Визначення статусу метилювання промоторї ділянки гена FOXP1 при розвитку карциноми прямого кишечника людини

Ампліфікацію потрібних фрагментів проводили за допомогою методу ПЛР з використанням DreamTaq DNA полімерази. Реакцію проводили згідно рекомендацій виробника.

Мікропробірки поміщали на лід і вносили реактиви у нижче вказаному порядку: 16,7 мкл. деіонізованої води, буфер виробника (10х Dream Taq Buffer) -2,5 мкл, який містить Na+ - 500 мМоль, Mg2+ - 20мМоль, ДМСО - 1,25 мкл, прямий праймер - 0,5мкл (10 пМоль), зворотній праймер - 0,5 мкл (10 пМоль), розчин дМНФ - 0,5 мкл (0,2 мМоль). Після перемішування суміші додавали 0,2 мкл DreamTaq (1U) полімерази. В кожну пробірку вносили по 100 нг геномної ДНК. Для контролю на контамінацію в одну з пробірок замість матриці вносили деіонізовану воду. Суміш піпетували і поміщали в термоциклер. Нуклеотидні послідовності метил-специфічних та специфічних до неметильованих промоторів гена праймерів та розміри продуктів наведені в таблиці 3.2, умови ампліфікації у таблиці 3.3.

Таблиця 3.2 Нуклеотидна послідовнійсть праймерів

Таблиця 3.3 Умови ампліфікації гена FOXP1

Був проведений гель-електрофорез MSP PCR продуктів з праймерами до метильованої ДНК в 8 % поліакриламідному гелі, а також PCR продуктів з праймерами до неметильованої ДНК у 1,5% агарознму гелі.

Приготування поліакриламідного гелю: змішували 10,6 мл 30% розчину акриламіду, 4 мл ТBЕ?10, 100мкл 10% персульфату амонію, 24 мкл ТЕМЕД. Заливали суміш у рамку для гелю, поміщали гребінку. Після закінчення полімеризації, виймали гребінку, промивали лунки ТBЕ буфером, наносимо 5 мкл ампліфікату, змішаного з 2 мкл барвника DNA Load Loading Dye.

Для подальшої оцінки молекулярної маси продуктів вносили 5 мкл ( 0,5 мкг) маркеру GeneRuler™100 bp DNA Ladder. Електрофорез проводили в два етапи :перший етап при силі струму 20 мА напрузі 4,5В/см протягом 10 хв, другий етап при силі струму 40 мА і напрузі 7,5 В/см протягом 100 хв. Фарбування здійснювали в розчині бромистого етидіуму ( концентрація розчину 0,5 мкг/мл ) протягом 15 хв. Отримані результати візуалізували на трансілюмінаторі ChemiDoс.

РОЗДІЛ 4 РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

4.1 Визначення статусу метилювання промоторної ділянки гена FOXP1

Кількість виділеної ДНК у пробі визначали спектрофотометричним методом. Відношення оптичної щільності, визначеної відповідно при ?260 та при ?280, вкладалася в рамки між 1,7 та 1,9, що свідчить про чистоту отриманої ДНК. Якість та цілісність виділеної геномної ДНК оцінювали за допомогою електрофорезу в 0,8%-му агарозному гелі. Зразок результатів представлений на рисунку 4.1.

Рис. 4.1 Зразок оцінки якості ДНК за допомогою 0,8 % агарозного гель-електрофорезу. Об'єм для нанесення - 6 мкл. М - маркер молекулярної маси 1 kp GeneRuler™, верхня смужка якого 10000 bp; 1-5 - геномна ДНК виділена з пухлин різних пацієнтів у концентраціях (в нг./мкл): 1 - CT108 (37,9); 2 - СТ103 (11,0), 3 - СN103 (29,3), 4 - CN132 (32,3), 5 - CT132 (67,6); 6 - позитивний контроль

Як бачимо з рисунку 4.1, агарозний гель-електрофорез не дає коректної інформації про кількість високомолекулярної ДНК у пробі. В той же час, кількісне визначення концентрації спектрофотометричним методом не дає уявлення про якість отриманого матеріалу. На електрофореграмі видно, що у всіх пробах відсутня смужка РНК, а довжина фрагментів ДНК становить близько 10 kb. Отже, для адекватної оцінки необхідно використовувати якісні і кількісні методи в комплексі.

За допомогою ПЛР з метилс-пецифічними праймерами провели ампліфікацію отриманої із зразків та бісульфітно обробленої ДНК та проаналізували проведеним 8 % ПААГ-електрофорезом. Зразок результатів ампліфікації з виявленим метилуванням промоторних ділянок гена FOXP1 представлено на рисунку 4.2.

Рис. 4.2. 8 % ПААГ-електрофорез ампліфікованих продуктів. Об'єм для нанесення - 5 мкл. М - маркер GeneRuler™ 100 bp; 1-16 - зразки ампліфікованої ДНК: 1 - СN104, 2 - CT104, 3 - CN109, 4 - CT109, 5 - CN116, 6 - CT116, 7 - CN117, 8 - CT117, 9 - CN119, 10 - CT119, 11 - CN126, 12 - CT126, 13 - CN127, 14 - CT127,15 - CN132, 16 - CT 132; 17 - негативний контроль; 18 - позитивний контроль

Рисунок 4.2 показує, що ПЛР з даною парою праймерів відбулася, довжина отриманих продуктів відповідає очікуваній, можна зробити висновок про метилювання промоторної ділянки гена FOXP1 у зразках пухлин усіх наведених 8 зразків та можливу відсутніcть метилювання у зразках умовно нормальних тканих цих же пацієнтів.

За допомогою ПЛР з праймерами, підібраними для визначення неметильованої промоторної ділянки гена FOXP1, провели ампліфікацію отриманої із зразків та бісульфітно обробленої ДНК та проаналізували проведенням 8 % ПААГ-електрофорезу. Зразок результатів ампліфікації представлено на рисунку 4.3.

Рис. 4.3. 1,5 % агарозного гель-електрофорезу ампліфікованих продуктів. Об'єм для нанесення - 5 мкл. М - маркер GeneRuler™100 bp; 1-12 зразки ампліфікованої ДНК: 1 - СТ102, 2 - СN102, 3 - CT103, 4 - CN103, 5 - CT118, 6 - CN118, 7 - CT120, 8 - CN120, 9 - CT122, 10 - CN122, 11 - CT125, 12 - CN125; 13 - позитивний контроль

Рисунок 4.3 показує, що ПЛР з даною парою праймерів відбулася, довжина отриманих продуктів відповідає очікуваній. Можна зробити висновок про відсутність метилювання промоторної ділянки гена FOXP1 в усіх вищенаведених зразках пухлин, де не було виявлено метилювання попередньо проведеною ПЛР. Загалом, позитивний результат показали усі зразки пухлин, в яких не було виявлено метилювання, та зарзки умовно нормальних тканин пацієнтів,у пухлинах яких метилювання виявлено. Отримані дані вказують також на відсутність делецій гена FOXP1 у досліджуваних зразках у зоні анелінгу, до якої комплементарні праймери, які могли б стати причиною відсутності полоски ампліфікованих з метилспецифічними праймерами продуків ПЛР на ПААГ-електрофорезі.

Метилювання промоторних ділянок генів та, як наслідок, втрата їх експресії, є однією з причин канцерогенезу, виявленою у різних типах пухлин. Загалом кількість випадків, спричинених гіперметилуванням становить близько 20-30% і є характерним для генів-онкосупресорів короткого плеча 3 хромосоми: VHL, hMLH, FHIT, RASSF1. Саме тут розташований ген-кандидат в онкосупресори FOXP1, для якого показано високий рівень експресії у нормальних тканинах людського організму та зниження її у пухлинах прямого кишечника людини. Нами виявлено метилювання промоторних ділянок FOXP1у 8 з 22 зразків, що складає 36,4%. Цей показник узгоджуються з даними, отриманими у результаті аналізу NotI мікрочипів пухлин прямого кишечника людини (33,3%).

ВИСНОВКИ

1. За даними опрацьованої літератури однією з причин розвитку карциноми прямого кишечника є аномальне метилювання регуляторних областей супресорних генів, що в свою чергу, корелює зі зниженням експресії. До цих генів-кандидатів в онкосупресори належить FOXP1, розташований у 3 хромосомі, в локусі 3p14.1.

2. Створено бібліотеку геномної ДНК із 22 зразків пухлин прямого кишечника людини та відповідних умовно нормальних тканин, отриманих у пацієнтів віком від 37 до 76 років.

3. У проаналізованих зразках карциноми прямого кишечника людини метилювання промоторного регіону гена FOXP1 у ділянці, до якої комплементарні праймери, було виявлено у 8 з 22 зразків, що складає 36,4%.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. M. Rodriguez-Bigas, E. Lin, C. Crane. Epidemiology of Colorectal Cancer // Holland-Frei Cancer Medicine.-2003. - P. 268-274.

2. N. Becker .Epidemiology of colorectal cancer // Radiologe. - 2003. - Vol. 43. - P. 98-104.

3. P.Boyle, J. Langman . ABC of colorectal cancer // BMJ. - 2000. - Vol. 321. - P. 805-808.

4. W.Willett. The search for the causes of breast and colon cancer // Nature. - Vol. 338. - 1986. - P. 389-394.

5. W.Willett. Diet, nutrition, and avoidable cancer // Environ Health Perspect. -1995 - Vol. 103. - P. 165-170.

6. K. Campbell, A. McTiernan. Exercise and Biomarkers for Cancer Prevention Studies // Cancer Journal for Clinicians. - 2007. - Vol. 137. - P. 1615-1695.

7. E. Botteri, S. Iodice, S. Raimondi, et al. Cigarette smoking and adenomatous polyps: a meta-analysis // Gastroenterology. - 2007. - Vol. 134. - P. 388-395.

8. W. Tsong , W. Koh , J. Yuan, et al. Cigarettes and alcohol in relation to colorectal cancer // BrJ Cancer. - 2007. - Vol. 96. -P. 821-826.

9. C. Felsen, A. Piasecki, J. Ferrante, et al. What you need to know about cancer of the colon and rectum // Cancer Journal for Clinicians. - 2006. - Vol. 36. - P. 605-611.

10. J.B. O'Connell, M.A. Maggard, J.H. Liu, et al. Rates of colon and rectal cancers are increasing in young adults // Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. - 2003. - Vol. 69. - P. 866-872.

11. A. Jemal, L. X. Clegg, E. Ward, et al. Annual report to the nation on the status of cancer in 1975-2001, with a special feature regarding survival // Cancer. - 2004. Vol. 101. - P. 3-27.

12. W. Zhenk, D. Gustafson, R. Sinha, et al. Chemacals, Cancer and You //. - 20. - P. 1-12.

13. R. Doll. Pecent Results in Cancer Resaerch // Cancer. - 1998. - Vol. 154. - P. 3-21.

14. M. Gerhardsson de Verdier, N. Plato , G. Steineck, et al. Occupational exposures and cancer of the colon and rectum // American Journal of Industrial Medicine. - 1992. - Vol. 22. - P. 291-303.

15. M. Howsam, J. Grimalt, E. Guino, et al. Organochlorine Exposure and Colorectal Cancer Risk // Environ Health Perspect. - 2004. - Vol. 112. - P. 1460-1466.

16. R. Clapp, M. Jacobs, E. Loechler. Environmental and Occupational Causes of Cancer New Evidence // Environ Health Perspect. - 2008. - Vol. 23. - P. 1-37.

17. A. Okeanov, E. Sosnovskaya, O. Priatkina. A national cancer registry to assess trendsafter the Chernobyl accident // Swiss Medical Weekly. - 2004. - Vol. 134. - P. 645-649.

18. J. DiSario, R. Burt, M. Kendrick, et al.Colorectal cancers of rare histologic types compared with adenocarcinomas // Diseases of the Colon and Rectum. - 1999. - Vol. 37 - P. 1277-1280.

19. G. Lanza. Colorectal tumors: the histology report // Digestive and Liver Disease. - 2011. - Vol. 43. - P. 344-355.

20. S. Hamilton, B. Vogelstein, S. Kudo, et al. Carcinoma of the colon and rectum International Agency for Research on Cancer. -2000. - Vol. 2. - P. 105-119.

21. R. Alteri, P. Bandi, D. Brooks, et.al .Colorectal Cancer Facts and Figures 2011-2013 // American Cancer Society. - 2011. - P. 1-25.

22. A. Sameer, S. Abdullah, M. Banday, et al. Colorectal cancer, TGF-? signaling and SMADs // International Journal of Genetics and Molecular Biology. -2010. - Vol. 2. - P. 101-111.

23. L. Johns, R. Houlston. A systematic review and meta-analysis of familial colorectal cancer risk // American Journal of Gastroenterology. - 2009. - Vol. 10. P. 2992-3003.

24. K. Soreide, B. Nedrebo. Endoscopy, Morphology, Morphometry and Molecular Markers: Predicting Cancer Risk in Colorectal Adenoma // Cancer. - 2009. - Vol. 9. - P. 125-137.

25. P. Annand, A. Kannumakkara, S. Tharakan, et al. Pathogenesis of cancer // Cancer Journal for Clinicians. - 2009. - Vol.61. - P. 61-90.

26. X. Meng, J. Zhong, S. Liu, M. Murray,et al.A new hypothesis for the cancer mechanism // Cancer Metastasis Review. - 2012. - Vol. 31. - P. 247-268.

27. D. Bishop, H. Thomas. The genetics of colorectal cancer // Cancer Survivan. - 1990. - Vol. 9. - P. 585-604.

28. V. Janout, H. Kollarova. Epidemiology of colorectal cancer // CECOG. - 2001. P. 5-10.

29. J. Jeter, W. Kohlmann, S. Gruber. Genetics of Colorectal Cancer // Medical Oncology Fellow. - 2006. -Vol. 20. - P. 1-3.

30. Имянитов Е.Н. Молекулярная онкология: клинические аспекты / Е. Н.Иминятов, К. П. Хансон - СПб.: Издательский дом СПбМАПО. - 2007.- 212 с.

31. S. Markowitz, M. Bertagnoli. Molecular basis of colorectal // England National Medical Journal. - 2009. - Vol. 36. - P. 2449 - 2460.

32. J.R. Jass. Classification of colorectal cancer based of clinical, morphologica and molecular features // Histopatology. - 2007. - Vol. 50. - P. 113-130.

33. E. Vilar, B. Gruber. Microsatellite instability in colorectal cancer - the stable evidence // National Review Clinical Oncology. - 2010. - Vol. 7. -P. 153-162.

34. Е. Kapiteijn. Mechanisms of oncogenesis in colon versus rectal cancer // Journal of Pathology. - 2001. - Vol. 195 - P. 171-178.

35. Ганцев Ш. X. Онкология: підручник / Ш. X. Ганцев. - М.: Медицинское информационное агентство. - 2006. - 488 с.

36. E. Fernebro. Predominance of CIN versus MSI in the development of rectal cancer at young // BMC Cancer. - 2002. - P. 2-25.

37. C. Compton. The Pathology Report in ColorectalCancer: A User's Guide // American Society of Clinical Oncology. - 2003. - P. 502-516.

38. J. Potter. Colorectal cancer: molecules and populations // National Cancer Institute Journal. - 1999. - Vol.91. - P. 916-932.

39. K. Matsuda, T. Masaki1, T. Watanabe, et all.Clinical Significance of MUC1 and MUC2 Mucin and p53 Protein Expression in Colorectal Carcinoma // Oxford journals. - 1998. - Vol. 30. - P.89-94.

40. T.Sjoblom, S. Jones, L.D. Wood, et al.The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers // Science. - 2006. - Vol. 314. - P. 268-74.

41. L Kelemen, M. Kobel. Mucinous carcinomas of the ovary and colorectum: di? erentorgan, same dilemma // Lancet Oncology. - 2011. - Vol. 12. -P. 1071-1080.

42. T. Pawlik, C. Raut, M. Rodriguez-Bigas. Colorectal carcinogenesis: MSI-H versus MSI-L // Diseases Markers. - 2004. - Vol. 20. - P. 199-206.

43. D. El Demellawy, M. Khalifa, N. Ismiil, et al. Primary colorectal small cell carcinoma: A clinicopathological and immunohistochemical study of 10 cases // Diagnostic Pathology. -2007. - Vol. 10. - P. 2-35.

44. I. Wistuba, C. Behrens, J. Albores-Saavedra. Distinct K-ras Mutation Pattern Characterizes Signet Ring Cell Colorectal Carcinoma // Cancer. - 2003. - Vol. 9. - P. 8-13.

45. P. Draganov, T. Dyson. Squamous cell cancer of the rectum // World Gastroenterology Journal. - 2009. - Vol. 15. - P. 380-386.

46. M. Wick, J. Vitsky, J. Ritter, et al. A Clinicopathologic Comparison With Nonhereditary Poorly Differentiated Enteric-Type Adenocarcinoma and NeuroendocrineColorectal Carcinoma // American Journal of Clinical Pathology. - 2005. - Vol. 123. - P.56-65.

47. B. Winn, R. Tavares, J. Fanion, et al. Differentiating the undifferentiated: immunohistochemical profile of medullary carcinoma of the colon with an emphasis on intestinal differentiation // Human Pathology. - 2009. - Vol. 40. - P. 398-404.

48. P. Alhopuro, S. Ylisaukkoja, W. Koskinen. The MDM2 promoter polymorphism and the risk of uterine leiomyosarcoma, colorectal cancer, and squamous cell carcinoma of the head and neck // Medical Genetic Journal. - 2005. Vol. 42. - P. 694-698.

49. H. Klaus. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors // Genes&Dev. - 2000. - Vol. 14. - Р. 142-146.

50. K. Maiese. Forkhead Transcription Factors: Vital Elements in Biology and Medicine // Advances in experimental medecine and biology. - 2009. - Vol. 665. - P.282-292.

51. A. Banham. The FOXP1 winged helix transcription factor is a novel candidate tumor suppressor gene on chromosome 3p // Canсer. - 2001. - Vol. 61. - Р. 8820-8829.

52. J. Philip, H. Banham. Homo sapiens forkhead box P1 // Transcription Factor Encyclopedia. - 2010. - P. 1-4.

53. S. Hannenhalli, K.H. Kaestner. The evolution of Fox genes and their role in development and disease // Genetic National Review. - 2009. - Vol. 10. - P. 233-240.

54.F. Berry1, J. Skarie, F. Mirzayans1, et al.FOXC1 is required for cell viability and resistance to oxidative stress in the eye through the transcriptional regulation of FOXO1A // Oxford Journals. - 2008. - Vol. 17. - P.490-505.

55. C. Nakada, A. Iida, Y. Tabata. Forkhead transcription factor foxe1 regulates chondrogenesis in zebrafish // Journal of Experimental Zoology Part. - 2009. - Vol. 312. - P. 827-840.

56. B. Jackson, C. Carpenter, D. Nebert. Update of human and mouse forkhead box (FOX) gene families // Human Genomics. - 2010. - Vol. 4. - P. 345-352.

57. M Gabut, P. Samavarchi-Tehrani, X. Wang, et al. An alternative splicing switch regulates embryonic stem cell pluripotency and reprogramming // Cell. - 2011. - Vol. 147. - P. 132-46.

58. S..Edge, D. Byrd, C. Compton, et al. TNM classifacaion // AJCC Cancer Staging Manual. - 2010. - P. 25-28.

59. T. Pavlova, V. Kashuba, O. Muravenko, et ll. Use of NotI Microarrays in Analysis of Epigenetic and Structural Changes in Epithelial Tumor Gnomes by the Example of Human Chromosome 3 // Molecuar Biology. - 2009. - Vol. 43. - P. 313-320.

Размещено на Allbest.ru