Под термином "культура тканей и клеток растений" понимают выращивание in vitro изолированной клетки, ее отдельных структур, различных тканей, частей и органов растений в стерильных условиях на искусственных питательных средах. Метод культуры клеток и тканей растений основан на уникальном свойстве растительных клеток - тотипотентности. Согласно этому свойству, любая, даже высокоспециализированная клетка содержит полный объем генетической информации о структуре и функциях целого организма [11]. А потому, из одной клетки, путем дифференциации можно получить полноценное растение - регенерант. Дедифференциация составляет физиологическую основу культуры ткани высших растений, так как введение ткани в культуру означает, прежде всего, то, что произошло индуцирование клеточных делений в тканях различной степени дифференциации. Получением целого растения - регенеранта в культуре ткани цикл клеточных превращений замыкается. При выборе материала предпочтение отдают меристематическим тканям и органам, поскольку их клетки активно делятся и удобны для культивирования, легче выживают в культуре, обладают большей скоростью роста, в большей степени проявляют тотипотентность. Значительно труднее создать контролируемые условия для выращивания дифференцированных тканей, закончивших рост, а также яйцеклеток, зиготы, зародышей, ранних этапов эмбриогенеза. Регенерацию растений из культуры тканей можно достичь, используя один из трех методов: культуру зародышей, соматический эмбриогенез и органогенез. Культура зародышей - представляет собой стерильную культуру зиготических зародышей. Развитие и прорастание зародыша происходит на питательной среде так же, как это было и в семени [3].

Другой механизм образования регенерантов - через соматический эмбриогенез. Соматический или неполовой эмбриогенез представляет собой процесс формирования зародышевых структур из соматических клеток. Соматический зародыш - это независимая двухполюсная структура, физически не прикрепленная к ткани, из которой происходит. В дальнейшем такие зародыши развиваются и прорастают в регенеранты через стадии, тем, что встречаются при развитии зиготы [39].

Формирование растений in vitro путем органогенеза состоит в появлении и росте побегов, корней или других органов из культивируемых клеток растений. Для регенерации целого растения таким способом обычно вызывают формирование побегов in vitro. Полученные побеги переносят на среду для укоренения. В результате образуется растение - регенерант. Опыт экспериментальной и практической работы показывает, что генетически наиболее стабильны организованные меристемы. Поэтому, регенерация растений через развитие побегов из пазушных почек является основой для промышленного клонального размножения многих растений [3]. Для получения культивируемых in vitro тканей и регенерантных растений различными исследователями были разработаны и предложены 10 разнообразных питательных сред - Уайта [53], Готре [36], Нича [47], Мурасиге и Скуга [45], Хеллера [38], Гамборга [35] и др.

1.3 Гормональная регуляция в культуре ткани

Общие сведения о влиянии гормонов

Исследования гормональной регуляции жизни растений является одной из центральных задач мировой физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений. Это объясняется тем, что вся жизнь растительных организмов, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и кончая отмиранием и смертью, происходит под контролем фитогормонов. Кроме того, фитогормоны играют важную роль в реакции растений на внешние воздействия и в формировании устойчивости растений к экстремальным условиям [1].

Химическая основа действия фитогормонов в растительных клетках еще недостаточно изучена. В настоящее время полагают, что одна из точек приложения их действия близка к гену и гормоны стимулируют здесь образование специфичной информационной РНК. Эта РНК, в свою очередь, участвует в качестве посредника в синтезе специфичных ферментов - соединений белковой природы, контролирующих биохимические и физиологические процессы [26, 31].

В настоящее время активно исследуются следующие группы фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизовая кислота и этилен. Кроме того, в последнее время в растениях открыты также стероидные гормоны, салициловая и жасминовые кислоты, отвечающие всем критериям фитогормонов [24, 29].

Все фитогормоны объединяют некоторые общие свойства: они синтезируются в самом растении и являются высокоэффективными регуляторами физиологических программ. Их действие проявляется в крайне низких концентрациях (10^-5 - 10^-12 М) ввиду исключительно высокой чувствительности к ним растительных клеток. С помощью фитогормонов одни типы клеток и тканей растений регулируют физиологические процессы в других типах клеток и тканей [14].

К числу физиологических программ, регулируемых фитогормонами, относится развитие и созревание семян, их прорастание, рост и морфогенез растений, переход растений к цветению, плодоношение, старение растений, опадение листьев, покой клубней, почек, семян и многое другое [6].

В последние годы наука достигла больших успехов в понимании того, как гормоны регулируют жизнь растений, вызывая переключение генетических программ, определяющих последовательность этапов развития, а также ответ растений на внешние воздействия [11]. Постулировано общее свойство классических фитогормонов: синтезируясь в одних частях растения и транспортируясь в другие его части, они оказывают влияние на многие процессы, в том числе морфогенетического характера. Установлено, что между фитогормонами существуют многообразные связи [18, 32]. Действие всех фитогормонов на растение весьма поливалентно: все они действуют на рост и деление клеток, на процессы старения и адаптации, на транспорт веществ, дыхание, синтез нуклеиновых кислот и белков и на многие другие процессы. Показано, что существенными факторами для эффективного действия гормонов являются, с одной стороны, концентрация гормона, достигшего специфических клеток - "мишеней", с другой - компетентность растительных тканей [28, 29]. Все, что известно сегодня о механизме действия фитогормонов, крайне важно для того, чтобы понять, как происходит рост и развитие растений, то есть как реализуется их онтогенетическая программа, а также как растение реагирует на стрессы в течение своей жизни. Эти знания крайне важны для решения практических задач сельского хозяйства и биотехнологии, то есть для получения полезных продуктов растительного происхождения в поле, в лаборатории и в заводских условиях [4, 13].

Гуминовые кислоты

Гуминовые кислоты - органические вещества, извлекаемые из природных продуктов (торф, бурый уголь, каменный уголь) водными растворами щелочей. Сложная смесь соединений разного состава, свойств и строения, переходящая в воду из природных продуктов, таких как торф, бурый уголь, каменный уголь. Гуминовые кислоты влияют на органолептические свойства воды (запах, цвет), ускоряют коррозию металла, оказывают отрицательное влияние на развитие водных микроорганизмов, влияют на химический состав воды (снижают содержание кислорода, влияют на ионные и фазовые равновесия). При нейтрализации образующихся при этом растворов солей (гуматов) гуминовые кислоты выпадают в виде темноокрашенного объемистого осадка. Из осадка могут быть выделены фульвокислоты, которые переходят в водный раствор после его подкисления (15% в торфах и до 45% в окисленных углях).

По химической структуре гуминовые кислоты - высокомолекулярные конденсированные ароматические соединения (молекулярная масса = 1300-1500), в которых установлено наличие фенольных гидроксилов, карбоксильных, карбонильных и ацетогрупп, простых эфирных связей и др. Элементный состав: углерод - 50-70%, водород - 4-6%, кислород - 25-35%, азот - 3-5%. Обязательно входят сера - 0,7 - 1,2% и фосфор - 0,5%. Всегда есть разные металлы, хотя трудно сказать, обязательны ли они для гуминовых веществ или просто являются примесью, поскольку очистить гуминовые вещества нелегко.

Гуминовые субстанции, как органические компоненты индивидуальной природы, ускоряют превращение различных микроэлементов в формы непосредственно доступные растениям.

На сегодняшний день доступно множество исследований, в которых показана возможность реакций ауксинового типа в присутствии гуминовых субстанций. Кроме того, в нескольких работах четко установлено, что гуминовые субстанции увеличивают степень прорастания семян и увеличивают содержание витаминов в растениях [51].

Лиеске [54] сообщает, что гуминовые кислоты и их производные увеличивают проницаемость клеточных мембран в растении, увеличивая тем самым способность вбирать питательные вещества. Многими учеными был обнаружен положительный эффект оказываемый гуминовыми кислотами на размножение различных групп микроорганизмов. Они приписывают это свойство железу, которое присутствует в гуминовых кислотах или их коллоидной природе, кроме того, не исключается возможность того, что гуминовые субстанции являются органическими катализаторами [5].

Гуминовые кислоты в небольших количествах действуют как специфические сенсибилизирующие агенты, увеличивающие проницаемость плазмы, что приводит к увеличенному забору питательных веществ растениями. В больших объемах гуминовые кислоты являются источником доступного железа [46].

В последнее время вышло много работ, в которых продемонстрирован положительный эффект оказываемый гуминовыми кислотами на растения. Это влияние хорошо заметно как во внешнем виде растений, так и во внутренних биохимических процессах. Необходимо провести дополнительные исследования, для того, чтобы установить, каким образом производить и применять гуминовые удобрения. Основные принципы, полученные из теоретических аргументов, следующие: наличие в удобрениях субстанций хиноидной природы оказывает стимулирующее влияние на растения; способность гуминовых субстанций к мелкодисперсной растворимости в воде приводит к повышенной способности их проникновения в растения. Небольшие количества гуминовых удобрений не могут использоваться в качестве основного удобрения, они оказывают стимулирующий эффект только в том случае, когда присутствует необходимое количество основных питательных элементов, азота, фосфора и калия [12].

Интерес к применению различных органических удобрений продолжает увеличиваться. Очевидно, это вызвано следующими причинами:

Интерес в уменьшении применения минеральных удобрений;

Общественная обеспокоенность тем фактом, что химическая промышленность очень сильно загрязняет окружающую среду;

Увеличивающаяся необходимость в консервировании энергии.

Механизм формирования угля через стадию торфа обычно объясняется следующим образом: сначала торф превращается в лигнит, затем в смолистый уголь и наконец в антрацит. Происходит все это при высоких температурах, которые приводят к фракционной дистилляции. Коричневый уголь или, как его еще называют, лигнит сильно варьирует как по своим физико-химическим свойствам, так и по наличию различных гуминовых кислот, в зависимости от места залегания. Изучение химических процессов вовлеченных в формирование угля привело к различным гипотезам рассматривающим "гуминовые кислоты", "ульминовые кислоты", "гумины", "ульмины" и "фульвокислоты". Сейчас принято считать, что микроорганизмы отыграли решающую роль при формировании угля [51].

Количество органического вещества необходимого для внесения в почву было установлено уже давно. Однако химия и основы органического вещества стали предметом науки в 18 столетии. До Либиха считали, что гумус используется растениями непосредственно, но, после того как он показал, что рост растений зависит от неорганических компонентов, многие почвоведы стали считать удобрение органикой полезным только в случае полного разложения последней в неорганические формы.

В то же время многие из почвоведов придерживались мнения о том, что основное влияние гумуса на растения проявляется благодаря его повышенной способности удерживать влагу в почве. Затем в нескольких научных работах было показано, что растения способны абсорбировать комплексные органические молекулы системных инсектицидов, после этого уже никто не сомневался в способности растений абсорбировать растворимые формы гумуса.

Из гумусной золи, гуминовая фракция вытягивается кислотой, которая оставляет желтый осадок на поверхности. Последний представляет из себя фульво-фракцию. Ульминовой кислотой называется фракция гумуса, которую можно извлечь алкалоидом [46].

Недавние исследования, проведенные при помощи хроматографических, спектрофотометрических и рентгеновских методов многое прояснили в строении органических веществ, присутствующих в гумусе. Интенсивно исследовались реакции катионного и анионного обменов. Однако очень мало внимания уделялось изучению связей между химией и атрибутами почвенного плодородия: буферизации, образованию питательных элементов и гормональным эффектам из того же источника.

Гуминовые кислоты являются коллоидами и ведут себя подобно глине, но принято считать, что они кислоты, и образуют настоящие соли. Когда в гуминовой молекуле преобладают ионы водорода, материал предполагается кислотой и называется соответственно. Однако особого влияния на уровень рН не оказывается, поскольку эти кислоты нерастворимы в воде. Когда в молекуле преобладают катионы, отличающиеся от водорода, материал называют гуматом. Гуматы моновалентных щелочных металлов растворимы в воде, мультивалентные нерастворимы. Различные катионы оказывают малозаметное влияние на гуминовые молекулы, в смысле их растворимости и способности абсорбироваться в глинах [5].

В последние годы ученые выявили общие биохимические и экологические функции гуминовых веществ и их влияние на развитие растений. Среди важнейших можно выделить следующие:

· Аккумулятивная - способность гуминовых веществ накапливать долгосрочные запасы всех элементов питания, углеводов, аминокислот в различных средах;

гормональный гуминовая кислота пшеница

· Транспортная - образование комплексных органоминеральных соединений с металлами и микроэлементами, которые активно мигрируют в растения;

· Регуляторная - гуминовые вещества формируют окраску почвы и регулируют минеральное питание, катионный обмен, буферность и окислительно-восстановительные процессы в почве;

· Протекторная - путем сорбции токсичных веществ и радионуклидов гуминовые вещества предотвращают их поступление в растения.

Совмещение всех этих функций обеспечивает повышенные урожаи и необходимое качество с/х продукции. Особенно важно подчеркнуть положительный эффект от действия гуминовых веществ при неблагоприятных условиях воздействия среды: низкие и высокие температуры, недостаток влаги, засоление, скопление ядохимикатов и наличие радионуклидов. Неоспорима роль гуминовых веществ и как физиологически активных веществ. Они изменяют проницаемость клеточных мембран, повышают активность ферментов, стимулируют процессы дыхания, синтеза белков и углеводов. Они увеличивают содержание хлорофилла и продуктивность фотосинтеза, что в свою очередь создает предпосылки получения экологически чистой продукции. При сельскохозяйственном использовании земли необходимо постоянное пополнение гумуса в почве для поддержания необходимой концентрации гуминовых веществ [54].

До настоящего времени это пополнение осуществлялось в основном путем внесения компостов, навоза и торфа. Однако поскольку содержание собственно гуминовых веществ в них относительно невелико, то нормы их внесения очень велики. Это увеличивает транспортные и другие производственные издержки, которые многократно превышают стоимость самих удобрений. Кроме того, в них содержатся семена сорняков, а также болезнетворные бактерии (для навоза и компостов).

Для получения высоких и устойчивых урожаев недостаточно надеяться на биологические возможности сельскохозяйственных культур, которые, как известно, используются лишь на 10-20%. Конечно необходимо использовать высокоурожайные сорта, эффективные приемы агро - и фитотехники, удобрения, но уже нельзя обойтись и без регуляторов роста растений, которые к концу двадцатого века играют уже не менее важную роль, чем пестициды и удобрения [51].

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Описание объекта

2.2 Получение стерильных растений пшеницы in vitro