2.4 Секвенирование последовательности 18S рДНК

Секвенирование осуществляли на автоматическом лазерном секвенаторе ABI Prism 3130. Реакцию секвенирования проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей около 10 нг 18S рДНК, 1 пкМ праймера и 1 мкл BigDie Terminator v. 3.1. Секвенирование полноразмерной последовательности осуществляли с использованием праймеров М13 (-20) и внутренних праймеров (см. табл. 1). Условия реакции были следующими: 96°С-1мин, затем 25 циклов: 96°С-30 сек, 50°С-15 сек, 60°С-4 мин. Очистка включала осаждение ацетатом натрия и изопропанолом и последующую отмывку 96% этанолом. Перед секвенированием в пробирку с высушенным продуктом добавляли 13 мкл Hi-Di формамида, смесь затем подвергали двухминутной денатурации при 94°С.

2.5 Обработка данных секвенирования 18S рДНК

Сборку и выравнивание последовательностей гена 18S рРНК, а также расчет генетических дистанций проводили с использованием пакета программ Mega v. 4 (Kumar et. al., 2004). Расчет параметров разнообразия и генетической структуры популяций проводили с помощью программы DnaSp v. 5.

Уровень гаплотипического (аллельного) разнообразия рассчитывался как отношение числа гаплотипов (аллелей) к общему числу последовательностей.

Среднее число попарных различий рассчитывалось по формуле (Tajima, 1983):

, где

d_ij - количество мутаций, произошедших с момента дивергенции шаплотипов i и j;

h - число гаплотипов;

p_i - частота гаплотипа i, p_j - частота гаплотипа j;

n - размер выборки

Нуклеотидное разнообразие рассчитывалось по формуле (Tajima, 1983):

, где

d_ij - количество мутаций, произошедших с момента дивергенции шаплотипов i и j;

h - число гаплотипов;

p_i - частота гаплотипа i, p_j - частота гаплотипа j;

n - размер выборки;

L - количество локусов (сайтов);

2.6 Тесты для псевдогенов

Потеря функциональных ограничений и ослабленное действие отбора на псевдогенные последовательности, теоретически, может выражаться в повышении скоростей их эволюции. Это предположение мы попытались проверить при помощи двукластерного теста (Takezaki et al.,1995). Принцип этого теста состоит в проверке равенства средних частот замен для двух кластеров, образованных узлом (точкой ветвления) данного древа. Обозначим эти кластеры как А и В, а образующих их узел - N. Остальные последовательности можно обозначить как С. Тогда среднее количество наблюдаемых (оцененных) замен на сайт (дистанция) от узла N до концов кластеров А и В будет обозначено как b_A и b_B, соответственно. Если предположить постоянство частот замен, то ожидаемое различие () между b_A и b_B будет нулевым. Пусть L_AB, L_AC и L_BC - средние дистанции между кластерами А и В, А и С и В и С, соответственно. Тогда:

D_ij - расстояние между последовательностями i и j, n_A, n_B и n_c - количество последовательностей, входящих в кластеры А, В и С, соответственно.

Отсюда:

Следовательно, или . Если скорость эволюции кластера А медленнее, чем В, значение будет отрицательным.

Отклонение от нуля можно проверить при помощи двуконцевого (two-tailed) теста нормальных отклонений, используя статистическую величину Z.

Чтобы отклонить гипотезу о постоянстве скоростей нуклеотидных замен на уровне достоверности в 5%, значение Z должно быть больше или равным 1,96. Необходимо отметить, что для увеличения вероятности отклонения нулевой гипотезы о постоянстве скоростей, для внешней группы (кластер С) нужно выбирать близкородственные последовательности (Takezaki et al., 1995). Модификацией двукластерного теста является тест относительных скоростей (relative-rates test), предложенный Ли и Бускетом (Li, Bousquet, 1992) для двух поколений с одной последовательностью во внешней группе.

3. Результаты и обсуждение

Для оценки возможного числа аллельных вариантов гена 18S рРНК, PCR-продукты 1760 пн участка рибосомной ДНК амурского осетра и калуги были клонированы. Среди 22 аллельных вариантов A. schrenckii были различия по 16 однонуклеотидным и одной восьминуклеотидной вставкам, а также по 71 замене (52 транзиции и 19 трансверсий). 15 аллелей 18S рДНК H. dauricus отличались 14 однонуклеотидными и одной восьминуклеотидной вставками, а так же 58 заменами, из которых 40 транзиций и 18 трансверсий. Для сравнительного анализа полученных аллельных вариантов, наши данные были объединены с данными Генного банка по озерному осетру (Acipenser fulvescens) (GenBank).

Мутационные профили амурского осетра, калуги и озерного осетра имели выраженные отличия друг от друга (рис. 5). Основное отличие амурских видов от озерного осетра заключалось в меньшей доле транзиций. A. schrenckii отличался от А. fulvescens и калуги большим количеством делеций. Калуга отличалась от остальных видов большей долей вставок.

Рис. 5. Мутационные профили осетровых. Ts - транзиции, Tv - трансверсии, Ins - вставки, Del - делеции, Compl - мутации, включающие более трех нуклеотидов.

Анализ количества мутаций показал, что амурские виды отличаются от озерного осетра более низким количеством нуклеотидных замен в вариабельных и консервативных участках, в то время как число вставок и делеций близко по значению. Отличия между амурскими видами заключались в более высоком количестве нуклеотидных замен в консервативных и делеций в вариабельных участках (табл. 2).

Таблица 2. Количество нуклеотидных замен на одну последовательность

Af - Acipenser fulvescens; As - Acipenser schrenckii; Hd - Huso dauricus.

Анализ полиморфизма последовательностей 18S рДНК, оцененного по ряду критериев не показал значительных отличий между амурскими видами (табл. 3). Примечательно только то, что H. dauricus имеет более низкий показатель нуклеотидного разнообразия. У озерного осетра оказался самый высокий уровень полиморфизма.

Таблица 3. Полиморфизм последовательностей 18S рДНК трех видов осетровых рыб

n - число клонов, S - число полиморфных (сегрегирующих) сайтов, h - число гаплотипов, Pi - нуклеотидное разнообразие (SD - стандартное отклонение), k - среднее число нуклеотидных различий.

Анализ распределения нуклеотидных замен вдоль секвенированного гена 18S рРНК показал, что первая половина гена амурских видов менее изменчива, чем у североамериканского осетра (рис 6). Вторая половина гена у амурского и озерного осетра оказалась более изменчива по сравнению с калугой. Основная часть изменчивости приходится на вариабельные участки, консервативные участки обладали наибольшей изменчивостью у A. fulvescens чем у амурских видов, что также следует и из табл. 2.

Альтернативным источником внутригеномного полиморфизма рДНК может быть присутствие псевдогенных последовательностей, которые утрачивают свои функции, и как следствие имеют пониженные селективные ограничения и повышенную аккумуляцию мутаций. Недавно возможность присутствия псевдогенов 18S рРНК обсуждалось для североамериканских видов рода Acipenser (Krieger, Fuerst, 2002 2004). В этой связи мы провели филогенетический анализ клонированных последовательностей 18S рДНК осетровых рыб Амура с целью проверки взаимоотношений между полученными последовательностями.

Филогенетическое древо, построенное по методу ближайшего соседства (Neighbour-joining - NJ) дифференцировало имеющиеся последовательности на два кластера (рис. 7). В первый, компактный кластер, входили функциональные последовательности P. spathula и A. fulvescens (Af-7 и Af-13) и гомологичные им последовательности дальневосточных видов. Второй кластер был более гетерогенным и включал наиболее дивергированные последовательности озерного осетра и осетровых рыб Амура. Поскольку входящие в первый кластер последовательности веслоноса и североамериканских видов представляют собой функциональные, или близкие к таковым, копии гена 18S рРНК (Krieger, Fuerst, 2002), то содержащиеся в этом кластере последовательности амурского осетра и калуги также можно отнести к функциональным генам. Последовательности второго кластера, очевидно, представляют собой копии с ограниченными функциями и псевдогены, т.к. входящие в него клоны A. fulvescens являются предположительными псевдогенами (Krieger, Fuerst, 2002). Таким образом, эти две группы последовательностей мы условно назвали "генами" и "псевдогенами", соответственно.

Рис. 6. Графики распределения нуклеотидных замен у: A) A. fulvescens; B) A. schrenckii; C) H. dauricus. Консервативные участки обозначены сплошной линией, вариабельные - пунктирной. 1 - петля 530; 2 - спираль 27 (конформационный переключатель); 3 - P-сайт.

В целом количество мутаций у псевдогенных последовательностей оказалось в 2-4 раза больше, чем у предположительных генов, причем последние не имели, в отличие от псевдогенов, вставок и делеций в функционально-важных областях молекулы. Для псевдогенов правомерно ожидать более высокую изменчивость по сравнению с функциональным вариантом. Действительно, уровень нуклеотидного разнообразия 18S рДНК псевдогенов в группе видов был в 2-10 раз выше, чем у генов (табл. 4). Выявленные различия, требующие специального объяснения, нашли отражение в характере распределения нуклеотидного разнообразия генов и псевдогенов вдоль исследуемого фрагмента рДНК (рис. 8). Распределение нуклеотидного разнообразия у генов и псевдогенов вдоль исследуемого гена разительно отличается, причем изменчивость генов, как и следует ожидать для функциональных последовательностей, минимальна на всем анализируемом отрезке. Примечательно, что в обеих группах сравнения псевдогены сохранили относительно консервативным участок в области 1100-1200 нуклеотидов, включающей спираль 27 (см. рис. 8).

Таблица 4. Полиморфизм последовательностей предполагаемых генов и псевдогенов

n - число клонов, S - число полиморфных (сегрегирующих) сайтов, h - число гаплотипов, Pi - нуклеотидное разнообразие (SD - стандартное отклонение), k - среднее число нуклеотидных различий.

Рис. 7. NJ-филогенетическое древо аллельных вариантов гена 18S рРНК осетровых рыб. Цифры в узлах ветвления показывают уровень статистической поддержки.

Рис. 8. График распределения нуклеотидного разнообразия предполагаемых генов и псевдогенов осетровых рыб.

Чтобы оценить предполагаемые функциональные отличия между последовательностями рДНК первого и второго кластеров был проведен ряд дополнительных тестов. Теоретически потеря функциональных ограничений для псевдогенов определяет более высокие скорости их эволюции. Действительно, в группе видов тест относительных скоростей, основанный на генетических дистанциях двупараметрической модели Кимуры, показал, что для последовательностей кластера псевдогенов они значительно выше, чем для генов (0,016 и 0,0052, соответственно). Z_nS тест Келли (Kelly, 1997), базирующийся на неравновесии по сцеплению между сегрегирующими сайтами, для информативных вариабельных сайтов выявил более существенное отклонение от нейтральности для последовательностей кластера генов (Z_nS=0,11) по сравнению с псевдогенами (Z_nS=0,2885), что соответствует представлениям о разном селективном давлении на кодирующие и нефункциональные последовательности ДНК

Таким образом, в геномах осетровых рыб Амура обнаруживается значительная индивидуальная изменчивость последовательностей 18S рДНК, что указывает на наличие огромного резерва разнообразия этих видов на молекулярном уровне. Результаты исследований указывают, что феномен множественности аллелей ядерных генов 18S рРНК осетров распространяется и на дальневосточные виды, следовательно, механизмы согласованной эволюции у дальневосточных представителей Acipenseridae, подобно североамериканским, не реализуются в полной мере.

Точные причины высокой внутривидовой изменчивости 18S рДНК у осетровых рыб пока неизвестны. Полиплоидная природа их генома - наиболее вероятный фактор возникновения и поддержания множественности вариантов последовательности гена 18S рРНК (Krieger, Fuerst, 2002; 2004). Происхождение множественности вариантов последовательностей рДНК у осетровых рыб могло быть вызвано полиплоидизацией по двум причинам. Гибридизация могла внести разные аллели от разных родителей, или аллополиплоидизация могла увеличить число хромосом, а также кластеров рДНК по сравнению с предковыми формами (Krieger, Fuerst, 2004).Также множественность ЯОР и их локализация на разных хромосомах может влиять на механизмы согласованной эволюции (Campbell et al., 1997). К сожалению, сведения о количестве и локализации ЯОР изучаемых нами видов в литературе отсутствуют. Полагают, что низкие скорости молекулярной эволюции, обнаруженные у видов осетровых рыб, могут существенно влиять на эффективность механизмов согласованной эволюции (Krieger, Fuerst, 2004). Возможно, существует причинная связь между размером генома и обилием копий генов.

Выводы

1. Впервые получена полная последовательность гена 18S рРНК для двух видов осетровых рыб Амура Acipenser schrenckii и Huso dauricus.

2. Проанализирована изменчивость аллельных вариантов 18S рДНК.

3. Полноразмерная последовательность гена малой рибосомной субъединицы (1746 п. н.) позволяет более полно охарактеризовать выявленный уровень аллельного разнообразия по сравнению с использованным ранее 486 п. н. участком 18S рДНК.

4. Данные филогенетического анализа свидетельствуют о наличии в геномах осетровых рыб последовательностей с разной функциональной значимостью, условно названных генами и псевдогенами.

5. Наличие множественных нуклеотидных замен и вставок/делеций как в консервативных, так и в вариабельных участках вторичной структуры 18S рРНК подтверждает присутствие псевдогенов среди аллелей 18S рДНК.

6. Сравнение скоростей эволюции последовательностей генов и псевдогенов показало, что последние действительно имеют более высокую скорость накопления нуклеотидных замен и вставок/делеций.

Список литературы

1. Apples R., Gerlach W.L., Dennis E.S., Swift H., Peacock W.J. Molecular and chromosomal organization of DNA sequences coding for the ribosomal RNAs in cereals. // Chromosoma. 1980. Vol. 78. P. 293-311.

2. Arnheim N. Concerted evolution of multigene families // Evolution of genes and proteins. 1983. Sinauer, Sunderland, Mass. P. 38-61.

3. Arnheim N., Krystal M., Schmickel R., Wilson G., Ryder O., Zimmer E. Molecular evidence for genetic exchanges among ribosomal genes on nonhomologous chromosomes in man and apes. // Proceedings of the National Academy of Science, USA. 1980. Vol. 77. P. 7323-7327.

4. Bemis W.E., Findeis E.K., Grande L. An overview of Acipenseriformes // Evn. Biol. Fishes, 1997 Vol. 48 P. 25-71.

5. Birstein V.J. Is Acipenser medirostris one or two species? // Sturgeon Quarterly. 1993. Vol. 1 (2). P. 8.

6. Birstein V.J., DeSalle R. Molecular phylogeny of Acipenserinae. // Molecular phylogenetics and evolution. 1998. Vol. 9. P. 141-155.

7. Birstein V.J., Vasiliev V.P. Tetraploid-octoploid relationships and karyological evolution in the order Acipenseriformes (Pisces): karyotypes, nucleoli, and nucleolus-organizer regions in four acipenserid species. // Genetica. 1987. Vol. 73. P.3-12.

8. Blacklidge K.H., Bidwell C.A. Three ploidy levels indicated by genome quantification in Acipenseriformes of North America. // J. Hered. 1993. Vol. 84. P. 427-430.

9. Carlson D.M., Kettler M.K., Fisher S.E., Whitt G.S. Low genetic variability in paddlefish populations. // Copeia. 1982. Vol. 3. P. 721-723.

10. Carranza S., Giribet G., Ribera C., Baguna J., Riutort M. Evidence that two types of 18S rDNA coexist in the genome of Dugesia (Schmidtea) mediterranea (Platyhelminthes, Turbellaria, Tricladida). // Molecular Biology and Evolution. 1996. Vol. 13. P. 824-832.

11. Dame J.B., Sullian M., McCutchan T.F. Two major sequence classes of ribosomal RNA genes in Plasmodium berghei. // Nucleic Acids Research. 1984.Vol. 12. P. 5943-5952.

12. Dingerkus G., Howell W.M. Karyotypic analysis and evidence of tetraploidy in the North American paddlefish, Polyodon spathula. // Science. 1976. Vol. 194. P. 842-843.

13. Dingerkus G., Howell W.M. Karyotypic analysis and evidence of tetraploidy in the North American paddlefish, Polyodon spathula. // Science. 1976. Vol. 194. P. 842-843.

14. Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin ver. 3.1: An Integrated software package for population genetics data analysis // Switzerland: Institute of Zool. Comp. and Mol. Pop. Gen. Lab. (CMPG), 2006.-145p.

15. Fontana F. Chromosomal nucleolar organizer regions in four sturgeon species as markers of karyotype evolution in Acipenseriformes (Pisces). // 1994. Genome. Vol. 37. P. 888-892.

16. Gunderson J.H., Sogin M.L., Wollet G., Hollingdale M., de la Cruz V.F., Waters A.P., McCutchan T.F. Structurally distinct, stage-specific ribosomes occur in Plasmodium. // Science. 1987. Vol. 238. P. 933-937.

17. Hood L.E., Hunkapiller M.W., Smith L.M. Automated DNA sequencing and analysis of the human genome // Genomics. 1987. Vol. 1 (3). P. 201-212.

18. Kelly J.K. A test of neutrality based on interlocus associations. // Genetics. 1997. Vol. 146. P. 1197-1206.

19. Krieger J., Fuerst P.A. Characterization of nuclear 18S rRNA gene sequence diversity and expression in an individual lake sturgeon (Acipenser fulvescens) // J. Appl. Ichthyol. 2004. Vol. 20. P. 433-439.

20. Krieger J., Fuerst P.A. Evidence of multiple alleles of the nuclear 18S ribosomal RNA gene in sturgeon // J.Appl/ Ichthyol. 2002. Vol. 18. P. 290-297 c.

21. Krieger J., Fuerst P.A., Cavender T.M. Phylogenetic relationships of the North American sturgeons (Order Acipenseriformes) based on mitochondrial DNA sequences. // Mol. Phylo. Evol. 2000. Vol. 16 (1). P. 64-72.

22. Берг Л.С. Рыбы пресных вод СССР и сопредельных стран. Т. 1. Л.: Изд-во АН СССР. 1948. 468с.

23. Васильев В.П. Эволюционная кариология рыб. М.: Наука. 1985. 300 с.

24. Гриценко О.Ф., Костюнин Г.М. Амурский сиг Coregonus ussuriensis Berg и калуга Huso dauricus Georgi в сахалинских водах // Вопр. ихтиологии. 1979. Т. 19. Вып. 6. С. 1125-1128.

25. Крыхтин М.Л. Современное состояние и перспективы развития осетрового хозяйства в бассейне Амура. // В сб. Биолог. Основы развития осетрового хозяйства в водоемах СССР.М.: Наука. 1979. С. 68-74.

26. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479 с.

27. Никольский Г.В. 1956. Рыбы бассейна Амура. М.: Изд-во АН СССР

28. Черешнев И.А. Состав ихтиофауны и особенности распространения пресноводных рыб в водоемах Северо-Востока СССР. // Вопр. Ихтиологии. 1990 Т. 30 Вып. 5. С. 836-844.

29. Krieger J., Hett A.K., Fuerst P.A., Artyukhin E.N., Ludwig A. The molecular phylogeny of the order Acipenseriformes revisited. // J. Appl. Ichthyol. 2008. Vol. 24. P. 36-45.

30. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA 3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment // Brief. In Bioinformatics. 2004. Vol. 5 (2). P. 150-163.

31. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA 3: Integrated software for molecular eolutionary genetics analysis and sequence alignment // Brief. In Bioinformatics. 2004. Vol. 5. P. 150-163 c.

32. Li P., Bousquet J. Relative-rate test for nucleotide substitutions between two lineages // Mol. Biol.Evol. 1992. Vol. 9. P. 1185-1189.

33. Liao D., Concerted Evolution: Molecular Mechanism and Biological Implications. // Am. J. Hum. Genet. Am. J. Hum. Genet. 1999. 64:24-30 Vol.64. P.

34. Liefting L.W.,Anderson M.T., Beever R.E., Gardner R.C., Forster R.L. Sequence heterogeneity in the two 16S rRNA genes of Phormium yellow leaf phytoplasma. //Applied Environmental Microbiology. 1996. Vol. 62. P. 3133-3139.

35. Ludwig A. Identification of Acipenseriform species in trade. // J. Appl/ Ichthyol. 2008. Vol. 24. P. 2-19.

36. Mylvaganam S., Dennis P.P. Sequence heterogeneity between the the two genes encoding 16S rRNA from the halophilic Archaebacterium Haloarcula marismrtui. // Genetics. 1992. Vol. 130. P. 399-410.

37. Nei M, Gu X, Sitnikova T (1997) Evolution by the birth-anddeath process in multigene families of the vertebrate immune system. // Proc Natl Acad Sci USA. Vol. 94. P.7799-7806.

38. Ohno S., Muramoto J., Stenius C., Christian L., Kitterell W.A. Microchromosomes in holocephalian, chondrostean and holostean fishes. // Chromosoma. 1969. Vol. 226. P. 35-40.

39. Prober J.M., Trainor G.L., Dam R.J., Hobbs F.W., Robertson C.W., Zagursky R.J., Cocuzza A.J., Jensen M.A., Baumeister K. A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides // Science. 1987. Vol. 238. P. 336-341.

40. Qari S.H., Goldman I.F., Pieniazek N.J., Collins W.E., Lal A.A. Blood and sporozoite stage-specific small subunit ribisimal RNA-encoding genes of the human malaria parasite Plasmodium vivax. // Gene. 1994. Vol. 150. P. 43-49.

41. Quari S.H., Goldman I.F., Pieniazek N.J., Collins W.E., Lal A.A. Blood and sporozoite stage-specific small subunit ribosomal RNA-encoding genes of the human malaria parasite Plasmodium vivax. // Gene. 1994. Vol. 150. P. 43-49.

42. Reischel U., Feldman K., Naumann L., Gaugler B.J.M., Ninet B., Hirschel B., Emler S. 16S rRNA sequence diversity in Mycobacterium celatum strains caused by the presence of two different copies of the 16S rRNA gene. // Journal of Clinical Microbiology. 1998. Vol. 36. P. 1761-1764.

43. Ruiz-Martinez M.C., Berka J., Belenkii A., Foret F., Miller A.W., Karger B.L. DNA sequencing by capillary electrophoresis with replaceable linear polyacrylamide and laser-induced fluorescence detection // Anal. Chem. 1993. Vol. 65. P. 2851-2858.

44. Smith L.M., Sanders J.Z., Kaiser R.J., Hughes P., Dood C., Connell C.R., Heiner C., Kent S.B.H., Hood L.E. Fluorescence detection in automated DNA sequences analysis // Nature. 1986. Vol. 321. P. 674-679.

45. Tajima F. Evolutionary relationship of DNA sequences in finite populations // Genetics. 1983. V. 105 (2). P. 437-460.

46. Tajima F. Evolutionary relationship of DNA sequences in finite populations // Genetics. 1983. V. 105. P. 437-460.

47. Takezaki N., Rzhetsky A., Nei M. Phylogenetic Test of the Molecular Clock and Linearized Trees // Mol.Biol.Evol. 1995. Vol. 15. P. 17-22.

48. Vasil'eva E.D. Some morphological characteristics of Acipenserid fishes: considerations of their variability and utility in taxonomy. // Journal of Applied Ichthyology. 1999. Vol. 15. P. 32-34.

49. Wang Y., Zhang Z., Ramanan N. The Actinomycete Thermobispora bispora contains two distinct types of transcriptionally active 16S rRNA genes. // Journal of Bacteriology. 1997. Vol. 179. P. 3270-3276.

50. Waters A.P., Syin C., McCutchan T.F. Developmental regulation of stage-specific ribosome populations in Plasmodium. // Nature. 1989. Vol. 342. P

51. Yao M.-C., Gall J.G. A single integrated gene for ribosomal RNA in a eucaryote, Tetrahymena pyriformis. // Cell. 1977. Vol. 12. P. 121-132.

52. Yap W.H., Zhang Z., Wang Y. Distinct types of rRNA operons exists in the genome of the Actinomycete Thermomonospora chromogena and evidence for horizontal transfer of an entire rRNA operon. // Journal of Bacteriology. 1999. Vol. 181. P. 5201-5209.

53. Zhang J., Fang Y., Hou J.Y., Ren H.J., Jiang R., Roos P., Dovichi N.J. Use of non-cross-linked polyacrylamide for four-color DNA sequencing by capillary electrophoresis separation of fragments up to 640 bases in length in two hours // Anal. Chem. 1995. Vol. 67. P. 4589-4593.

Размещено на Allbest.ru