Сравнительное исследование микробных сообществ щелочных слабоминерализованных гидротерм Байкальской рифтовой зоны и щелочных минерализованных гидротерм озера Моно-Лейк на острове Паоха

Основные продукты брожения, ацетат и водород, используются терминальными деструкторами. Направление процесса терминальной деструкции контролируется содержанием сульфата. При содержании сульфата в среде в 16.6 мг/л (Октопус спринг) сульфатредукция не подавляет метаногенез, который развивается с высокой скоростью (Ward, 1978). Схожие результаты были получены в источниках с содержанием сульфата от 11.5 до 21.1 мг/л (Sandbeck, Ward. 1982). В источнике Термофильный с содержанием сульфата около 30 мг/л сульфатредукция доминировала, а расход органического вещества через метаногенез составлял от 10 до 78% от расхода через сульфатредукцию (Горленко, Бонч-Осмоловская, 1989). В исландском источнике Граендалса с содержанием сульфата 84 мг/л и йеллоустонских источниках Бэс лейк и Пейнтед пул с содержанием сульфата около 718 мг/л сульфатредукция являлась единственным терминальным процессом деструкции (Ward et al., 1984). В микробных матах источника Термофильный наибольшие скорости терминальных процессов были отмечены в "зеленом" мате при температурах ниже 50°C. Максимальная скорость сульфатредукции составляла 1.44 tS/м² сут, максимальная скорость метаногенеза составляла 0.42 гС/м² сут (Горленко, Бонч-Осмоловская, 1989).

Процесс метаногенеза обнаружен в микробном мате источника Октопус спринг в диапазоне от 68 до 30°C, с оптимумом около 45°C (Ward, 1978). Ацетат не служит важным субстратом для метаногенеза в связи с активным потреблением его Chloroflexus aurantiacus. Автотрофный метаногенез играет намного большую роль, в микробном мате источника Октопус спринг 70-80% метана образуется из СО2 (Sandbeck, Ward, 1982). В микробных матах источника Термофильный образование метана из 14С-ацетата составляет только 11% от общего метаногенеза (Горленко, Бонч-Осмоловская, 1989).

Продукционные и деструкционные процессы в аноксигенных матах. В данном типе матов абсолютные значения продукционных и терминальных деструкционных процессов не определялись. Различными исследователями проводилось стимулирование фотоассимиляции 14С-бикарбоната внесением сульфида. Диурон не ингибировал ассимиляцию. Внесение сульфида (0.56 мМ) в пробы "мата Chloroflexus", развивающегося в источнике Маммот спринг, стимулирует фиксацию на 400%. Светозависимое потребление 14С-ацетата также стимулируется внесением сульфида на 200%. Также было показано, что в данном мате происходит образование сульфида, при этом процесс подавлялся молибдатом, ингибитором сульфатредукции (Giovannoni et al., 1987). Внесение сульфида (0.7-1.1 мМ) в пробы "мата Chlorobium", развивающегося в источнике Травелодж спринг, стимулирует фиксацию на 100% (Castenholz et al., 1990).

Хемотрофные микробные сообщества нейтральных гидротерм. Максимальные значения продуктивности хемотрофных термофильных сообществ значительно уступают продуктивности фототрофных термофильных сообществ и продуктивности хемотрофных мезофильных сообществ. Скорость темновой фиксации углекислоты в "белом" мате с доминированием Thermothrix thiopara источника Термофильный составляет 0.017 гС/м² сут (Горленко, Бонч-Осмоловская, 1989). В источнике Пульсирующий (Камчатка) максимальная темновая фиксация углекислоты составляет 212 мкгС/л сут (Бонч-Осмоловская и др., 1999).

Несмотря на ключевую роль хемосинтетической продукции в функционировании глубоководных гидротермальных сообществ, количественная сторона этой "роли" остается слабо изученной (Гебрук, Галкин, 2002). Бактериальная продукция в бактериальных обрастаниях на отложениях дна в пределах активных полей в среднем составляет около 11 мг С/м² сут. Суммарная бактериальная продукция с учетом всех зон на одном поле составляет в среднем 275 мг С/м² сут (Леин, Пименов, 2002).

В источнике Термофильный скорость сульфатредукции в "белом" мате составляет 0.038 tS/м² сут, скорость метаногенеза 0.0129 мгС/м² сут. Интересно, что скорость сероредукции составляет 0.096 tS/м² сут, эта величина превышает сульфатредукцию в той же зоне в 2.3 раза. Таким образом, в присутствии элементной серы сероредукция успешно конкурирует с другими процессами. Обращает на себя внимание несбалансированность продукционных и деструкционных процессов в "белом" мате. В отличие от "зеленого" мата с доминированием цианобактерий, где продукция органического вещества значительно превышает деструкцию, в "белом" мате деструкция превышает продукцию в 5 раз (Горленко, Бонч-Осмоловская, 1989).

В источнике Пульсирующий скорость автотрофного метаногенеза достигает 0.26 мкгС/л сут и скорость ацетогенеза 9.58 мкгС/л сут. Также была отмечена высокая потенциальная способность к литотрофному восстановлению сульфатов и серы, железа, образованию метана, анаэробному окислению СО, сопряженному с образованием водорода. Литотрофный ацетогенез был незначителен (Бонч-Осмоловская и др., 1999).

Высокая активность терминальных деструкционных процессов была обнаружена в подводных гидротермах. Скорость сероредукции в грунте бухты Матупи (Новая Гвинея) достигает 57 tS/л сут (Бонч-Осмоловская и др., 1993). В илу вулканической воронки с глубины 40 м залива Пленти (Новая Зеландия) с температурой 85°С скорость сульфатредукции достигает 1655.2 мк^/л сут, метаногенеза из СО₂ достигает 5.84 мкгС/л сут, из ацетата - 16.3 мкгС/л сут (Намсараев и др., 1994). В глубоководных гидротермах Гуаймас Калифорнийского залива с глубины 2010 м (50-70еС) скорость сульфатредукции достигает 1024 мкгё/л сут (Jorgensen et al., 1990).

1.4 Экофизиология термофильных микроорганизмов щелочных гидротерм

1.4.1 Температурные и рН границы развития микроорганизмов

Существуют различные классификации микроорганизмов по отношению к температуре (Заварзин, Колотилова, 2001; Castenholz, Pierson, 1995; Wiegel, 1998). Как правило, к термофилам относят микроорганизмы с оптимумом развития при температурах свыше 50°С. Среди них выделяют еще несколько групп. Собственно термофилы с оптимумом при 50°С и максимальной температурой роста выше 60°С. К экстремальным термофилам относятся микроорганизмы с минимальной температурой роста обычно свыше 35°С, оптимумом развития выше 65°С и максимальной температурой роста выше 70°С. К гипертермофилам относятся микроорганизмы с минимальной температурой роста обычно свыше 60°С, оптимумом развития выше 80°С и максимальной температурой роста при температурах выше 85°С (Wiegel, 1998). По данным Штеттера и соавторов (Bluhl et al., 1997) верхний температурный предел развития гипертермофильных микроорганизмов составляет 113°С.

Существуют различные классификации микроорганизмов по отношению к рН (Заварзин, Колотилова, 2001; Krulwich, Guffanti, 1989; Wiegel, 1998). По Вигелю, к алкалофилам относят микроорганизмы с оптимумом рН выше 8.5 и максимальным рН развития выше 10. Выделяют также группы факультативных алкалофилов с минимальным рН развития менее 8 и облигатных алкалофилов с минимальным рН выше 8. К алкалотолерантам относятся организмы с оптимумом рН менее 8.5 и максимальным рН развития выше 9 (Wiegel, 1998). Необходимо учитывать, что при измерении рН в щелочной области при высоких температурах необходимо вносить поправки, либо калибровать электрод при температуре измерения. Ошибка измерения может достигать одной единицы рН (Wiegel, 1998).

1.4.2 Микроорганизмы - первичные продуценты

Цианобактерии. Большинство термофильных (и мезофильных) цианобактерий более активно развивается в щелочных условиях. При культивировании на слабо забуференных средах происходит подщелачивание среды в ходе оксигенного фотосинтеза (Holm-Hansen, 1968; Castenholz, 1969). Так, скорость фотосинтеза нитчатой цианобактерии Phormidium molle не меняется при изменении рН от 7.3 до 9.6 и падает при рН 10.4 (Герасименко, 2002).

Максимальная постоянная температура, при которой могут существовать цианобактерии - 74°С, верхний температурный предел развития Synechococcus lividus (Castenholz, 1969, 1984). Броком было показано, что фиксация 14С-бикарбоната в процессе фотосинтеза популяцией Synechococcus sp. может происходить при температуре 73°С (Brock, 1967). Другие виды цианобактерий могут существовать в культуре при температурах: Synechococcus elongatus до 70°С, Mastigocladus laminosus до 64°С, Phormidium laminosum, P. tenue, P. valderiae до 57°С, Oscillatoria terebriformis до 53°С, Oscillatoria tenue до 47°С. Отмечено развитие в природе следующих видов цианобактерий: Synechococcus minervae до 60°С, Oscillatoria okenii до 60°С, Oscillatoria amphibia до 57°С, Oscillatoria animalis до 55°С, Pleurocapsa minor до 54°С, Calothrix sp. до 54°С, Synechococcus aquaticus до 50°С. Нижний температурный предел развития большинства термофильных цианобактерий составляет 30-35°С (Castenholz, 1969).

Микроаэрофильные условия и присутствие восстановителей в небольших количествах оказывают стимулирующее воздействие на рост цианобактерий (Герасименко, Заварзин, 1982; Герасименко и др., 1987; Герасименко, 2002). Но высокое содержание сульфида подавляет оксигенный фотосинтез цианобактерий (Пиневич, Аверина, 2000). Наиболее токсичен сульфид при низких значениях рН из-за более высокой способности недиссоциированного сероводорода к проникновению через клеточные мембраны (Howsley, Pearson, 1979). В этих условиях цианобактерии переключаются с оксигенного на аноксигенный фотосинтез, используя сульфид в качестве донора электронов для фотосистемы I, либо защищают фотосистему II от ингибирования сульфидом (Венецкая и др. 1987; Castenholz, Utkilen, 1984; Cohen, 1984; Cohen et al. 1975; Cohen et al., 1986). Тиосульфат и элементная сера не могут служить донорами электронов для аноксигенного фотосинтеза у цианобактерий (Castenholz, 1976). Вероятно, древние цианобактерии существовали в сульфидсодержащих условиях. При этом использование воды, как донора электронов, первоначально могло быть способностью позволяющей переносить временное отсутствие сульфида (Cohen, 1984).

Железо может служить донором электронов для мембран связаных комплексов фотосистемы II (Dismukes et al., 2001). Коэном было показано, что цианобактерии Oscillatoria sp. и Microcoleus chtonoplastes осуществляют Fe(II)-зависимую фотоассимиляцию СО2. Процесс ингибируется диуроном, что свидетельствует о том, что железо донирует вторую фотосистему. Конечный продукт, оксид железа, выделяется в среду подобно выделению элементной серы в сульфидзависимом аноксигенном фотосинтезе (Cohen et al., 1986). Пирсон было показано, что в железистом нейтральном источнике Чоколейт пот (Йеллоустон) происходит образование чехлов окисного железа вокруг нитей цианобактерий (Pierson et al., 2000). Эксперименты со стимулированием закисным железом фиксации 14С-бикарбоната показали, что наибольшее стимулирование (до 500% фотоассимиляции, до 175% темновой фиксации) происходит при добавлении 1 мМ закисного железа (56 мг/л). Стимулирование фиксации железом выше в пробах мата из более высокотемпературных зон с доминированием Synechococcus sp., чем в зонах с умеренной температурой и доминированием Oscillatoria sp. (Pierson et al., 1999).

Большинство цианобактерий является облигатными фотоавтотрофами. Относительно небольшое количество цианобактерий способно существовать как аэробные гетеротрофы в темноте, но скорость роста при этом значительно уступает росту в фотоавтотрофных условиях. Анаэробный метаболизм в темноте ограничен брожением и используется для поддержания существования в неблагоприятных условиях (Stal, 1995). Способность к восстановлению серных соединений при брожении была показана у мезофильных цианобактерий, но у термофильных цианобактерий не известна (Oren, Shilo, 1979; Moezelaar et al., 1996).

Аноксигенные фототрофные бактерии (АФБ). Известно всего девять видов термофильных АФБ (Castenholz, Pierson, 1995; Hanada et al., 1995a, b; Hanada et al., 2002). Из них способны существовать в культуре, или показано существование в природе, при рН выше 8.5 только термофильные нитчатые зеленые бактерии. Также для несерных пурпурных бактерий Rhodopseudomonas palustris и Rh. gelatinosus было показано существование в природе при рН 9.2-9.8 и температуре выше 50°С, но они не были способны к росту при высоких температурах в лабораторных условиях. Высказано предположение, что бактерии либо переживают неблагоприятные условия, периодически активируясь при снижении температуры, либо в мате существуют условия, при которых возрастает верхний предел их толерантности к температуре. Оба организма имели оптимум рН около 7 и не проявляли тенденции к алкалофилии (Горленко и др., 1985; Компанцева, Горленко, 1988). Аналогичное явление было обнаружено для культур несерных пурпурных бактерий родов Blastohloris, Phaeospirillum, Rhodoplanes, Rhodopseudomonas, Rubrivivax выделенных из матов развивающихся при 55-65еС (источник Накабуса, Япония), но растущих в лабораторных условиях при температурах не выше 43-48еС (Okamura et al., 2003).

Термофильные нитчатые АФБ широко распространены в гидротермах с температурой до 72°С и рН от 6.2 до 10.4. В настоящее время известно четыре вида: Chloroflexus aurantiacus, Chloroflexus aggregans, Roseiflexus castenholzii, Heliothrix oregonensis. Культивируемые организмы обладают оптимумом рН 7-8, Chloroflexus aggregans и Roseiflexus castenholzii были обнаружены только в источниках с рН не выше 8, но Chloroflexus aurantiacus и Heliothrix oregonensis были обнаружены в источниках с рН до 10.4 (H. oregonensis с pH 8.5) (Юрков и др., 1991; Pierson, Castenholz, 1974; Castenholz, Pierson, 1995; Hanada et al., 1995a, b; Hanada et al., 2002; Blanck et al., 2002; №>bel et al., 2002).

Наиболее изученным представителем этой группы является Chloroflexus aurantiacus. Его оптимум роста 52-60°N, максимальная температура роста ~70°С (Pierson, Castenholz, 1974). Chloroflexus aurantiacus не способен к фиксации молекулярного азота (Heda, Madigan, 1986). Наиболее быстро рост всех выделенных штаммов происходит фотогетеротрофно (Castenholz, Pierson, 1995). Ряд штаммов способны к медленной сульфидзависимой фотоавтотрофии с образованием молекулярной серы (Кеппен, Красильникова, 1986; Madigan, Brock, 1975; Giovannoni et al., 1987). Тиосульфат, сульфит, молекулярная сера не могут использоваться в качестве доноров электронов, но могут использоваться в качестве акцепторов электронов восстанавливаясь до сероводорода на среде с органическими соединениями в темноте (Кондратьева, Красильникова, 1988). Также в темноте организм способен расти в аэробных условиях за счет дыхания и в анаэробных условиях за счет сбраживания углеводов или пирувата (Красильникова и др., 1986; Красильникова, Кондратьева, 1987). Красильникова и Кондратьева (1987) сообщают, что Chloroflexus aurantiacus в темноте в анаэробных условиях в присутствии глюкозы восстанавливает окисное железо. Ранее активность железоредуктазы и редукция железа мембранными фракциями была показана у мезофильных АФБ (Moody et al., 1985; Dobbin et al., 1996). Образование чехлов окисного железа наблюдалось у мезофильного штамма Chloroflexus aurantiacus в микроаэрофильных условиях при развитии на среде с 0.01% триптона и порошком металлического железа (Горленко, 1981). При этом бактериальные нити выползали из чехлов, что приводило к накоплению большого количества чехлов, неотличимых от чехлов Leptothrix. Окисление железа, скорее всего, не является источником энергии для фиксации СО2, а связано с действием перекиси водорода, образующейся в процессе окисления органического субстрата (Дубинина, 1977). Это может являться одним из механизмов участия бактерий в генезисе железистых минералов древних осадочных месторождений ганфлинтского типа. Способность Chloroflexus aurantiacus к использованию восстановленного железа как донора электронов для фотосистемы I не была исследована. Ранее было показано, что мезофильные АФБ способны использовать закисное железо как донор электронов (Widdel et al., 1993; Ehrenreich et al., 1994).

Heliothrix oregonensis не был выделен в чистую культуру. Клетки более толстые, чем у Chloroflexus aurantiacus (1.5 мкм и 0.5-1.0 мкм соответственно), хлоросомы отсутствуют. Бактериохлорофилл а - единственный пигмент. Проявляет себя как фотогетеротроф толерантный к кислороду или даже нуждающийся в кислороде. Растет в диапазоне температур от 35 до 56-60°С с оптимумом в пределах 40-55°С. Устойчив к высоким интенсивностям света до 32 клюкс. Heliothrix oregonensis найден преимущественно в микробных матах щелочных источников с рН около 8.5, в которых он образует верхний слой оранжевого цвета (Pierson et al., 1984, 1985).

Chloroflexus aggregans и Roseiflexus castenholzii гораздо менее изучены чем Chloroflexus aurantiacus. Основные характеристики этих организмов очень похожи. Эти бактерии способны к фототрофному росту на органических субстратах, а также к гетеротрофному аэробному росту в темноте. Отличия заключаются в следующем: клетки Chloroflexus aggregans более толстые (до 1.5 мкм), скорость скольжения нитей по поверхности примерно в 100 раз выше, есть способность к быстрому образованию аггрегатов в жидкой среде (за 20-30 минут), не способен к использованию ацетата, цитрата, этанола и глицил-глицина (Hanada et al., 1995b). Roseiflexus castenholzii не обладает хлоросомами и бактериохлорофиллом с и содержит только бактериохлорофилл а (Hanada et al., 2002).

Хемолитоавтотрофные алкалотермофильные микроорганизмы в настоящее время не известны (Кевбрин, личное сообщение; Wiegel, 1998). Единственным известным хемолитоавтотрофным термофильным алкалотолерантным организмом является метаногенная археобактерия Methanothermobacter thermoautotrophicum (ранее Methanobacterium thermoautotrophicum, синоним M. thermoalcaliphilum) способная существовать при рН 9 и обладающая оптимумом рН 7.7.7.8 (Zeikus, Wolfe, 1980; Blotevogel et al., 1986).

1.4.3 Микроорганизмы - деструкторы

Аэробные и факультативно аэробные органотрофные микроорганизмы. Валидно опубликованные алкалофильные термофильные аэробные микроорганизмы в настоящее время не известны. Недавно Мартинссон с соавторами обнаружили в щелочных субаквальных гидротермах Эйджафьордур аэробные органторофные микроорганизмы способные существовать в лабораторных условиях при рН 10 и температуре 60-72°С. По результатам анализа 16S-рРНК (на основании анализа 400-500 пар нуклеотидов, сходство 95-99%) изоляты были отнесены к видам Geobacillus thermoleovorans, "G. caldotenax", G. flavothermus, G. caldovelox (Marteinsson et al., 2001). Тем не менее, типовые штаммы данных организмов не способны расти при рН выше 8 (Назина, Григорьян - личное сообщение).

Известные микроорганизмы являются либо "самыми "алкалофильными" среди термофилов, либо самыми "термофильными" среди алкалофилов" (Wiegel, 1998). Оптимумом рН выше 8.5 обладает Bacillus sp. штамм 221, способный расти до рН 10 и максимальной температурой роста 57°С, являющийся алкалофилом, но не термофилом (Horikoshi, 1990, Wiegel, 1998). Среди термофильных микроорганизмов известен ряд аэробных алкалотолерантных бактерий (археобактерии неизвестны). Это представители рода Bacillus (B. pallidus, B. thermocloaceae, B. thermoaerophilus), рода Meiothermus (M. chliarophilus, M. ruber, M.silvanus), "Geobacillus caldotenax", Thermus oshimae, Sphaerobacter thermophilus, Thermomicrobium roseum, Isosphaera pallida, Rubrobacter xylanophilus (Wiegel, 1998). Храпцова и соавторы выделили из термальных источников Бурятии ряд алкалитолерантных термофильных аэробных микроорганизмов с оптимумом роста при 50°С и рН 8.0 (Храпцова и др., 1984).

О способности к использованию неорганических соединений термофильными аэробными органотрофными микроорганизмами известно мало. Meiothermus ruber способен к окислению тиосульфата с образованием сульфата, причем добавление тиосульфата не стимулировало рост (Chung et al., 1997). Способность к окислению тиосульфата, а также восстановлению элементной серы и ряда металлов была обнаружена у представителей рода Thermus, кроме Thermus oshimae (Kieft et al, 1999; Skirnisdottir et al., 2001).

Анаэробные органотрофные микроорганизмы. В настоящее время в этой группе известно семь видов анаэробных алкалотермофильных микроорганизмов. К ним относятся археи Methanohalophilus zhilinae, Thermococcus alcaliphilus, бактерии рода Clostridium (C. paradoxum, C. thermoalcaliphilum), Anaerobranca gottschalkii, Thermosyntropha lipolytica, Desulfotomaculum alkaliphilum (Mathrani et al., 1988; Li et al., 1993, 1994; Keller et al., 1995; Svetlitshnyi et al., 1996; Wiegel, 1998; Pikuta et al., 2000). К анаэробным термофильным алкалотолерантным микроорганизмам относятся археи Methanobacterium thermoflexum, Thermococcus fumicolans, бактерии Anaerobranca horikoshii, Thermobrachium celere, Caloramator indicus, Thermoanaerobacter ethanolicus (Wiegel, Ljundgahl, 1982; Kotelnikova et al., 1993; Engle et al., 1995; Chrisostomos et al., 1996; Godfroy et al., 1996; Wiegel, 1998). Все организмы являются органогетеротрофами, о способности к использованию неорганических соединений известно немного. Desulfotomaculum alkaliphilum способен восстанавливать сульфат, сульфит, тиосульфат, но не элементную серу и нитрат (Pikuta et al., 2000). Thermococcus alcaliphilus способен восстанавливать полисульфид и элементную серу (Keller et al., 1995).

1.5 Участие микробного сообщества щелочных гидротерм в минералообразовании

При выходе гидротермальных вод на поверхность и протоке по руслу источника создаются градиенты по концентрациям, растворимости компонентов, температуре, рН и давлению (Крайнов, Швец, 1980). В ходе этого создается система геохимических барьеров, на которых происходит резкое уменьшение интенсивности миграции ряда элементов и образование минералов (Перельман, 1972; Аверкин, 1987). Микробное сообщество играет важную роль в процессе минералообразования в гидротермальных системах, участвуя в создании геохимических барьеров (Заварзин, 1984).

Миграция катионогенных элементов, в первую очередь железа, в щелочных водах затруднена. Поэтому, наибольшую роль среди минералов, образующихся по изливу щелочных термальных вод, играют соединения анионогенных элементов: силикаты и карбонаты (Перельман, 1972).

Силикаты. Щелочные термальные воды содержат высокие концентрации кремния (около 100 мг/л). При постепенном охлаждении воды по изливу и снижении рН избыток кремневой кислоты относительно равновесной величины остается во взвешенном состоянии в виде коллоида и практически не осаждается. Поэтому осаждение кремнезема (H₄SiO₄ -> SiO₂ + 2H₂O) происходит при испарении и охлаждении раствора (Го Окамото и др., 1963; Walter, 1976). Примером отложения силикатов из щелочного гидротермального раствора является образование гидротермальных построек у северного побережья Исландии (Эйджафьордур). Здесь происходит смешение термальных вод (pH 10, 71 °С) с содержанием кремния 93.7 мг/л и холодных нейтральных океанических вод. Образующиеся постройки сложены из силикатов. Характерно, что металлические сульфиды, часто встречающиеся в кислых черных курильщиках, в них не были обнаружены (Marteinsson et al., 2001).

Образование гейзеритов (силикатных построек на выходах гидротерм) отмечалось на многих источниках с нейтральными и щелочными водами (Walter, 1976; Konhauser et al., 2001; Blanck et al., 2002; Inagaki et al., 2003). Ранее доминировало мнение о преимущественно абиогенном образовании гейзеритов. Так, Уолтер описал механизм образования кремнистых гейзеритов с колончатыми ламинациями при разбрызгивании воды из потока и осаждении ее в виде капель на поверхности камней. При испарении капель на поверхности остаются тонкие бляшки кремнезема. Ламинация в образующемся кремнистом гейзерите очень тонкая и регулярная (Walter, 1976).

Электронно-микроскопические наблюдения показали наличие микрофоссилий в гейзеритах. Тем не менее, роль микробного сообщества в образовании силикатных пород остается во многом невыясненной. Считается, что микробные обрастания и маты служат центрами нуклеации при образовании силикатных минералов, а далее процесс минералообразования происходит автокаталитически (Герасименко, Крылов, 1983; Oehler, Schopf, 1971; Ferris et al., 1986; Cook, Stackes, 1995; Jones, Renaut, 1996, 1997; Jones et al., 1997 a,b.; Konhauser, Ferris, 1996; Fortin, Ferris, 1998; Konhauser et al., 2001; Inagaki et al., 2003). Недавние исследования показали, что роль микробного сообщества в образовании гейзеритов может быть больше, чем считалось ранее. Культура Thermus sp. осаждала кремнезем во время экспоненциальной фазы роста, при этом в клетках синтезировался белок (Sip - silica induced protein), появлявшийся только в присутствии коллоидного кремния. Функция этого белка неизвестна, высказано предположение, что осаждение кремния необходимо для закрепления клеток на поверхности субстрата в потоке воды (Inagaki et al., 2003).

Карбонаты. Образование травертинов - карбонатных пород на выходах источников отмечается многими исследователями. Механизм образования травертинов хорошо изучен. При выходе вод на поверхность давление падает, происходит вскипание углекислого газа, который улетучивается из гидротермальных вод. В результате вода становится пересыщенной по кальциту и происходит его выпадение из раствора (Аверкин, 1987; Плюснин и др., 2000; Chafetz, Folk, 1984; Fouke et al., 2000). Образующиеся травертины могут достигать 85 метров в толщину и занимать площади до нескольких сотен километров (Chafetz, Folk, 1984).

Микробное сообщество гидротерм играет важную роль в образовании травертин. Считается, что большинство травертин образовано в результате совместного воздействия биогенных и абиогенных факторов. Роль факторов зависит от множества переменных: содержания растворенного СО2, температуры воды, морфологии травертин, интенсивности света и т.д. В травертине слои биогенно осажденного кальцита могут перемежаться со слоями абиогенного кальцита (Chafetz, Folk, 1984). Биогенно осаждаемый кальцит может составлять до 90% от всего осаждаемого кальцита. Наибольший вклад в осаждение карбоната кальция вносят цианобактерии, удаляющие СО2 из раствора и нарушающие карбонатное равновесие (Орлеанский, Герасименко, 1982; Заварзин, 2002; Chafetz, Folk, 1984; Chafetz et al., 1991; Spiro, Pentecost, 1991; Pentecost, 1994, 1995).

Образование травертинов на источниках Б.р.з. Судя по максимальной растворимости аморфного кремнезема в щелочных условиях (300-1000 мг/л), исследованые гидротермы Б. р. з. недонасыщены кремнием. Об этом же свидетельствует и отсутствие в районе выхода гидротерм значительных отложений кремнезема (Ломоносов, 1974).

На выходах Аллинского и Гаргинского источников происходит образование травертинов с низкими содержаниями SiO2 (до 3.6%). В термальных водах источников натрий доминирует над кальцием, сульфат-ион доминирует над гидрокарбонат-ионом, а также содержится значительные концентрации растворенной кремнекислоты, поэтому факт образования из таких вод карбонатно-кальциевых травертинов представляет значительный интерес (Борисенко и др., 1976). По мнению Плюснина образование травертинов на Гаргинском источнике не может происходить в ходе декомпрессии углекислого газа при выходе на поверхность, так как содержания углекислого газа, карбоната, гидрокарбоната и кальция слишком низки. Поэтому в образовании травертина большую роль может играть деятельность цианобактериального мата развивающегося на поверхности травертина (Плюснин и др., 2000).

Образование строматолитов в древних гидротермах. Современные процессы образования гейзеритов и травертинов по изливу гидротерм могут служить актуалистической моделью образования древних строматолитов (Герасименко, 2002; Walter, 1976; Walter et al., 1976). Строматолиты - органоседиментарные структуры образованные при связывании, улавливании и отложении карбонатного осадка в результате роста и метаболической активности микроорганизмов, в основном цианобактерий (Walter, 1983). Строматолиты доминировали на протяжении всего докембрийского этапа развития биосферы. Резкое сокращение количества строматолитов происходит в фанерозое в связи с появлением и экспансией скелетных организмов вытеснивших микробные маты в отдельные неблагоприятные экологические ниши (Семихатов и др., 1999). Сохранность микрофоссилий в карбонатных породах низка (Головенок, 1989; Chafetz, Folk, 1984), хотя иногда в них могут сохраняться органостенные микрофоссилии или кальцифицированные останки (Knoll, 1985, 1996). Лучшая сохранность микрофоссилий обеспечивается при окремнении микроорганизмов (Головенок, 1989). Древнейшие раннеархейские микрофоссилии (серии Варравуна в Австралии, Онвервахт и Фиг три в Южной Африке, 3.5 млрд. лет) окремнены и заключены в кремнеземный матрикс. Так, в химическом составе строматолитов серии Онвервахт доминирует кремнезем: SiO₂ (95.68-98.90%), Fe₂O₃ (0.5-3.96%), C неорг (0.07 - 0.11%), C орг (0.05 - 0.11%), M2O3 (0.06 - 0.1%) (Walsh, 1992). Раннеархейские строматолиты были образованы нитчатыми и одноклеточными прокариотами. Вероятно, строматолитобразующими организмами были фотоавтотрофы (показано по фракционированию углерода), обладавшие фототаксисом и образовывавшие слизистый чехол (Walter, 1983). Размеры микрофосилий в строматолитах серии Онвервахт: диаметр сфероидов от 4 до 10 мкм, толщина филаментов от 0.2 до 2.5 мкм, длина до 200 мкм, - близки к размерам микроорганизмов в составе микробного мата (Walsh, 1992).

Считается, что большинство известных строматолитов были образованы микробными матами развивающимися в гиперсоленых лагунах в эвапоритовой обстановке (Семихатов и др., 1999). При этом, накопление кремния объясняется выносом кремнезема из древних областей сноса в процессе выветривания. В докембрийских морях кремневые губки и радиолярии не известны, поэтому кремнезем мог накапливаться до стадии насыщения, особенно в мелководных бассейнах, где шло интенсивное выпаривание вод. Затем, в процессе диагенеза первоначально гидратированный кремнезем становился дегидрированным, переходя в кремни (Головенок, 1989; Заварзин, 1993; Весталл, Велш, 2002).

В последние годы появляются данные о том, что древнейшие строматолиты могут иметь гидротермальное происхождение. Анализ строматолитов серии Онвервахт зеленокаменного пояса Барбертон (ЮАР) и серии Варравуна кратона Пилбара (Австралия) возрастом около 3.5 млрд. лет показал, что вулканическая и гидротермальная активность оказали серезное влияние на породы. При этом морфология строматолитов дает основания для предположения о том, что они были сформированы в результате силификации микробного мата развивавшегося по изливу термального источника (Весталл, Велш, 2002; Westall, Marchesini, 2002).

Окремнение микроорганизмов в современных гидротермах. Актуалистические исследования микробных матов гидротерм показывают, что современное сообщество фоссилизируется с образованием микрофоссилий схожих с древними (Golubic, 1976; Knoll, Golubich, 1979; Knoll, 1996). Было показано, что замещение микроорганизмов кремнеземом происходит очень быстро при коагуляции геля кремниевой кислоты.

Исследования с применением сканирующего электронного микроскопа цианобактериальных матов источников Камчатки показали, что замещение органического вещества происходит с сохранением мельчайших морфологических деталей. При этом сначала замещаются сами микроорганизмы, а затем кремнезем заполняет пространство между ними (Крылов, Тихомирова, 1988).

Прямое сопоставление современных микроорганизмов и микрофоссилий затруднено, так как существует значительное морфологическое сходство между многими филогенетически удаленными группами микроорганизмов. Трудности биологической интерпретации увеличиваются и в связи со сложными посмертными процессами изменения клетки (Сергеев, 1992). Например, у нитчатых микроорганизмов могут разрушаться клеточные перегородки и, в результате, образуются полые нити похожие на пустые чехлы. Часто происходит распад трихомов на отдельные клетки, а сами клетки меняют форму. Наиболее отчетливо этот процесс наблюдался в погибших нитях цианобактерии Mastigocladus laminosus образующей до 20 различных форм сохранности (Герасименко, Крылов, 1983).

По мнению Нолла, актуалистические исследования современных микробных сообществ, аналогичных существовавшим в докембрии, должны стать одним из основных направлений исследования докембрия в ближайшее десятилетие. При этом, исследования должны включать в себя изучение развития микробных сообществ, вариации состава и сохранности микроорганизмов (Knoll, 1996).

Щелочные гидротермы широко распространены в природе, но, в отличие от кислых и нейтральных гидротерм, гораздо менее изучены (Соломин, Крайнов, 1998). Геохимический их облик имеет ряд особенностей: щелочность обусловлена не ионами карбонатной системы, а силикатными и даже боратными ионами; в водах более активно мигрируют анионогенные элементы, тогда как катионогенные элементы часто образуют слаборастворимые соединения; более быстро происходит окисление переменновалентных элементов (Перельман, 1972; Крайнов, Швец, 1980).

Ранее исследователями было показано, что по изливу щелочных термальных вод развиваются микробные сообщества с доминированием цианобактерий, либо хемотрофных микроорганизмов (Горленко и др., 1985; Юрков и др., 1992; Marteinsson et al., 2001; Krienitz et al., 2003). Сообщества с доминированием АФБ не были обнаружены, хотя, согласно имеющимся представлениям, должны быть широко распространены в сульфидсодержащих термальных водах (Castenholz, 1984).

Зависимость активностей продукционных и терминальных деструкционных процессов от условий среды была исследована на примере хемотрофных сообществ щелочных гидротерм (Бонч-Осмоловская и др., 1999; Brock et al., 1971; Elsgaard et al., 1994). Тогда как данные об интенсивностях продукционных и терминальных деструкционных процессов в фототрофных сообществах щелочных гидротерм отсутствуют.

Известно небольшое количество алкалофильных и алкалотолерантных видов термофильных микроорганизмов (около 30 видов) (Castenholz, 1969; Wiegel, 1998). Данные об использовании ими неорганических соединений ограничены, известно об участии в цикле серы, но данные об участии в циклах железа и селена отсутствуют.

Процессы минералообразования в щелочных условиях отличаются от нейтральных (Перельман, 1972). Поэтому изучение роли микробного сообщества щелочных гидротерм в минералообразовании вызывает несомненный интерес.

Отсюда - задачи настоящей работы:

Изучение состава микробных сообществ щелочных термальных источников в связи с изменением физико-химических условий.

Изучение активности продукционных и терминальных деструкционных процессов в фототрофных и хемотрофных микробных сообществах в разных экологических зонах источников.

Исследование экофизиологических особенностей термофильных микроорганизмов участвующих в циклах углерода и серы в сообществах.

Изучение участия микробных сообществ щелочных гидротерм в минералообразовании.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Объекты исследования

Были исследованы слабоминерализованные (до 1 г/л) азотные гидротермы Б.р.з. расположенные в Курумканском и Баргузинском районах Республики Бурятия и минерализованные (до 25 г/л) азотные гидротермы острова Паоха, расположенного на озере Моно Лейк (Калифорния, США). Полевые исследования на источниках Б.р.з. проводились в летне-осенний период с 1998 по 2002 год. Пробы на острове Паоха были отобраны В.М. Горленко летом 2000 г. Химический состав термальных вод приведен в таблице 1. Здесь и далее слабоминерализованные источники перечисляются в порядке повышения рН воды на изливе источника.

Гаргинский источник находится в Курумканском районе Республики Бурятия в долине реки Гарга (левого притока реки Баргузин). Термальная вода выходит на склоне долины реки из пещеры сечением около 1 м² и по ложбине стекает к реке, находящейся приблизительно в 100 м от выхода источника. Выделяющийся газ на 99.27 % состоит из азота (Ломоносов, 1974). По химическому составу вода сульфатно-натриевая, с низкой минерализацией, равной 1.08 г/л, температура 75°С, рН 7.7. Содержание радона 40 эман. рН воды источника более низкий по сравнению с другими исследованными нами гидротермами Байкальской рифтовой зоны. По мнению Замана это может быть объяснено радиолитическим разложения воды (Замана, 2000).

По изливу источника образуется травертин в форме купола, состоящего из нескольких ступеней. Максимальная мощность отложений составляет 2.5 м. Купол имеет овальную форму, длиной 50 м, шириной до 25 м, и занимает почти всю площадь родниковой воронки. По составу травертин близок к чисто карбонатно-кальциевым, в нем также фиксируется относительно высокое содержание SiO₂ (3.61%) и MnO (1.27%).

Возраст травертин средневерхнеплейстоценовый, и составляет 19245-25725 лет (Плюснин, 2000).

Уринский источник расположен в Баргузинском районе Республики Бурятия в бассейне реки Уро (левого притока реки Баргузин) по левому берегу ручья Лиственничного в 1.3 км от его устья. Координаты источника 53°39' с.ш., 110°07' в.д. Ближайший населенный пункт - деревня Большое Уро, находится в 25-28 км от источника. Термальные воды выходят из-под груд биотитовых гранитов на площади около 200 м². Воды источника гидрокарбонатно-сульфатно-натриевого типа.

Температура вод на изливах от 69 до 25°С, рН 8.8-9.1, Eh от -72 до +199 мВ. Выделяющийся газ на 98 % состоит из азота (Власова и др., 1962).

Сеюйский источник находится в Курумканском районе Республики Бурятия у северо-восточного замыкания Баргузинской долины на правом берегу реки Сеи, в 4 км от ее устья. Ближайший населенный пункт - поселок Майский, находится в 50 км от источника. Выход терм расположен у подножья террасы высотой 10-12 метров, сложенной мелкозернистым песком. Выход источника приурочен к озеру размером 4*7 метров и глубиной до 1.5 метров, со дна которого бьют многочисленные грифоны с температурой воды до 55°С (Ломоносов, 1974). Выделяющийся газ на 98% состоит из азота. Воды источника гидрокарбонатно-сульфатно натриевого типа. Температура воды на поверхности озера 49.7°С, рН 9.5-9.6, Eh -45 мВ. Минерализация 0.4 г/л.

Аллинский источник расположен по берегам реки Алла в районе ее выхода из Баргузинского хребта в 7 км на запад от села Алла Курумканского района Республики Бурятия. Выходы расположены у подножия террас, на каменистых отмелях, либо на дне боковых проток. Выходы термальных вод периодически меняют свое местоположение. Основными причинами являются изменение русла реки при наводнениях, засыпка грунтом и илом выходов термальных вод. Воды источника гидрокарбонатно-сульфатно натриевого типа. Выделяющийся газ на 98% состоит из азота (Власова и др., 1962). Большереченский источник находится на территории Баргузинского государственного биосферного заповедника (Республика Бурятия) в долине реки Большой, на расстоянии 25-28 км от Байкала, географические координаты: 54°25' с.ш. и 109°50' в. д. Максимальная температура воды зарегистрирована на выходе источника №6, согласно обозначению источников по Мартынову (Мартынов, 1960). Этот наиболее крупный источник стал основным объектом нашего исследования. Источник принадлежит к азотному типу термальных вод. Выделяющийся газ на 88% состоит из азота, содержит 0.9% метана, 0.5% CO2, 0.116% гелия (Ломоносов, 1974). Температура воды на выходе 74°С, по данным наших измерений в различные годы (июль-сентябрь: 1986, 1989, 1996, 2001 г.) колебалась незначительно, не более 1-2° С. По химическому составу вода источника относится к гидрокарбонатно-хлоридно-сульфатно-натриевому типу. Изливающиеся воды содержат также растворенный сульфид в количестве 12-13.4 мг/л. рН воды в различные годы оставался в пределах от 9.25 до 9.8. Источник Паоха расположен на острове Паоха, на озере Моно-лейк. Озеро расположено в центральной части штата Калифорния, США, к востоку от хребта Сьерра-Невада. Озеро расположено в замкнутом бассейне. В результате испарительного концентрирования содержание солей в воде озера достигает 82-92 г/л. рН воды озера 9.5. По берегам озера на острове Паоха расположено большое количество горячих источников. Воды источников минерализованые, щелочные, содержат метан, поступающий из меторождения природного газа расположенного под дном озера, и сероводород. Термальные воды содержат высокие конценрации фтора, бора, лития, йода, ртути и мышьяка (Oremland et al., 1987, 2000; Oxburgh rt al., 1991; The Mono Basin..., 1987).

Термальные воды источника Паоха обладают температурой 84-94°С, минерализацией 25 г/л, рН 9.7. Содержание сероводорода 55 мг/л. Воды хлоридного кальциевого-натриевого состава.

2.2 Методы полевых исследований

Пробы воды, почв для микробиологического анализа отбирали в стерильную посуду. Пробы мата для химических анализов и для радиоизотопных экспериментов отбирали пробочным сверлом площадью 1 см². Введение радиоизотопов и фиксацию проб для химических и микробиологических определений проводили сразу после отбора проб. До проведения анализов пробы хранили в темноте в холодильнике.

В местах отбора проб измеряли температуру, рН, окислительно-восстановительный потенциал (Eh), минерализацию. Температуру измеряли сенсорным электротермометром Prima (Португалия), рН определяли потенциометрически при помощи портативного рН-метра (рНер2, Португалия). Для определения окислительно-восстановительного потенциала использовали портативный измеритель redox-потенциала ORP (Португалия). Минерализацию воды определяли при помощи портативного тестер-кондуктометра TDS-4

Кислород в воде источника определяли методом Винклера (Резников и др., 1970). Концентрацию сульфида определяли колориметрически с парафенилендиамином на полевом спектрофотометре ПФЭК-П-2 (Tbper, Schlegel, 1964). Концентрации тиосульфата и сульфита определяли йодометрическим методом (Резников и др., 1970). Концентрацию сульфата определяли турбидиметрическим методом (Резников и др., 1970). Содержание железа определяли роданидным (Резников и др., 1970) и феррозиновым (Stookey, 1970) методами. Содержания карбонатов в полевых условиях определяли титрованием (Резников и др., 1970).

2.3 Методы лабораторных исследований

2.3.1 Методы культивирования и изучения роста бактерий в зависимости от физико-химических факторов

Учет численности жизнеспособных клеток микроорганизмов проводили методом 10-ти кратных разведений на элективных средах. Выделение, учет численности и культивирование цианобактерий проводили на жидкой среде Кастенхольца (Castenholz, 1969). Выделение и учет численности аноксигенных фототрофных бактерии (АФБ) вели на агаризованной (0.2%) модифицированной среде Пфеннига (Pfennig, 1965), содержащей в литре дистиллированой воды: KH2PO4 - 0.5 г, NH4O - 0.5 г, MgSO4*7H2O - 0.5 г, KCl - 0.5 г, NaCl - 0.5 г, CaCl₂*2H₂O - 0.05 г/л, NaHCO₃ - 1.5 г/л, раствор микроэлементов по Пфеннигу - 1мл (Pfennig, Lippert, 1966), витамин В₁₂ - 20 мкг, ацетат-Na - 1 г, дрожжевой экстракт -0.1 г, Na2S2Os*5H2O - 1 г, Na2S*9 Н2О - 0.3 г. рН среды доводили 0.1 М растворами HCl и NaOH до 8.0-8.5 при 25°С, температура инкубации 30 и 50°С.

Опыт по культивированию Chloroflexus aurantiacus в присутствии железа проводился на среде для АФБ со следующими изменениями: раствор фолиевой кислоты (0.02 г/л) и рибофлавина (0.05 г. л) - 1мл, раствор тиамина (0.05 г/л) и пантотеновой кислоты (0.05 г/л) - 1 мл, раствор никотиновой кислоты (0.05 г/л), биотина (0.02 г/л), ПАБК (0.05 г/л), пиридоксина (0.1 г/л) - 1мл, NaHCO₃ - 2 г/л, FeSO₄*7Н₂О - 2.8 г, из состава среды удалены Na₂S₂O₃*5H₂O, Na₂S*9 Н₂О, ацетат-Na и дрожжевой экстракт. рН устанавливался 7.2. Инокулят был подготовлен на среде с 100 мг/л дрожжевого экстракта. Эксперимент проводился в 3 повторностях. Среда по 30 мл анаэробно разливалась в пузырьки по 50 мл, продувалась азотом. Культивирование проводилось при 50°С. Анаэробный рост в темноте проверялся на среде аналогичного состава содержащей 100 мг/л дрожжевого состава в пузырьках на 50 мл заполненых наполовину, культивирование проводилось под ватными пробками при 50°С. рН устанавливали 7.5 при 25°С.

Выделение и культивирование штаммов Meiothermus ruber проводилось на среде для АФБ со следующими изменениями: NaHCO₃ - 0.5 г, дрожжевой экстракт - 0.5 г, из состава среды удалены ацетат-Na и Na₂S*9 Н₂О. рН устанавливали 7.5-8.5 при 25°С. Температура инкубации 50°С. Культивирование проводили в колбах заполненых средой наполовину, под ватными пробками, и на агаризованой (0.2%) среде того же состава.

Выделение и культивирование "Anaerobranca californiensis" проводилось на среде для АФБ со следующими изменениями: MgSO₄*7H₂O - 0.2 г, Na₂SO₄ - 0.5 г, NaCl - 25 г, NaHCO3 - 5 г, Na2CO3 - 5 г, дрожжевой экстракт - 2 г, цистеин - 0.25 г, пептон - 1 г, из состава среды удалены CaCl₂*2H₂O и ацетат-Na. рН устанавливали 9.3-9.7 при 25°С.

Температура инкубации 58°С. Культивирование проводили в полностью заполненных пузырьках, либо на чашках Петри с Gel-Gro^tm (1.2%) (ICN Biochemicals, Ohio, USA) со средой того же состава, в последнем случае культивирование проводилось в анаэростате в атмосфере азота.

Штаммы Anaerobranca horikoshii (DSM 9786) и A. gottschalkii (DSM 13577) культивировали на среде использовавшейся для культивирования "A. californiensis" со следующими изменениями. Для A.gottschalkii: глюкоза - 2 г, NaCl - 10 г, из состава среды уделен Na2S*9H2O. Для A. horikoshii: NaCl - 0.5 г, фумарат - 1.5 г, Ш2Ш3 - 1.8 г, NaHCO3 -1.8 г, Na₂S*9H₂O - 0.125г. рН в обоих случаях устанавливали 9.3-9.7 при 25°С. Температура инкубации 58°С.

Выделение и культивирование Ectothorhodospira shaposhnikovii проводилось на среде для АФБ со следующими изменениями: NaCl - 10 г, Na₂CO₃ - 5 г, NaHCO₃ - 5 г, дрожжевой экстракт - 1 г. рН устанавливали 9.3-9.7 при 25°С. Температура инкубации 25°С.

Выделение и культивирование штаммов термофильных сульфатредуцирующих бактерий проводили на модифицированной среде Постгейта (Кузнецов, Дубинина, 1989), содержащей в литре дистиллированой воды: KH₂PO4 - 0.5 г, NH₄Cl - 1 г, CaCl₂*2H₂O - 0.3 г, Na2SO3 - 0.7 г, MgCb *6H2O - 0.3 г, NaCl - 1 г, NaHCO3 - 0.5 г, Na2S*9H2O - 0.1 г, раствор микроэлементов по Пфеннигу - 1мл (Pfennig, Lippert, 1966), витамин В₁₂ - 20 мкг, дрожжевой экстракт - 0.5 г, лактат натрия - 3.5 г. рН среды доводили 0.1 М растворами HCl и NaOH до 8 при 25°С. Температура инкубации 58°С. Культивирование проводили в полностью заполненных пузырьках, либо на агаризованой (0.2%) среде того же состава.

Определение видовой принадлежности цианобактерий проводили на основании морфологических признаков по определителю Голлербах и др. (1953). Идентификацию аноксигенных фототрофных бактерий проводили по совокупности фенотипических признаков (морфологии клеток, содержанию хлорофилла и каротиноидов, способности к гетеротрофному и автотрофному росту на сульфиде, способности к росту аэробно в темноте, отношению к температуре и рН среды). Температурные диапазоны развития бактерий устанавливали в градиентном термостате по описанной ранее методике (Юрков и др., 1991). Диапазон рН определялся с разными концентрациями бикарбоната и карбоната натрия. Для ряда бактерий определение температурного оптимума и оптимума рН проводили в краткосрочных опытах с помощью 14 С-бикарбоната по описанной ранее методике (Горленко, Кикина, 1979). Диапазон развития при разной минерализации среды определялся с разными концентрациями хлорида натрия, бикарбоната и карбоната натрия. Способность к использованию различных источников углерода проверяли на средах содержащих 0.1 г/л дрожжевого экстракта, в которую вносили испытуемые источники углерода в концентрации 2 г/л. Способность к использованию неорганических соединений проверяли на средах, содержащих 0.1 г/л дрожжевого экстракта, в которые были внесены испытуемые соединения в конечной концентрации 0.5-10 мМ. Биомассу бактерий определяли по изменению оптической плотности культуры при длине волны 650 нм на фотометре КФК-3. Спектр поглощения клеток АФБ определяли в ацетон-метанольных экстрактах (7:2) и in vivo в 50% растворе глицерина. Клетки предварительно разрушали с помощью ультразвука. Биохимические свойства бактерий, удельную скорость роста, численность бактерий определяли общепринятыми методами (Герхардт, 1984).

2.3.2 Методы электронной микроскопии

Для приготовления ультратонких срезов бактериальные клетки фиксировали по Ryter&Kellenberger (1958) и заключали в смесь эпоксидных смол (эпон). Срезы получали на ультратоме LKB "Ultrotome Nova" и помещали на медные сеточки покрытые коллодиевой пленкой и напыленные углеродом. Препараты окрашивали по Reynolds (1963). Тотальные препараты для электронной микроскопии получали обработкой клеток 1%-ной фосфовольфрамовой кислотой (ФВК), нейтрализованной щелочью до рН 7.

Анализ вертикальной структуры микробных сообществ с применением стекол обрастания и электронной сканирующей микроскопии проводился по описанной ранее методике (Юрков, Горленко, 1989). Сколы травертина просматривались под электронным сканирующим микроскопом, образцы прикреплялись к металлическому держателю с помошью углеродного клея. Исследуемая площадь на каждом образце составляла 0.05 мм².

Тотальные препараты, ультратонкие срезы, стекла обрастания и образцы травертина просматривали под электронным микроскопом JEM-100C или JEM-7 при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении от 8000 до 50000.

2.3.3 Методы гено- и хемосистематики

Выделение и очистка ДНК проведены А.М. Лысенко по стандартным методам (Marmur, 1961). Содержание ГЦ в ДНК определяли по температуре плавления ДНК (T_m) и рассчитывали по формуле Оуэна (Owen et al., 1969), гомологию ДНК-ДНК изучали методом оптической реассоциации (De Ley, 1970) на приборе "Pye-Unicam SP 1800" (Англия). Амплификацию и секвенирование генов 16S рРНК выделенных чистых культур проводился компанией MWG Biotech (High Point, North Carolina) с использованием следующих праймеров 5' -GTTTGATCCTGGCTCAG-3', 5' -ACGGYTACCT-TGTTACGACTT-3' и использованием специального набора TA cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, California).

Анализ последовательностей генов 16S рРНК выделенных штаммов был выполнен Т.П. Туровой с использованием программного обеспечения Ribosomal Database Project. Укорененное филогенетическое дерево исследуемых бактерий было создано с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, De Wachter, 1994).