцирования ИПТГ.

Выводы

1. Осуществлен химико-ферментативный синтез гена белка VEGF₁₆₅, и клонирование в экспрессирующий вектор pET23d(+).

2. Получен высокоэффективный штамм-продуцент E.coli (ER2566)/pERVEGF₁₆₅, продуцирующий рекомбинантный сосудистый эндотелиальный фактор роста.

Список литературы

1. Los M, Roodhart JM, Voest EE (April 2007). "Target practice: lessons from phase III trials with bevacizumab and vatalanib in the treatment of advanced colorectal cancer". The Oncologist 12 (4): 443-50. doi: 10.1634/theoncologist. 12-4-443. PMID 17470687.

2. Growth factor at Dorland's Medical Dictionary.

3. Goustin A.S. Leof E.B. Shipley G.D., Moses H.L. Growth factors and cancer. Cancer Res. 1986 Mar;46(3):1015-29.

4. Марри Р. и др. Биохимия человека. М., 2010.

5. Stoker M, Gherardi E. Regulation of cell movement: the motogenic cytokines. Biochim. Biophys. Acta 1072 ( 1991 ), 81

6. Deuel T.F. Polypeptide growth factors: roles in normal and abnormal cell growth. Annu Rev Cell Biol. 2007;3:443-92.

7. Datto, M.B., Hu, P.P., Kowalik, T.F., Yingling, J., and Wang, X.F. (1997) Mol. Cell. Biol., 17, 2030-2037.

8. Cross M, Dexter T.M. Growth factors in development, transformation, and tumorigenesis. Cell. 1991 Jan 25;64(2):271-80.

9. Коган А. Х. Патофизиология опухолей М., 1991

10. Reddi AH, Reddi A (2009). "Bone morphogenetic proteins (BMPs): from morphogens to metabologens". Cytokine & growth factor reviews 20 (5-6): 341-2. doi:10.1016/j. cytogfr.2009.10.015. PMID 19900831

11. Carpenter G, Cohen S (May 1990). "Epidermal growth factor". The Journal of Biological Chemistry 265 (14): 7709-12. PMID 2186024.

12. Siren AL et al. (2001). "Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress". Proc Natl Acad Sci USA 98 (7): 4044-4049. doi:10.1073/pnas. 051606598. PMC 31176. PMID 11259643.

13. Finklestein S.P., Plomaritoglou A. (2001). "Growth factors". In Miller L.P., Hayes R.L., eds. Co-edited by Newcomb J.K.. Head Trauma: Basic, Preclinical, and Clinical Directions. New York: Wiley. pp. 165-187. ISBN 0471360155.

14. Sallerfors B, Olofsson T (1993). "Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) secretion by adherent monocytes measured by quantitative immunoassays". Eur. J. Haematol. 49 (4): 199-207.

15. Nakamura T (1992). "Structure and function of hepatocyte growth factor.".Prog. Growth Factor Res. 3 (1): 67-85.doi:10.1016/0955-2235(91)90014-U.PMID 1838014.

16. Cohen P, Peehl DM, Lamson G, Rosenfeld RG (2013). "Insulin-like growth factors (IGFs), IGF receptors, and IGF-binding proteins in primary cultures of prostate epithelial cells". Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 73 (2): 401-7. doi:10.1210/jcem-73-2-401. PMID 1713219.

17. Hannink M, Donoghue DJ (1989). "Structure and function of platelet-derived growth factor (PDGF) and related proteins".Biochim. Biophys. Acta 989 (1): 1-10. PMID 2546599.

18. Luetteke NC, Lee DC (1991). "Transforming growth factor alpha: expression, regulation and biological action of its integral membrane precursor". Semin. Cancer Biol. 1 (4): 265-75. PMID 2103501.

19. Khalil N (1999). "TGF-beta: from latent to active". Microbes Infect1 (15): 1255-63. doi:10.1016/S1286-4579(99)00259-2.PMID 10611753.

20. Dowlati Y, Herrmann N, Swardfager W, Liu H, Sham L, Reim EK, Lanctфt KL (2010). "A meta-analysis of cytokines in major depression". Biol Psychiatry 67 (5): 446-457.

21. Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev. 1997 Feb;18(1):4-25. PMID:9034784

22. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocr Rev. 2004 Aug;25(4):581-611. PMID:15294883 doi:10.1210/er. 2003-0027.

23. Robinson CJ, Stringer SE. The splice variants of vascular endothelial growth factor (VEGF) and their receptors. J Cell Sci. 2001 Mar;114(Pt 5):853-65. PMID:11181169.

24. Muller YA, Christinger HW, Keyt BA, de Vos AM. The crystal structure of vascular endothelial growth factor (VEGF) refined to 1.93 A resolution: multiple copy flexibility and receptor binding. Structure. 1997 Oct 15;5(10):1325-38

25. Muller YA, Li B, Christinger HW, Wells JA, Cunningham BC, de Vos AM. Vascular endothelial growth factor: crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jul 8;94(14):7192-7. PMID:9207067.

26. Bates DO, Cui TG, Doughty JM, Winkler M, Sugiono M, Shields JD, Peat D, Gillatt D, Harper SJ. VEGF165b, an inhibitory splice variant of vascular endothelial growth factor, is down-regulated in renal cell carcinoma. Cancer Res. 2002 Jul 15;62(14):4123-31.

27. B. A. Keyt, L. T. Berleau, H. V. Nguyen, H. Chen, H. Heinsohn, R. Vandlen, N. Ferrara. The Carboxy-terminal Domain (111-165) of Vascular Endothelial Growth Factor is Critical for its Mitogenic Potency. J. Biol. Chem., 2010. 271, 7788-7795.

28. John S. Penn (11 March 2008). Retinal and Choroidal Angiogenesis. Springer. pp. 119-. ISBN 9781402067792. Retrieved 26 June 2010.

29. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK10107/

30. Burri, PH; Hlushchuk, R; Djonov, V (2004). "Intussusceptive angiogenesis: its emergence, its characteristics, and its significance". Dev Dyn. 231 (3): 474-88. doi:10.1002/dvdy.20184. PMID 15376313.

31. Keyt BA, Nguyen HV, Berleau LT, Duarte CM, Park J, Chen H, Ferrara N. Identification of vascular endothelial growth factor determinants for binding KDR and FLT-1 receptors. Generation of receptor-selective VEGF variants by site-directed mutagenesis. J Biol Chem. 1996 Mar 8;271(10):5638-46. PMID:8621427.

32. Pieren M, Prota AE, Ruch C, Kostrewa D, Wagner A, Biedermann K, Winkler FK, Ballmer-Hofer K. Crystal structure of the Orf virus NZ2 variant of vascular endothelial growth factor-E. Implications for receptor specificity. J Biol Chem. 2006 Jul 14;281(28):19578-87. Epub 2006 May 3. PMID:16672228 doi:10.1074/jbc.M601842200

33. W. J.Fairbrother, M. A. Champe, H. W. Christinger, B.A. Keyt, M. A Starovasnik, Solution structure of the heparin-binding domain of vascular endothelial growth factor. Structure 1998, 15; 6(5), 637-48.

34. Reviews: VEGF receptor signalling - in control of vascular function (Anna-Karin Olsson, Anna Dimberg, Johan Kreuger and Lena Claesson-Welsh).

35. Koch A.E., Harlow L.A., Haines G.K., Amento E.P., Unemori E.N., Wong W.L., Pope R.M. and Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. A cytokine, modulating angiogenesis in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 2014. 152, 4149-4156.

36. Folkman J. and Klagsbrun M. Angiogenic factors (review). Science. 2009. 235, 442-447.

37. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003 Jun;9(6):669-76.

Размещено на Allbest.ru