Визначення статусу метилювання промоторї ділянки гена FOXP1 при розвитку карциноми прямого кишечника людини

Загальна характеристика захворювання та фактори ризику. Гістологічні типи карциноми прямого кишечника людини та їх молекулярні маркери. Характеристика генів підродини FOXP. Створення бібліотеки геномної ДНК із зразків пухлин прямого кишечника людини.

Рубрика Биология и естествознание
Вид курсовая работа
Язык украинский
Дата добавления 23.12.2013
Размер файла 1,1 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Ампліфікацію потрібних фрагментів проводили за допомогою методу ПЛР з використанням DreamTaq DNA полімерази. Реакцію проводили згідно рекомендацій виробника.

Мікропробірки поміщали на лід і вносили реактиви у нижче вказаному порядку: 16,7 мкл. деіонізованої води, буфер виробника (10х Dream Taq Buffer) -2,5 мкл, який містить Na+ - 500 мМоль, Mg2+ - 20мМоль, ДМСО - 1,25 мкл, прямий праймер - 0,5мкл (10 пМоль), зворотній праймер - 0,5 мкл (10 пМоль), розчин дМНФ - 0,5 мкл (0,2 мМоль). Після перемішування суміші додавали 0,2 мкл DreamTaq (1U) полімерази. В кожну пробірку вносили по 100 нг геномної ДНК. Для контролю на контамінацію в одну з пробірок замість матриці вносили деіонізовану воду. Суміш піпетували і поміщали в термоциклер. Нуклеотидні послідовності метил-специфічних та специфічних до неметильованих промоторів гена праймерів та розміри продуктів наведені в таблиці 3.2, умови ампліфікації у таблиці 3.3.

Таблиця 3.2 Нуклеотидна послідовнійсть праймерів

прямий та зворотній праймери

довжина продуктів ПЛР

Right M primer

TAAAAATAAAAATAACGACGACGAC

148 bp

Left M primer

TTTTTAATAAGTTTAATTTGAAATCGA

Right U primer

CCCTAAAAATAAAAATAACAACAACAAC

Left U primer

TTTTTTAATAAGTTTAATTTGAAATTGA

Таблиця 3.3 Умови ампліфікації гена FOXP1

Попередня денатурація

35 циклів

Фінальна елонгація

Денатурація

Тannealing

Елонгація

94 °C, 3 хв

95°C, 15 сек

60°C, 15 сек

72°C, 30сек

72 °C, 5хв

Був проведений гель-електрофорез MSP PCR продуктів з праймерами до метильованої ДНК в 8 % поліакриламідному гелі, а також PCR продуктів з праймерами до неметильованої ДНК у 1,5% агарознму гелі.

Приготування поліакриламідного гелю: змішували 10,6 мл 30% розчину акриламіду, 4 мл ТBЕ?10, 100мкл 10% персульфату амонію, 24 мкл ТЕМЕД. Заливали суміш у рамку для гелю, поміщали гребінку. Після закінчення полімеризації, виймали гребінку, промивали лунки ТBЕ буфером, наносимо 5 мкл ампліфікату, змішаного з 2 мкл барвника DNA Load Loading Dye.

Для подальшої оцінки молекулярної маси продуктів вносили 5 мкл ( 0,5 мкг) маркеру GeneRuler™100 bp DNA Ladder. Електрофорез проводили в два етапи :перший етап при силі струму 20 мА напрузі 4,5В/см протягом 10 хв, другий етап при силі струму 40 мА і напрузі 7,5 В/см протягом 100 хв. Фарбування здійснювали в розчині бромистого етидіуму ( концентрація розчину 0,5 мкг/мл ) протягом 15 хв. Отримані результати візуалізували на трансілюмінаторі ChemiDoс.

РОЗДІЛ 4 РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

4.1 Визначення статусу метилювання промоторної ділянки гена FOXP1

Кількість виділеної ДНК у пробі визначали спектрофотометричним методом. Відношення оптичної щільності, визначеної відповідно при ?260 та при ?280, вкладалася в рамки між 1,7 та 1,9, що свідчить про чистоту отриманої ДНК. Якість та цілісність виділеної геномної ДНК оцінювали за допомогою електрофорезу в 0,8%-му агарозному гелі. Зразок результатів представлений на рисунку 4.1.

Рис. 4.1 Зразок оцінки якості ДНК за допомогою 0,8 % агарозного гель-електрофорезу. Об'єм для нанесення - 6 мкл. М - маркер молекулярної маси 1 kp GeneRuler™, верхня смужка якого 10000 bp; 1-5 - геномна ДНК виділена з пухлин різних пацієнтів у концентраціях (в нг./мкл): 1 - CT108 (37,9); 2 - СТ103 (11,0), 3 - СN103 (29,3), 4 - CN132 (32,3), 5 - CT132 (67,6); 6 - позитивний контроль

Як бачимо з рисунку 4.1, агарозний гель-електрофорез не дає коректної інформації про кількість високомолекулярної ДНК у пробі. В той же час, кількісне визначення концентрації спектрофотометричним методом не дає уявлення про якість отриманого матеріалу. На електрофореграмі видно, що у всіх пробах відсутня смужка РНК, а довжина фрагментів ДНК становить близько 10 kb. Отже, для адекватної оцінки необхідно використовувати якісні і кількісні методи в комплексі.

За допомогою ПЛР з метилс-пецифічними праймерами провели ампліфікацію отриманої із зразків та бісульфітно обробленої ДНК та проаналізували проведеним 8 % ПААГ-електрофорезом. Зразок результатів ампліфікації з виявленим метилуванням промоторних ділянок гена FOXP1 представлено на рисунку 4.2.

Рис. 4.2. 8 % ПААГ-електрофорез ампліфікованих продуктів. Об'єм для нанесення - 5 мкл. М - маркер GeneRuler™ 100 bp; 1-16 - зразки ампліфікованої ДНК: 1 - СN104, 2 - CT104, 3 - CN109, 4 - CT109, 5 - CN116, 6 - CT116, 7 - CN117, 8 - CT117, 9 - CN119, 10 - CT119, 11 - CN126, 12 - CT126, 13 - CN127, 14 - CT127,15 - CN132, 16 - CT 132; 17 - негативний контроль; 18 - позитивний контроль

Рисунок 4.2 показує, що ПЛР з даною парою праймерів відбулася, довжина отриманих продуктів відповідає очікуваній, можна зробити висновок про метилювання промоторної ділянки гена FOXP1 у зразках пухлин усіх наведених 8 зразків та можливу відсутніcть метилювання у зразках умовно нормальних тканих цих же пацієнтів.

За допомогою ПЛР з праймерами, підібраними для визначення неметильованої промоторної ділянки гена FOXP1, провели ампліфікацію отриманої із зразків та бісульфітно обробленої ДНК та проаналізували проведенням 8 % ПААГ-електрофорезу. Зразок результатів ампліфікації представлено на рисунку 4.3.

Рис. 4.3. 1,5 % агарозного гель-електрофорезу ампліфікованих продуктів. Об'єм для нанесення - 5 мкл. М - маркер GeneRuler™100 bp; 1-12 зразки ампліфікованої ДНК: 1 - СТ102, 2 - СN102, 3 - CT103, 4 - CN103, 5 - CT118, 6 - CN118, 7 - CT120, 8 - CN120, 9 - CT122, 10 - CN122, 11 - CT125, 12 - CN125; 13 - позитивний контроль

Рисунок 4.3 показує, що ПЛР з даною парою праймерів відбулася, довжина отриманих продуктів відповідає очікуваній. Можна зробити висновок про відсутність метилювання промоторної ділянки гена FOXP1 в усіх вищенаведених зразках пухлин, де не було виявлено метилювання попередньо проведеною ПЛР. Загалом, позитивний результат показали усі зразки пухлин, в яких не було виявлено метилювання, та зарзки умовно нормальних тканин пацієнтів,у пухлинах яких метилювання виявлено. Отримані дані вказують також на відсутність делецій гена FOXP1 у досліджуваних зразках у зоні анелінгу, до якої комплементарні праймери, які могли б стати причиною відсутності полоски ампліфікованих з метилспецифічними праймерами продуків ПЛР на ПААГ-електрофорезі.

Метилювання промоторних ділянок генів та, як наслідок, втрата їх експресії, є однією з причин канцерогенезу, виявленою у різних типах пухлин. Загалом кількість випадків, спричинених гіперметилуванням становить близько 20-30% і є характерним для генів-онкосупресорів короткого плеча 3 хромосоми: VHL, hMLH, FHIT, RASSF1. Саме тут розташований ген-кандидат в онкосупресори FOXP1, для якого показано високий рівень експресії у нормальних тканинах людського організму та зниження її у пухлинах прямого кишечника людини. Нами виявлено метилювання промоторних ділянок FOXP1у 8 з 22 зразків, що складає 36,4%. Цей показник узгоджуються з даними, отриманими у результаті аналізу NotI мікрочипів пухлин прямого кишечника людини (33,3%).

ВИСНОВКИ

1. За даними опрацьованої літератури однією з причин розвитку карциноми прямого кишечника є аномальне метилювання регуляторних областей супресорних генів, що в свою чергу, корелює зі зниженням експресії. До цих генів-кандидатів в онкосупресори належить FOXP1, розташований у 3 хромосомі, в локусі 3p14.1.

2. Створено бібліотеку геномної ДНК із 22 зразків пухлин прямого кишечника людини та відповідних умовно нормальних тканин, отриманих у пацієнтів віком від 37 до 76 років.

3. У проаналізованих зразках карциноми прямого кишечника людини метилювання промоторного регіону гена FOXP1 у ділянці, до якої комплементарні праймери, було виявлено у 8 з 22 зразків, що складає 36,4%.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. M. Rodriguez-Bigas, E. Lin, C. Crane. Epidemiology of Colorectal Cancer // Holland-Frei Cancer Medicine.-2003. - P. 268-274.

2. N. Becker .Epidemiology of colorectal cancer // Radiologe. - 2003. - Vol. 43. - P. 98-104.

3. P.Boyle, J. Langman . ABC of colorectal cancer // BMJ. - 2000. - Vol. 321. - P. 805-808.

4. W.Willett. The search for the causes of breast and colon cancer // Nature. - Vol. 338. - 1986. - P. 389-394.

5. W.Willett. Diet, nutrition, and avoidable cancer // Environ Health Perspect. -1995 - Vol. 103. - P. 165-170.

6. K. Campbell, A. McTiernan. Exercise and Biomarkers for Cancer Prevention Studies // Cancer Journal for Clinicians. - 2007. - Vol. 137. - P. 1615-1695.

7. E. Botteri, S. Iodice, S. Raimondi, et al. Cigarette smoking and adenomatous polyps: a meta-analysis // Gastroenterology. - 2007. - Vol. 134. - P. 388-395.

8. W. Tsong , W. Koh , J. Yuan, et al. Cigarettes and alcohol in relation to colorectal cancer // BrJ Cancer. - 2007. - Vol. 96. -P. 821-826.

9. C. Felsen, A. Piasecki, J. Ferrante, et al. What you need to know about cancer of the colon and rectum // Cancer Journal for Clinicians. - 2006. - Vol. 36. - P. 605-611.

10. J.B. O'Connell, M.A. Maggard, J.H. Liu, et al. Rates of colon and rectal cancers are increasing in young adults // Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. - 2003. - Vol. 69. - P. 866-872.

11. A. Jemal, L. X. Clegg, E. Ward, et al. Annual report to the nation on the status of cancer in 1975-2001, with a special feature regarding survival // Cancer. - 2004. Vol. 101. - P. 3-27.

12. W. Zhenk, D. Gustafson, R. Sinha, et al. Chemacals, Cancer and You //. - 20. - P. 1-12.

13. R. Doll. Pecent Results in Cancer Resaerch // Cancer. - 1998. - Vol. 154. - P. 3-21.

14. M. Gerhardsson de Verdier, N. Plato , G. Steineck, et al. Occupational exposures and cancer of the colon and rectum // American Journal of Industrial Medicine. - 1992. - Vol. 22. - P. 291-303.

15. M. Howsam, J. Grimalt, E. Guino, et al. Organochlorine Exposure and Colorectal Cancer Risk // Environ Health Perspect. - 2004. - Vol. 112. - P. 1460-1466.

16. R. Clapp, M. Jacobs, E. Loechler. Environmental and Occupational Causes of Cancer New Evidence // Environ Health Perspect. - 2008. - Vol. 23. - P. 1-37.

17. A. Okeanov, E. Sosnovskaya, O. Priatkina. A national cancer registry to assess trendsafter the Chernobyl accident // Swiss Medical Weekly. - 2004. - Vol. 134. - P. 645-649.

18. J. DiSario, R. Burt, M. Kendrick, et al.Colorectal cancers of rare histologic types compared with adenocarcinomas // Diseases of the Colon and Rectum. - 1999. - Vol. 37 - P. 1277-1280.

19. G. Lanza. Colorectal tumors: the histology report // Digestive and Liver Disease. - 2011. - Vol. 43. - P. 344-355.

20. S. Hamilton, B. Vogelstein, S. Kudo, et al. Carcinoma of the colon and rectum International Agency for Research on Cancer. -2000. - Vol. 2. - P. 105-119.

21. R. Alteri, P. Bandi, D. Brooks, et.al .Colorectal Cancer Facts and Figures 2011-2013 // American Cancer Society. - 2011. - P. 1-25.

22. A. Sameer, S. Abdullah, M. Banday, et al. Colorectal cancer, TGF-? signaling and SMADs // International Journal of Genetics and Molecular Biology. -2010. - Vol. 2. - P. 101-111.

23. L. Johns, R. Houlston. A systematic review and meta-analysis of familial colorectal cancer risk // American Journal of Gastroenterology. - 2009. - Vol. 10. P. 2992-3003.

24. K. Soreide, B. Nedrebo. Endoscopy, Morphology, Morphometry and Molecular Markers: Predicting Cancer Risk in Colorectal Adenoma // Cancer. - 2009. - Vol. 9. - P. 125-137.

25. P. Annand, A. Kannumakkara, S. Tharakan, et al. Pathogenesis of cancer // Cancer Journal for Clinicians. - 2009. - Vol.61. - P. 61-90.

26. X. Meng, J. Zhong, S. Liu, M. Murray,et al.A new hypothesis for the cancer mechanism // Cancer Metastasis Review. - 2012. - Vol. 31. - P. 247-268.

27. D. Bishop, H. Thomas. The genetics of colorectal cancer // Cancer Survivan. - 1990. - Vol. 9. - P. 585-604.

28. V. Janout, H. Kollarova. Epidemiology of colorectal cancer // CECOG. - 2001. P. 5-10.

29. J. Jeter, W. Kohlmann, S. Gruber. Genetics of Colorectal Cancer // Medical Oncology Fellow. - 2006. -Vol. 20. - P. 1-3.

30. Имянитов Е.Н. Молекулярная онкология: клинические аспекты / Е. Н.Иминятов, К. П. Хансон - СПб.: Издательский дом СПбМАПО. - 2007.- 212 с.

31. S. Markowitz, M. Bertagnoli. Molecular basis of colorectal // England National Medical Journal. - 2009. - Vol. 36. - P. 2449 - 2460.

32. J.R. Jass. Classification of colorectal cancer based of clinical, morphologica and molecular features // Histopatology. - 2007. - Vol. 50. - P. 113-130.

33. E. Vilar, B. Gruber. Microsatellite instability in colorectal cancer - the stable evidence // National Review Clinical Oncology. - 2010. - Vol. 7. -P. 153-162.

34. Е. Kapiteijn. Mechanisms of oncogenesis in colon versus rectal cancer // Journal of Pathology. - 2001. - Vol. 195 - P. 171-178.

35. Ганцев Ш. X. Онкология: підручник / Ш. X. Ганцев. - М.: Медицинское информационное агентство. - 2006. - 488 с.

36. E. Fernebro. Predominance of CIN versus MSI in the development of rectal cancer at young // BMC Cancer. - 2002. - P. 2-25.

37. C. Compton. The Pathology Report in ColorectalCancer: A User's Guide // American Society of Clinical Oncology. - 2003. - P. 502-516.

38. J. Potter. Colorectal cancer: molecules and populations // National Cancer Institute Journal. - 1999. - Vol.91. - P. 916-932.

39. K. Matsuda, T. Masaki1, T. Watanabe, et all.Clinical Significance of MUC1 and MUC2 Mucin and p53 Protein Expression in Colorectal Carcinoma // Oxford journals. - 1998. - Vol. 30. - P.89-94.

40. T.Sjoblom, S. Jones, L.D. Wood, et al.The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers // Science. - 2006. - Vol. 314. - P. 268-74.

41. L Kelemen, M. Kobel. Mucinous carcinomas of the ovary and colorectum: di? erentorgan, same dilemma // Lancet Oncology. - 2011. - Vol. 12. -P. 1071-1080.

42. T. Pawlik, C. Raut, M. Rodriguez-Bigas. Colorectal carcinogenesis: MSI-H versus MSI-L // Diseases Markers. - 2004. - Vol. 20. - P. 199-206.

43. D. El Demellawy, M. Khalifa, N. Ismiil, et al. Primary colorectal small cell carcinoma: A clinicopathological and immunohistochemical study of 10 cases // Diagnostic Pathology. -2007. - Vol. 10. - P. 2-35.

44. I. Wistuba, C. Behrens, J. Albores-Saavedra. Distinct K-ras Mutation Pattern Characterizes Signet Ring Cell Colorectal Carcinoma // Cancer. - 2003. - Vol. 9. - P. 8-13.

45. P. Draganov, T. Dyson. Squamous cell cancer of the rectum // World Gastroenterology Journal. - 2009. - Vol. 15. - P. 380-386.

46. M. Wick, J. Vitsky, J. Ritter, et al. A Clinicopathologic Comparison With Nonhereditary Poorly Differentiated Enteric-Type Adenocarcinoma and NeuroendocrineColorectal Carcinoma // American Journal of Clinical Pathology. - 2005. - Vol. 123. - P.56-65.

47. B. Winn, R. Tavares, J. Fanion, et al. Differentiating the undifferentiated: immunohistochemical profile of medullary carcinoma of the colon with an emphasis on intestinal differentiation // Human Pathology. - 2009. - Vol. 40. - P. 398-404.

48. P. Alhopuro, S. Ylisaukkoja, W. Koskinen. The MDM2 promoter polymorphism and the risk of uterine leiomyosarcoma, colorectal cancer, and squamous cell carcinoma of the head and neck // Medical Genetic Journal. - 2005. Vol. 42. - P. 694-698.

49. H. Klaus. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors // Genes&Dev. - 2000. - Vol. 14. - Р. 142-146.

50. K. Maiese. Forkhead Transcription Factors: Vital Elements in Biology and Medicine // Advances in experimental medecine and biology. - 2009. - Vol. 665. - P.282-292.

51. A. Banham. The FOXP1 winged helix transcription factor is a novel candidate tumor suppressor gene on chromosome 3p // Canсer. - 2001. - Vol. 61. - Р. 8820-8829.

52. J. Philip, H. Banham. Homo sapiens forkhead box P1 // Transcription Factor Encyclopedia. - 2010. - P. 1-4.

53. S. Hannenhalli, K.H. Kaestner. The evolution of Fox genes and their role in development and disease // Genetic National Review. - 2009. - Vol. 10. - P. 233-240.

54.F. Berry1, J. Skarie, F. Mirzayans1, et al.FOXC1 is required for cell viability and resistance to oxidative stress in the eye through the transcriptional regulation of FOXO1A // Oxford Journals. - 2008. - Vol. 17. - P.490-505.

55. C. Nakada, A. Iida, Y. Tabata. Forkhead transcription factor foxe1 regulates chondrogenesis in zebrafish // Journal of Experimental Zoology Part. - 2009. - Vol. 312. - P. 827-840.

56. B. Jackson, C. Carpenter, D. Nebert. Update of human and mouse forkhead box (FOX) gene families // Human Genomics. - 2010. - Vol. 4. - P. 345-352.

57. M Gabut, P. Samavarchi-Tehrani, X. Wang, et al. An alternative splicing switch regulates embryonic stem cell pluripotency and reprogramming // Cell. - 2011. - Vol. 147. - P. 132-46.

58. S..Edge, D. Byrd, C. Compton, et al. TNM classifacaion // AJCC Cancer Staging Manual. - 2010. - P. 25-28.

59. T. Pavlova, V. Kashuba, O. Muravenko, et ll. Use of NotI Microarrays in Analysis of Epigenetic and Structural Changes in Epithelial Tumor Gnomes by the Example of Human Chromosome 3 // Molecuar Biology. - 2009. - Vol. 43. - P. 313-320.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

  • Коротка характеристика основних теорій походження людини. наукові ідеї Чарльза Дарвіна і його докази тваринного походження людини. Основні етапи еволюції людини та вплив на неї біологічних чинників. Антропогенез і характерні особливості сучасної людини.

    реферат [22,4 K], добавлен 27.03.2011

  • Наукова, релігійна та космічна теорії походження людини. Теорія Дарвіна, обґрунтування положення про походження людини від людиноподібних мавп. Теологічна гіпотеза створення людини Богом. Припущення, що життя принесено на Землю з космічного простору.

    презентация [461,5 K], добавлен 09.10.2014

  • Поняття мінеральних речовин та визначення їх необхідності в раціоні людини. Характеристика основних макро- та мікроелементів та їх походження, джерела в харчуванні. Результати нестачі в організмі людини, особливо дитини, даних речовин, їх поповнення.

    контрольная работа [31,9 K], добавлен 08.12.2010

  • Сучасні уявлення про морфологічну й соціальну еволюцію первісної людини. Схеми появи й еволюції перших людей, головні фактори походження свідомості людини. Філософія й соціальна антропологія про природу людини, людина в її співвіднесеності зі світом.

    реферат [27,4 K], добавлен 16.06.2010

  • Визначальні риси людини, завдяки яким вона займає найвищий щабель історико-революційного розвитку органічного світу. Основні етапи формування мовлення та мислення людини. Антропологічні області, які виокремлюються на етнічних теренах українського народу.

    контрольная работа [34,8 K], добавлен 12.07.2010

  • Аналіз концепцій визначення місця людини і суспільства у Всесвіті, що є одними із найважливіших елементів складної системи світосприйняття людства. Особливості учення В. Вернадського про генезис людини та ноосфери, що були наслідком розвитку біогеосфери.

    реферат [27,7 K], добавлен 12.06.2010

  • Вивчення геному людини в рамках міжнародної програми "Геном людини". Особливості гібридизації клітин у культурі, картування внутрішньо хромосомного і картування за допомогою ДНК-зондів. Можливості використання знань про структуру геному людини в медицині.

    курсовая работа [354,6 K], добавлен 21.09.2010

  • Гамети чоловічого і жіночого організму. Коротка характеристика процесу запліднення. Внутрішня будова статевих органів людини. Критичні періоди вагітності. Початок нового життя. Біосоціальна основа сім'ї. Пропорції тіла людини в різні періоди життя.

    презентация [6,6 M], добавлен 10.04.2014

  • Мобільні елементи у геномі людини. Характеристика ендогенних ретровірусів. Приклади позитивного впливу ендогенних ретровірусів на геном тварин і людини. Ендогенні ретровіруси у геномі людини. Інструменти лікування різних генетичних захворювань.

    реферат [19,8 K], добавлен 18.03.2014

  • Теоретичний аналіз ряду еволюційних напрямків, джерела яких виявляються ще в приматів. Основні етапи еволюції людини, яка складається із двох процесів - органічної еволюції й культурної еволюції. Виявлення залежності між органічною й культурною еволюцією.

    реферат [24,7 K], добавлен 27.05.2010

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.