Визначення статусу метилювання промоторї ділянки гена FOXP1 при розвитку карциноми прямого кишечника людини

Курсова робота

студентки 3 курсу бакалаврату

денної форми навчання

Борсук М.М.

Науковий керівник від кафедри

к.б.н. Дергай О.В.

Київ - 2013г.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

IBD - запальні захворювання кишечника

ДНК - дизокси рибонуклеїнова кислота

СRC - колоректальний рак

ССП - синдром сімейного поліпозу

LOH - втрата гетерозиготності

MSI - мікросателтна нестабільність

FAP - сімейний аденоматозний поліпоз

MMR - репарація місметчів

MSP PCR - метилспецифіна ПЛР

CIMP - фенотип із CpG метильованими острівцями

SmCC - дрібноклітинна карцинома

TF - транскрипційний фактор

мРНК - матрична рибонуклеїнова кислота

ПААГ - поліакриламідний гель

ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція

ВСТУП

Карцинома прямого кишечника - актуальна проблема через високий відсоток поширеності і смертності цього захворювання. На її частку припадає понад 9% усіх випадків раку (9,4% у чоловіків та 10,1% у жінок) [2, 3]. Це третя найбільш поширена форма пухлин і 4 найбільш поширена причина смерті у світі. Важливою клінічною характеристикою цього типу захворювання є стійкість до хіміо- та радіотерапії, як наслідок основним успішним способом лікування є хірургічне видалення пухлини [1]. Найбільш поширеним підтипом карцином прямого кишечника є аденокарцинома із варіаціями розміру та структури залозистої тканини. Вона складає близько 90-95 % усіх випадків колоректального раку, тому важливим є дослідження причин виникнення даного типу CRC [20].

Одним із типів патогенезу колоректального раку є порушення епігенетичної регуляції в клітині, що призводить до аномального метилювання регуляторних областей супресорних генів та блокування їх функції [32]. Загалом кількість випадків, спричинених епігенетичним гіперметилуванням становить близько 20-30% [24]. Головною рисою аденокарцином є втрата ділянок короткого плеча 3 хромосоми, де розміщені відомі гени-онкосупресри: VHL, hMLH, FHIT, RASSF1. Для них є доведеним факт епігенетичної інактивації, тобто втрати функції за рахунок аномального гіперметилювання промоторних регіонів. Але існують випадки пухлин, де функціонування вищезазначених генів не порушене. Таким чином, в короткому плечі 3 хромосоми повинні міститися інші гени-супресори пухлинного росту. Ідентифікація генетичних та епігенетичних змін в 3 хромосомі робить можливим виявлення нових генів-онкосупресорів.

Саме тут розташований ген-кандидат в онкосупресори FOXP1, для якого показано високий рівень експрсії у нормальних тканинах людського організму. Гени родини FOX є надродиною еволюційно консервативних транскипційних факторів, які контролюють широкий спектр біологічних процесів. Як наслідок, втрата чи посилення функцій FOХ може змінити клітинну долю, спричиняючи розвиток раку. Але його роль у канцерогенезі на даний момент ще не з'ясована [51]. Відмінності експресії мРНК FOXP1 між нормальними і пухлинними зразками були виявлені у 51% випадків. З них найбільший рівень втрати експресії в 73% випадках спостерігався у пухлинах товстої кишки, тобто вищезазначений ген виконує роль онкосупресора [34]. При аналізі NotI - мікрочипів зразків пухлин прямого кишечника , проведених раніше, було виявлено зменшення рівня гібридизації у 33,3 % зразків.

Об'єктом дослідження даної роботи виступають генетичні та епігенетичні зміни гена FОXP1 в пухлинах прямого кишечника людини у порівнянні з нормальною тканиною.

Предметом цієї роботи, обраним на підставі результатів аналізу NotI - мікрочипів пухлин прямого кишечника людини, є статус метилювання промоторного регіону гена FОXP1 в пухлинах прямого кишечника людини у порівнянні з нормальною тканиною.

Метою даної роботи є дослідження статусу метилування промоторного регіону гена FОXP1.

Завдання:

- аналіз причин канцерогенезу прямого та товстого кишечника людини на основі літературних даних;

- створення бібліотеки геномної ДНК із зразків пухлин прямого кишечника людини;

- визначення статусу метилування промоторного регіону гена FОXP1 методом метилспецифічної ПЛР.

Отримані дані можуть бути викристані у подальших дослідженнях ролі гена FOXP1 у канцерогенезі прямого кишечника людини; розробленні методів детекції раку на ранніх стадіях, коли можливе успішне його лікування; нагромадження знань про заходи, які можуть знизити ризик його розвитку чи поліпшити результати лікування.

РОЗДІЛ 1 ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА КАРЦИНОМИ ПРЯМОГО КИШЕЧНИКА ЛЮДИНИ

1.1 Загальна характеристика захворювання та фактори ризику

У розвинутих країнах близько половини усіх смертей складають захворювання системи кровообігу, а чверть - карцинома. Близько 10 млн випадків зараз діагностується кожен рік. Колоректальний рак (1 млн. на рік) є третьою найбільш поширеною формою після карциноми легень (1,35 млн. на рік) та молочної залози (1,15 млн на рік). Епідеміологічні дослідження дають інформацію про відмінності у віці, статі хворих, а також у географічному поширенні хвороби. Він вражає чоловіків і жінок майже рівномірно, при цьому близько 401 000 нових випадків у чоловіків щорічно і 381 000 у жінок, тобто 9,4% всіх інцидентів раку у чоловіків і 10,1% жінок [3].

Протягом 1973-1999 років захворюваність на карциному прямого кишечника серед пацієнтів віком більше 60 років знизилася на 11% і становила 72,1 на сто тисяч осіб, для пацієнтів віком 20-40 років зросла на 75% і становила 1.4. Співвідношення слабо диференційованих пухлин складало 22,2% та 14,7% у молодих та старших людей відповідно. Зміну частоти за цей період можна пояснити полегшенням діагностики в результаті поширення і початку рутинного використання ультразвукового обстеження і контрастної томографії, видалення ректальних поліпів перед їхнім прогресуванням у рак, а не справжнім зростанням рівня захворюваності [10].

Протягом 1999-2007 років загальний рівень захворюваності та смертності як у чоловіків, так і у жінок знизився, і є стабільним, що відображає прогрес у профілактиці, ранньому виявлені та лікуванні раку. Виживання за 5 останніх років людей з колоректальним раком становить від 60% у Китаї до 64% у США. Якщо захворювання детектоване на ранній стадії, виживання за цей же період часу зростає до 90%, але лише 39% випадків раку прямої кишки діагностуються на даній стадії. У 2012 році 51690 людей померло [11].

Карциноми прямого кишечника частіше зустрічаються у міських популяціях, порівняно із сільськими. Це спостереження можна пояснити гігієнічними умовами та звичкою паління в містах. Частоти захворювання в різних країнах неоднакові. Особливості їх географічного розподілу наведено в таблиці 1.1. Якщо в прозахідних країнах (Північна Америка, Північна, Південна та Західна Європа, Австралія та Нова Зеландія) колоректальний рак складає 12,6% всіх інцидентів раку у чоловіків і 14,1% жінок, в інших близько 7,7% і 7,9% відповідно [3].

Таблиця 1.1 Геогафічний розподіл CRC [3]

Основною причиною розвитку карциноми прямого кишечника зазвичай вважають спадкову схильність, а вплив екзогенних факторів ризикує практично невивченим [8].

Мета всіх досліджень є запобігання захворювання і нагромадження знань про заходи, які можуть знизити ризик його розвитку; виявлення на стадії, коли воно ще виліковне, або поліпшення результатів лікування. Для попередження хвороби використовують гормональну терапію.

Саме завдяки ідентифікації факторів ризику стає можливим здійснення привентивних стратегій лікування. Фактори ризику є спільними для багатьох злоякісних новоутворень, але неможливо визначити їх сукупність та співвідношення,яке викличе захворювання в людини. Тобто, рак є багатофакторним і багатоступінчастим.

Екологічні чинники відіграють важливу роль в етіології захворювання. 70-80% випадків зумовлені соціальними факторами, способом життя. Смертність від раку, розвиток якого спричинений забрудненням довкілля, становить 1-5% загальної [3].

Було показано збільшення ризику виникнення хвороби серед курців, який прямо корелює з кількістю вжитих за день цигарок та зворотньо із віком початку паління в порівнянні з ризиком захворювання у людей, які ніколи не палили. Він становить 2,14 для поточних курців та 1,47 для колишніх. Деякі дослідження стверджують, що ризик для курців зрівнюється з ризиком для некурців тільки через п'ять років після відмови від шкідливої звички, що також залежить від кількості спожитого тютюну. Паління в 2,84 рази підвищує ризик прогресування хвороби після операції [7]. Смертність від раку, спричиненогопалінням, становить 29-31% від загальної [13].

Для людей, які п'ють 7 або більше алкогольних напоїв у тиждень ризик розвитку захворювання у порівнянні з тими, котрі не п'ють взагалі становить 1,72 [8].

За оцінками Міжнародного агентства з вивчення раку 25% випадків захворювання в світі спричинені надмірною вагою [6]. У 1990 Willett та ін. опублікували результати дослідження, дані яких підтримують гіпотезу, що високе споживання тваринних жирів, зменшене клітковини, фолієвої кислоти та кальцію підвищує ризик розвитку раку товстої кишки. Дієта з меншою кількісю тваринних жирів і більшою фруктів і овочів сприяє зниженню ризику його появи [4]. Використовуючи останні дані, було підраховано, що близько 32% випадків захворювання раком можна уникнути шляхом зміни харчування. Відомий ефект пригнічення вітаміном D росту клітинних ліній карциноми in vitro [5].

Дані епідеміологічних досліджень стверджують, що у людей із високим рівнем фізичної активності ризик захворювання зменшений [3].

Також резистентність до інсуліну (дефекти дії, зниження синтезу, гіперглікемія, гіперінсулінемія) супроводжується підвищенням рівня ризику розвитку колоректального раку. Тому вища захворюваність також виявлена у людей з цукровим діабетом другого типу. Виразковий коліт, хвороба Корна, IBD, рак молочної залози, матки, яєчників у жінок також підвищують можливість розвитку пухлин прямого кишечника на багатьох років [6]. Холецистектомія збільшує ризик виникнення CRC до 1,21 для чоловіків та 1,24 для жінок, проте це можливо у менше, ніж 50 % випадків [28].

Поліпи на внутрішній стінці товстої або прямої кишки часто зустрічається у людей старше 50 років. Більшість є доброякісними, але деякі можуть стати злоякісними. Пошук і видалення поліпів може зменшити ризик розвитку колоректального раку.

Вік більше 50 років збільшує ризик - біля 90 відсотків людей з цим захворюванням діагностується у ці роки. Середній вік на момент встановлення діагнозу становить 72 роки [6].

Людський організм піддається дії великої кількості хімічних речовин кожен день, але цей вплив зазвичай незначний і не позначається на стані здоров'я. Проте, є ті, які підвищують ризик виникнення раку: бензол, берилій, азбест, хлорид вінілу, миш'як. Цей ризик прямо пропорційно залежить від кількості канцерогенів, як довго і як часто вони впливають на організм. Виявлено хімічні речовини, які викликають рак у тварин, але не доведено їх канцерогенний вплив на людський організм. Вони є можливими канцерогенами [12].

Підвищений ризик раку прямого кишечника виявлено для працівників АЗС, автомобільних ремонтних робітників і становить 2,3; які піддаються впливу азбесту - 1,8; сажі - 2,2; мастильно-охолоджуючих речовин - 2,1 (використовуються у металообробній промисловості, друкарстві, спінінгу бавовни і джуту, тобто текстильній промисловості); продуктів згоряння коксу, деревини, вугілля - 1,9 [14].

Підвищений ризик розвитку CRC пов'язаний з концентрацією моно- орто- поліхлорованих біфенілів в крові, який для моно-пхб при середніх та високих концентраціях становить відповідно 1,82 і 2,94. Ніякої кореляції між впливом на організм феноксикислот та патологією не виявлено [15].

Тригалометани, до яких відносять хлороформ, бромодихлорметан, хлордибромометан, бромоформ, ксилол (розчинник для фарб та лаків), пестициди, гербіциди, фунгіцди, інсектициди (наприклад, хлордан і токсафен, які містяться у складі пестицидів) підвищують ризик розвитку хвороби, який для останніх становить 1,7 та 2,0 відповідно.

При тривалому впливу випарів металів (20 років і більше ) ризик розвитку раку прямого кишечника зростає у 2 рази. Підвищений ризик і при впливу на організм альдрину, ДДТ, дільдрину, гептахлору та ліндану.

Радіоактивне випромінювання підвищує рівень ризику розвитку захворювання, що прямо корелює із силою і часом опромінення організму. Спостерігається виникнення захворювання у 7% людей при опроміненні дозою більше 400 мЗв. Серед ліквідаторів катастрофи на Чорнобильській АЕС, які отримали дозу опромінення 100 мЗв на 5,2% підвищилась частота випадків хвороби за рік, серед жителів забруднених зон, які отримали дозу менше 50 мЗв частота зросла до 3,4. Збільшена можливість виникнення колоректального раку повторно, після перенесення захворювання, а також при змінах в певних генах [9]. Близько 75 % випадків є спорадичними, 25% хворих мають сімейну історію [22]. Ризик розвитку захворювання для людини, серед членів близької сім'ї якої було виявлено рак у особи менше 45 років становить 3,9; у особи від 45 до 65 років - 2,25; у особи більше 60 років 1,82; більше одної особи - 4,3; поліпи у одного члена сім'ї - 2,0 [23].

Рак, причиною якого є мутації певних генів становить всього 5-6 % випадків. Проте, цілком імовірно, інші невідкриті гени на тлі негенетичних факторів ризику роблять свій внесок у розвиток хвороби [22].

1.2 Гістологічні типи карциноми прямого кишечника та їх молекулярні маркери

Карцинома - захворювання, яке виникає в результаті складного комплексного процесу, який ґрунтується на змінах у генетичному спадковому матеріалі (ДНК), що призводять до порушення регуляції клітинного циклу, апоптозу, диференціації, морфогенетичних реакцій клітини, а також до неефективного функціонування факторів специфічного і неспецифічного протипухлинного імунітету. Канцерогенез - це складний процес, який включає не менше шести стадій, і відбувається за участю різних класів генів. Карцинома прямого кишечника є гетерогенною групою пухлин із характерними гістопатологічними, морфологічними рисами, молекулярними особливостями. Дані характеристики використовуються для класифікації типу захворювання, основа якої полягає у визначенні місця виникнення, ступеня клітинної диференціації, обсягу анатомічного поширення. Встановлення належності до певного типу полегшує діагностику, ідентифікацію спадкових пухлин, планування лікування, прогнозування поведінки раку при застосуванні конкретного виду терапії.

Найбільш повною і досконалою на сьогодні є класифікація Всесвітньої організації охорони здоров'я, сьоме видання якої було опубліковане у 2009 році. Виділяють епітеліальні та неепітеліальні гістологічні типи пухлин прямого кишечника [20]. Близько 95% випадків раку є карциноми, які належать до епітеліального типу [22]. У медичній практиці також використовують ТNM класифікацію, у якій T - ступінь місцевого поширення пухлини, N - наявність метастазів виключно у лімфатичні вузли, М - наявність віддалених метастазів [19].

Нижче, в таблиці 1.2 наведено класифікацію ВООЗ із вказанням індексів, що відповідають Міжнародній класифікації захворювань (ICD-O).

Таблиця 1.2 Типи карцином прямого кишечника людини [20]

Примітка: цифри після косої риски вказують на ступінь злоякісності пухлини: 0 - доброякісна, 3 - злоякісна

Описують наступні етапи колоректального раку:

- 0 стадія: рак знаходиться тільки в самій внутрішній оболонці товстої або прямої кишки;

- I стадія: пухлина виросла у внутрішній стінці і не проникає крізь неї;

- II стадія: пухлина поширюється в більш глибокі шари через стінки товстої або прямої кишки. Можливо, вторглася в довколишні тканини, але ракові клітини не поширилися на лімфатичні вузли;

- III стадія: пухлина поширилась на сусідні лімфатичні вузли, але не на інші частини тіла;

- IV стадія: пухлина пошириласьна інші частини тіла, такі як печінка або легені [25].

Клінічна картина на ранніх стадіях, так само як і при інших пухлинах порожнинних органів, не має яскравих симптомів. Лише з ростом пухлини в просвіт кишки у хворих з'являються неприємні відчуття тупого болю при дефекації, виділення з калом крові й слизу, а потім деформація калових мас. Надалі ознаки хвороби наростають, у важких випадках спостерігаються кишкова непрохідність, кровотеча, запальні ускладнення. Пухлина може проростати в сечовий міхур, піхву, викликати здавлення сечоводів та ін. Метастазування відбувається як через систему ворітної вени (метастази в печінку), так і через нижні ректальні вени в систему нижньої порожнистої вени (метастази в легені, головний мозок, наднирники, кістки) [35].

Від 65 % до 85 % усіх впадків CRC є спорадичними, 10-30 % - сімейними. Існує декілька спадкових синдромів, які сприяють розвитку CRC і передаються за аутосомно-домінантним типом. Вони становлять близько 6 % загальної кількості випадків [29]. У 2012 році запропонована нова гіпотеза розвитку раку, згідно з якою це - природний процес пов'язаний із загоєнням пошкоджень, який включає в себе ремоделювання тканини, активацію онкогенів, виділення цитокінів. Останні впливають на ділення стовбурових клітин, щоб загоїти деструкцію. Проте, якщо вплив канцерогену довготривалий чи достатньо сильний, цей процес продовжується постійного і призвлдить до виникнення ракової маси. Підсумком даних подій буде вичерпання системи, тобто смерть [26].

Модель ініціації та прогресування CRC запропонували Ферон та Вогельштейн, які спершу ідентифікували APC ген розміщений у довгому плечі 5 хромосоми, гени короткого плеча 18 хромосоми (зокрема гени TP53, та DCC), ген KRAS короткого плеча 12 хромосоми. Їхні мутаії роблять внесок у розвиток CRC. У цьому процесі багато додаткових генів також беруть участь. Тобто розвиток пухлини має акумулятивну природу та може відбуватися по альтернативним шляхам канцерогенезу, мати різні клінічні наслідки. На даний час досліджено три шляхи канцерогенезу на молекулярному рівні [24, 27].

Хромосомна нестабільність - характерна особливість першого типу СRС, при якому спостерігаються численні делеції, ампліфікації і перебудови великих ділянок хромосом. Подібний стан геному характерний для всіх новоутворень, включаючи раки молочної залози, яєчників, простати, шлунку і т.д. [30]. Виявлено близько 69 генів, які мають відношення до розвитку пухдин прямої кишки, а окремі зразки містять біля 9 генів-мутантів. Деякі з них беруть участь у Wnt/бета-катеніновому сигнальному шляху [40]. Механізми виникнення хромосомної нестабільності ще недостатньо вивчені; однією з причин може бути мутація в гені BUB1 [30].При цьому типу майже завжди мутовані гени TP53, АРС і SMAD4, спостерігається часта мутація KRAS і PIK3CA генів, відбувається втрата гетерозиготності переважно в довгому плечі 18 хромосоми або короткому плечі 17, а також 8р і 22q ділянках [31]. При зміні KRAS відмічена втрата реакції клітин пухлини на IgG1 та IgG2 (використовують для лікування), мішенню яких є EGFR, BRAF, V600E [30]. Також відмічені мутації з низькою пенетрантністю у генах TGF?R1, HRAS1, VNTR, BLMAsh. Проте ці дані мають більше значення для розумінання механізму виникнення CRC, ніж для практичного застосування у діагностиці. Досліджено, що мутації гена MTHFR677V зменшують ризик захворювання [29]. Є дані про ампліфікацію с-MYC, посилення експресії HER-2/NEU, втрату гетерозиготності на ділянках 1р, 8р [37]. Існують докази того, що загальний метаболічний стан може забезпечити середовище, яке збільшує або зменшує імовірість прогресування раку. Як, наприклад, поліморфізм генів MTHFR, NAT1, NAT2, які пов'язані із метаболічними шляхами фолієвої кислоти та гетероциклічних амінів [38]. Виявлено зв'язок між мутаціями MUC1, MUC2 і розвитком колоректального раку, формуванням регіональних та віддалених метастазів. При чому частота для першого складає 43 %, для другого - 33 % [39].

Карцинома цього типу локалізується, в основному, в дистальній частині товстої кишки - низхідна частина ободової кишки, сигмовидна і пряма кишки [30, 31].

2-й тип зустрічається у 1/3 хворих, частіше в проксимальних відділах товстої кишки (сліпа кишка, а також висхідна і поперечна частини ободової). Цей тип характеризується мікросателітною нестабільністю, що є результатом інактивації білків репарації ДНК. ДНК цих пухлин містить величезну кількість мікромутацій, що вражають моно-, ди-, тринуклеотидні повтори, при цьому структура хромосом залишається доволі інтактною. Не характерні втрати алелей в 17р, 18q, 5q ділянках; рідко трапляються мутації генів TP53 і АРС, реєструються мутації рецепторів ІІ типу білкових продуктів TGFB, ВАХ, TGF4, а також каспази 5, часто мутовані гени BRAF, PIK3CA, характерними є зміни генів hMSH2, hMLH1, hMSH3, що відповідають за репарацію ДНК [31, 32, 33]. Розрізняють два MSI фенотипи: MSI-H, для якого характерний високий рівень мікросателітної нестабільності, та MSI-L з низьким рівенем мікросателітної нестабільності [42].

Третім типом патогенезу СRС є порушенні епігенетичної регуляції в клітині, що призводить до аномального метилювання регуляторних областей супресорних генів та блокування їх функції. Цей тип може асоціюватися з MSI фенотипом, так як гіперметилювання часто призводить до інактивації гена hMLH1 [34].

J. R. Jass обгрунтовано доводить, що колоректальний рак є генетично дуже гетерогенним, тому подрібно виділяти не менше 5 його типів [32].

Загалом у 70-80 % хворих спостерігаються валові хромосомні перебудови, у 20-30 % - епігенетичне гіперметилювання, з яких у 15-20 % - мікрсателітна нестабільність [24]. У 74% від загальної кількості спостерігалася LOH по маркерам для TP53 і APC, що може бути результатом делецій фрагментів нуклеотидної послідовності, яка призводять до зменшення кількості алелей. Більшість пухлин були анеуплоїдними [34]. Такожє дані, що розвиток СRC у молодих пацієнтів також асоційований з анеуплоїдією, збільшенням експресії P53 і ?-катеніну, в той же час MSI і мутації KRAS мають низьку частоту [36].

За останні 5 років було досліджено генетичні основи спадкових синдромів, які значно підвищують ризик розвитку колоректального раку. До них відносяться FAP, синдром Лінча, ювенільний поліпоз, синдром Пейтца-Егерса.

Ген сімейного поліпозу APC, який є пухлинним геном-супресором, локалізований у ділянця 5q, а втрати локусів 5 хромосоми спостерігаються при розвитку неспадкових спорадичних аденом та карцином [27]. У 90-95 % сімей із даним синдромом спотерігаються мутації APC, з яких у 25 % осіб вони виникають de novo. Прогресування множинного поліпозу виникає при мутаціях гена MYH, який забезпечує ексцизійну репарацію. При цьому можливе збереження окисного пошкодження генів, в тому числі APC, трансверсії GC у AT пари. Цей тип поліпозу спадкується аутосомно-рецисивно, на відміну від інших синдромів. Проте, деякі дослідження стверджують, що одноалельні мутації гена підвищують ризик розвитку захворювання. У 30 % людей із множинним поліпозом та відсутністю мутації APC гена спостерігаються біалельні мутації MYH. Середній вік розвитку захворювання стонивить 40-50 років. Cеред усіх випадків раку 35-39 % становлять муцинозні аденокарциноми, 24 % недиференційовані пухлини.

Синдром Лінча (спадковий неполіпозний колоректальний рак) є аутосомно-домінантним синдромом, який характеризується раннім розвитком захворювання та мікросателітною нестабільністю. На відміну від пацієнтів із спонтанним СRC, у яких злоякісна трансформація розвивається від 7 до 10 років, у людей із синдромом Лінча цей процес займає до 3 років. Середній вік початку розвитку раку становить 44 роки. Приблизно третина випадків обумовлена мутаціями в MLH1, ще третину через мутації MSH2, і дуже невеликий відсоток мутаціями MSH6 і PMS2 [29].

Ювенільний поліпозний синдром частіше зустрічається у дітей, але може виникнути у будь-якому віці. Частота знаходится у межах 1 на 16 000 та 1 на 100 000. У близько 30 % хворих колорктальний рак розвивається у віці до 35 років, у 68 % - до 60 років. Синдром спадкується за аутосомно-домінантним типом. У 15 % спостерігаються мутації MADH4 (також відомому як SMAD4), який є пухлинним геном-супресором. Ще 25 % пацієнтів характерні мутації BMPR1A, який кодує серин-треонін кіназу [29].

Синдром Пейтца-Егерса зустрічається з частотою в межах від 1 на 25 000 до 1 на 280 000. Близько 30 % від загальної кількості випадків припадає на прямий кишечник. Поліпи даного виду відносяться до гамартоматозних, супроводжуються пігментацією слизових оболонок та шкіри. Характерним є прорив залозистих клітин через м'язову пластинку слизової оболонки. У 70 % пацієнтів спостерігаються мутації гена STK11/LKB1, який у нормі разом із TP53 забезпечує індукцію апоптозу. Синдром спадкується за аутосомно-домінантним типом та у зв'язку із високою пенетрантнісю близько 50 % хворих мають уражених батьків. Швидкість мутацій de novo залишається невідомою [29].

Найбільш поширеним підтипом карцином прямого кишечника є аденокарцинома із варіаціями розміру та структури залозистої тканини. Вона характеризується клітинами великих розмірів, а просвіти залозистої тканини часто містять зруйновані клітини. Цей тип поділяють на папілярний, тубулярний та муцинозний [20]. Захворювання розвивається повільно, протягом періоду від 10 до 15 років. Зазвичай пухлина починається як доброякісний поліп, який утворюється на слизовій оболонці. Близько 10 % усіх аденом прогресують у рак. Якщо у пацієнта спостерігається дана доброякісна пухлина більше 20 років, у 25 % випадків вона трансформується у злоякісну [21]. У близько 7 % людей з діагностованим захворюванням розвивається метахронний CRC протягом 5,6 років. При цьому молекулярні маркери hTERT та сурвівін були незалежними прогностичними факторами, а проксимальна локалізація єдиним клінічним [24].

Позначення муцинозна аденокарцинома використовують, якщо більше 50 % ураження складається з муцину. Екстраклітинний слиз містить групи чи поодинокі клітини злоякісного епітелію. Більшість карцином із MSI належить саме до цього гістологічного типу і несуть більшу небезпеку для людини, ніж стабільні [20]. Крім того, цей тип пухлин має більшу схильність до розвитку перитонеальних метастазів, ураження сусідніх органів, лімфатичних вузлів, частіше спостерігаються дефекти MMR, має більшу частоту CIMP та рідкісні мутаії P53, в 22 % состерігалась MSI-H [19]. Також у близько 30 % пацієнтів виявлено мутації KRAS, у 20 % BRAF, APC у 24 %, TP53 у 33%, CK7 у 10%, CDX2 у 59%, MUC2 у 92%, MUC5AC у 51%, ампліфікацію HER2 у менше 1 % [41].

Близько 3% випадків раку прямого кишечника складають не аденокарциноми (включаючи 33% плоскоклітинну карциному, 33% злоякісні карциноїди, 16% перехідні, 11% лімфоми, 4% саркоми, 0,9% меланоми). У порівнянні з аденокарциномами , карциноїди складають велику частку раку у молодших вікових групах. Випадки плоскоклітинного, перехідного ректального раку частіше трапляються у жінок. Виживання людей із карциноїдами і перехідним клітинним типу раку більше, ніж із аденокарциномами [18]. Серед немуцинозних карцином 4 % становлять випадки з MSI-H, 28 % з мутаціями KRAS, 8 % з BRAF, 88 % з APC, 41 % з TP53, 18 % з CK7, 78 % з CDX2, 51 % з MUC2, від 2 до 33 % з MUC5AC, 2% з ампліфікацією HER2 [41].

Персневидно-клітинні карциноми характеризуються наявністю більше 50 % клітин із інтрацитоплазматичним муцином, який витісняє плеоморфне ядро на периферію [20]. Цей тип становить менше 1 % усіх випадків карциноми прямого кишечника і частіше зустрічається у осіб молодше 50 років та пацієнтів з виразковим колітом [19]. Персневидні клітини можуть виникати у пулах муцину залозистих аденокарцином, або у результаті дифузно-інфільтраційного процесу з мінімумом екстраклітинного муцину (скір). Деякі карциноми з MSI відносяться до цього гістологічного типу і становлять біля 19 % від загальної кількості [20]. У близько 30 % цих пухлин спосерігаються дефекти MMR функції, відзначені мутації TP53 у 40 %, KRAS (у 12 та 13 кодонах гена) у 13%, порівняно з 48% у інших типів. Характерні також позитивні результати на цитокератин 7 та 20 (СК7 та СК20) [44].

Малоклітинна карцинома гістологічно ідентична раку легенів. Зазвичай вона розвивається з аденоми і експресує нейроендокринні маркери [19]. Спостерігаються кластери клітин малих та середніх розмірів з вираженим апопозом, жвавим мітозом та вогнищами некрозу. SmCC є рідкісною гупою пухлин з агресивним перебігом, розвиваються із нейроендокринної тканинита дають позитивний результат на LMWK, CK19,СК7, СК20, панцитокератин (AE1/AE3), EGFR, негативний на TTF-1 та CA125. CDX2, mCEA, CD56, синаптофізин, NSE та хромограрін можуть бути використані для відрізнення даного типу пухлин від неендокринних слабкодиференційованих карцином. Зазвичай притаманні віддалені метастази, лімфоваскулярні інвазії [43].

Плоскоклітинні карциноми у просвіті прямої кишки трапляються рідко, більшість із них розвивається у залозисто-плоскоклітинні [20]. Клітини мають форму схожу до епітеліальних. Середній вік розвитку захворювання становить 57 років, при чому 66% випадків спостерігалися у жінок і лише 34% у чоловіків. Середньорічний рівень виживання становить 30 % у порівнянні з 50 % залозистих типів карцином [45]. Поліморфізм промоторної ділянки гена MDM2 SNP309T (негативний регулятор онкосупресора Р53) спостерігається частіше у жінок та у пацієнтів із стабільністю мікросателітів. Метилювання VHL, RAR-?, RASSF1A, FHIT було виявлено у 36, 73, 73, і 50% відповідно [48].

Світлоклітинна карцинома характеризується наявністю шарів клітин із везикулярним ядром та вираженими ядерцями, світло-рожевою цитоплазмою [20]. Зазвичай уражає лімфатичні вузли. Шари клітин можуть мати органоїду чи трабекулярну архітектуру, часто присутні як залозитсі, так і муцинові компоненти [19]. Близько 72 % випадків становлять малодиференційовані карциноми, з яких 22 % - недиференційовані. Семртність за 5 років складає 40 %. Нейроендокринна диференціація спостерігаються у 32 % випадків. У білше 50 % зразків виявлені мутації P53 [46]. У 90 % спосетрігається MSI [20]. Виявлено 81% негативності по CDX2 маркеру, тоді як у недиференційованих карцинмах - 45%; 79% по MLH-1, у недиференційованих карциномах - 40%; по маркеру для кальретиніну у 27% та 88%; для MUC-1, MUC-2, TFF в 33%, 40%, 47% відповідно [47].

У недиференційованих карциномах зазвичай спостерігається MSI, MRR. Вони генетично гетерогенні із різним гістологічним майбутнім. Залозисті утвореня спостерігаються у менеше ніж 5 % випадків, можуть формуватися шари клітин, стрічки чи трабекулярні структури. Ступінь анаплазії варіює, у деяких пухлинах відзначена ядерна атипія та плеоморфізм, іншим характерні менш атипові цитологічні особливості. Цей тип поділяють на світлоклітинні карциноми, прості та трабекулярні [20].

Також виділяють веретеновидно-клітинні карциноми, або саркоматоїдні, які містять як ракові, так і гетерологічні мезенхімні елементи. Іншими рідкісними типами карциноми є: плеоморфна, хоріокацинома, пігментована, стовбурово-клітинна [20]. В останні роки описані нові підтипи карциноми, такі як мікропапілярна, ворсинчасті, зубчасті. Проте, їхні клініко-патологічні та молекулярні особливості ще чітко не визначені [19].

РОЗДІЛ 2 ГЕНИ РОДИНИ FOX

2.1 Згальна характеристика генів родини FOX

Родина транскипційних факторів Forkhead виникла в одноклітиннх еукаріот, розширилася за рахунок дуплікацій, делецій, деколи навіть втрати генів до близько 40 білків у ссавів [53]. Деколи можуть виконувати роль транскипційно інертних докінг факторів для інших протеїнів, у складі яких містяться домени, котрі регулюють транскрипцію [56]. Вперше дані TF виявлені у 1989 році, коли було знайдено та клоновано ген, який відповідає за відповідний фенотип у Drosophila melanogaster, проте не встановено ніякої схожості до відомих на той час білкових доменів. Невдовзі після цього було клоновано кДНК ядерного гепатоцитного фактора 3? (HNF3?) щурів, відомого як FOXA1. Сиквенс знову не показав ніякої схожості із відомими на той час ДНК-зв'язуючими білковими доменами, які були виявлені у ядерних рецепторів чи транскриійних факторів типу zinc finger. У 1990 році Weigle та Jackle помітили схожість між послідовністю центрльних 110 амінокислот FOX протеїнів D. melanogaster та ссавців, які формували ДНК-з'язуючий мотив [53].

Сімейство FOX об'єднує TF, що мають білок-зв'язуючий домен та ДНК-зв'язуючий домен у формі «крилата спіраль» (winged helix). Цей домен формується з 80-110 амінокислотних залишків, з яких більшість є спільними для всіх ТF цього сімейства. Залежно від варіантів амінокислот в домені виділяють декілька підродин. ДНК-зв'язуючий домен є одним із варіантів мотиву спіраль-поворот-спіраль (helix-turn-helix) і складається з трьох ? спіралей, 3 ?-шарів, двох характерних великих петель або «крил», які фланкують третій ?-шар. TF родини FOX також мають активаційний домен, що містить ділянки, куди приєднуються інші білки, такі як транскрипційні ко-регулятори. Для цього домену відсутня гомологія амінокислотної послідовності між членами родини. Більшість протеїнів цієї родини зв'язуються з ДНК у вигляді мономерів, контактуючи зі специфічними послідовностями третьою ?-спіраллю, фланкованою двома іншими та дома «крилами» [49, 53].

У 2000 році Fox nomenclature committee запропонував номенклатуру протеїнів родини FOX, основану на філогенетичному аналізі 173 білків. Їх розділили на 15 класів від A до О, врикористовуючи за базу будову ДНК-з'язуючого домену. З того часу описано ще класи із P по S. Таким чином, зараз відомо 19 класів FOX протеїнів [53]. Протягом останніх 20 років показано важливість білків цієї родини у розвитку захворювань людсього організму, зокрема для FOX1, FOXC2, FOXP2 і FOXP3. Докзано, що причиною домінантно успадовуваної глаукоми, включаючи гіпоплазію райдужної оболонки, синдрома Ріегера, є мутації у FOXC1 [53]. FOXC регулює експресію FOXO1A, зв'язуючись із консенсусою ділянкою в області промотора. У клітинах людського організму, що формують трабекули, спостерігається низький рівень експресії FOXO1A, зменшення експресії FOXC1 збільшує загибель клітин у відповідь на окислювальний стрес [54]. Мутаії FOXC2 спричиняють лімфедему кінцівок, яка спадкуєтьcя за аутосомно-домінантним типом, FOXP2 - дефекти мови. Ген FOXP3 є маркером CD25+CD4+ Т-регуляторних Т-клітин, мРНК FOXH1, FOXO1 експресуються при ембріональному розвитку людини. Мутації FOXE1, FOXE3, FOXL2, FOXN1пов'язують із вродженими вадами плоду; FOXA1, FOXA2 експресуються в ендодермальному зародковому листку, а у мишей із делеціями даних генів виявлені значні відхилення у морфогенезі [53]. Підродина FOXA білків характеризується здатністю «відкривати» ущільнені ділянки хроматину без участі SWI/SNF комплексу ремодуляції хроматину; регулюють розвиток багатьох органів та систем, в тому числі печінки, підшлункової, легенів, простати та нирок; полегшують зв'язування лігандів із ядерними гормональними рецепротами, включаючи глюкокортикоїдні та естогенні; мають важливу роль у регуляції метаболізму: активації експресії білків глюконеогенезу в печінці при голодуванні, імобілізація жирів у підшкірній клітковині та депо при надмірно калорійному харчуванні [56]. Мутації FOXE1 відмічені при синдромі Бемфорта-Лазарі, який характеризується гіротиреозом [55].

Білки генів підродини FOXO є кінцевими ефекторами репресії транскрипції опосередкованої інсуліном, або інсуліноподібним росовим фактором 1 (IGF1). Дія інсуліну спрямована на зниження рівня цукру в крові та забезпечення відкладання глікогену у м'язах та жировій тканині; він регулює рівень експресії сотень генів, які беруть участь в метеболізмі глюкози та ліпідів у печінці. FOXA і FOXO можуть зв'язуватись із негативно діючим IRS (insulin response sequence), який містить консенсус T(G/A)TTT(T/G)(G/T). Як білки FOXO, так і FOXA можуть зв'язуватись з цією послідовністю та опосередковувати транскирпційну активність численних IR генів за відсутності інсуліну. Вищесказані білки фосфорилюються протеїнкіназою В, яка активується при взаємодії інсуліну з рецептором на поверхні гпатоцитів, та втрачають здатність до зв'язування ДНК. Це призводить до виключення генів, що кодують білки, котрі беруть участь в глюокнеогенезі у печінці [53]. Було показано роль FOXO1 у захисті бета-клітин панкреатичної залози від глюкотоксичного та ліпотоксичного окиснювального стресу при гіперактивації марганцевої супероксиддисмутази та каталази; в інгібуванні клітинного циклу в бета-клітинах та ліпоцитах, що корелює з підвищенням рівня експресії [56].

Важливу роль відіграють гени родини FOX і при розитку ракових захворювань. Спостерігається ампліфікація та надмірна експресія FOXA1 при езофагальному раку та раку легень, FOXM1 є транскрипційно позитивно-регульованим SHH білком при панкреатичному та базально-клітинному раку. Комплекси протеїнів FОХO1 та PAX3 чи PAX7 знайдено у рабдоміосаркомах. Білки FOXO3 та FOXO4 утворюють комплекси з продуктами MLL гена при гемобластозах. Експресія FOXM1 підвищується в деятках видів ракових захворювань, оскільки в нормі він експресується при входженні клітини в мітотичний цикл та безпосередньо активує цикліни, циклін- залежні кінази та антиапоптичні гени.

Рівень експресії, генетичні та епігенетичні зміни як FOX генів, так і генів, для яких вони виступають в ролі TF, повинні бути дослідженими при виникненні різноманітних захворювань людсього організму, адже при їх дерегуляції спостерігаються вроджені вади, цукровий діабет, канцерогенез.

2.2 Характеристика генів підродини FOXP

Підродина FOXP включає 4 гени: FOXP1, FOXP2, FOXP3, FOXP4. Для TF підродини FOXP характерною є наявність окрім ДНК-зв'язуючого мотиву «крилата спіраль» ще двох ДНК-зв'язуючих ділянок: цинкового пальця (zinc finger) і лейцинового зіпера (leu zipper) [50]. Проте у структурі winged helix також простежуються особливості: перше крило вкорочене, друге утворює спіраль, а не петлю [56]. Крім того ТF цієї підродини містять ДНК-звязуючий forkhead домен на С-кінці, замість звичного для TF родини FOXN кінцевого розміщення. Протеїни FOXP1, FOXP2, FOXP4 мають високий ступінь гомології (однаковими є більше 60% амінокислотних послідовностей, а для ДНК-зв'язуючого домену консервативними є біля 80% амінокислот).У структурі FOXP1, FOXP2 містять поліглутамінові ділянки, які, можливо, беруть участь у білок-білкових взаємодіях. На відміну від інших ТF родини FOX, що зв'язуються з ДНК у мономерній формі, зв'язування FOXP1, FOXP2, FOXP4 з ДНК контролюється гомо-і гетеродимеризацією [50, 56].

Протеїни FОXP4, FOXP1 відіграють суттєву роль у морфогенезі серцевої тканини; FOXP3, як зазначалося вище, мають важливе значення у програмуванні регуляторних Т-клітин (мутації білка викликають Х-зчеплені імунодисрегуляцію, поліендокринопатію та ентеропатію). FOXP2 має важливе значення у розитку мови при еволюційному становленні людського організму, відповідаючи за розвиток віповідних областей головного мозку, відрізняється від такого у шимпанзе та горили всого на 2 амінокислоти, що створює потенційний сайт фосфорилювання протеїнкіназою В [53].

FOXP1 належить до підсімейства P сімейства FOX (forkhead box) транскрипційних факторів. TF цього сімейства відіграють важливу роль в регуляції клітинної і тканинної диференціації під час ембріогенезу та впродовж усього життя, що показано дослідженнями нокаутних за геном FOXP1 мишей; делеціїї цього гена призводять до загибелі ембріонів [49]. FOXP1 експресується в усіх тканинах як пренатальному віці, так і дорослих особин; регулює багато аспектів розвитку, зокрема серця (дозрівання та диференціація кардіоміоцитів), легенів, головного мозку, тимуса, м'язів стравоходу. У нокаутованих мишах спостерігається нерозділення аорти та легеневої артерії.У ембріональних стовбурових клітинах FOXP1 стимулює експресію генів транскрипційних факторів, необхідних для забезпечення плюрипотентності: OCT4, NANOG, NR5A2, та GDF3, одночасно пригнічуючи гени, необхідні для диференціації [57]. Білковий продукт переважно локалізований в ядрі, а локалізація в цитоплазмі характерна для пухлинних тканин [51]. Структура білка наведена на рисунку 2.1.

Рис. 1.1 Структура білка FOXP1 [52]

Експресія FOXP1 виявлена в усіх без винятку тканинах, проте різні тканини відрізняються рівнем експресії. Найвищий рівень експресії показують лімфоїдна тканина і тканини шлунково-кишкового тракту [51]. FOXP1 розташований у 3 хромосомі, в локусі 3p14.1. Втрата цієї ділянки показана для багатьох типів пухлин, що вказує на розташування тут генів-супресорів пухлинного росту. Ген містить 21 екзон. Розмір гену - 629,297 пар основ. При альтернативному сплайсингу утворюються різні його ізоформи [56]. FOXP1 разом з FOXP2є репресором для промоторів генів SV40, IL-2; є важливим медіатором в інтегрин-залежній регуляції диференціації моноцитів. Було також показано, що внаслідок андроген залежної активації, в тканинах простати він зв'язується і пригнічує експресію PSA; є також важливим регулятором диференціації B-лімфоцитів і внаслідок контролю експресії генів RAG1і RAG2 бере участь у рекомбінації імуноглобулінових генів. Високий рівень експресії виявлено у дифузних великих В-клітинних лімфомах [52].

FOXP1 описаний як кандидат в онкосупресори, так і в онкогени. Використовуючи тканині мікропанелі і імунногітохімічні методи, було досліджено зміну рівня експресії мРНК FOXP1 у клітинах раку різної локалізації у порівнянні з нормальними тканинами тих же пацієнтів [50, 56]. Зразки були взяті з нирок, молочної залози, простати, матки, яєчників, шийки матки, товстої кишки, легенів, шлунка, прямої кишки, тонкої кишки. Відмінності експресії мРНК FOXP1 між нормальними і пухлинними зразками були виявлені у 51% випадків. Найбільший рівень втрати експресії спостерігався в 73% випадках пухлин товстої кишки. Аналіз експресії в нормальних тканинах, взятих в онкологічно здорових осіб показав, що зниження експресії спостерігається і для нормальних тканин, що прилягають до пухлин. Для пухлин шлунка в 75% спостерігається гіперекспресія, що свідчить про те, що у цьому випадку FOXP1 виступає онкогеном [51].

молекулярний ген кишечник гістологічний

РОЗДІЛ 3 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

3.1 Матеріали дослідження

В роботі використовували наступні реактиви і матеріали: Sigma-Aldrich™ TRI reagent Kit; 0,8 % агарозний гель (агароза, 1?TAE буфер, 1% розчин бромистого етидіуму), 8% поліакриламідний гель (30% розчин акриламіду, 10% персульфата амонію, ТBЕ?10, ТЕМЕД) виробництва фірм „REANAL” та „Bio-Rad” (США); маркери GeneRule™ 1 kb DNA Ladder та 100 bp DNA; барвник DNA Loading Dye компанії „Fermentas” (Литва); реактиви вітчизняного виробництва якості ч. д. а. - етиловий спирт, ізопропанол, Tris-боратнийбуфер (TBE), Tris-ацетатний буфер (TAE); EZ DNA Methylation Kit компанії „ZYMO RESEAR CHCORP”, ДНК полімеразу DreamTaq фірми „Fermentas” (Литва).

При виконанні цієї роботи використано прилади і обладнання таких марок та виробників трансілюмінатор ChemiDoc™ XRS+ System with Image Lab Software компанії BioRad” (США), ампліфікатор M-111 „БИС”; прилади для вертикального та гризонтального електрофорезу „Bio-Rad” (США), центрифуга Centrifuge MiniSpin „Eppendorf” (Німеччина), термостат Bellco Glass Mini AutoBlotHybridization „Oven” (РФ), спектрофотометр NanoDrop 2000 „Thermo Scientific” (Литва), термостат TDB-120 фірми „Biosan” (Латвія), вортекс Movil-Vib фірми „Selecta” (Німеччина), ваги ВЛТК-500 ( Україна), автоматичні піпетки та дозатори „Labsystems” (Фінляндія), ”Gilson” (Франція), морозильники Мінськ 118, холодильники Мінськ 121 (Білорусія), Норд (Україна), скло Knittel-Glaeser (Німеччина).

3.2 Досліджувана група

Пухлинні та гомологічні нормальні зразки тканин хворих на рак прямої кишки були отримані хірургічним шляхом та надані Наіональним інститутом раку АМН України, відділом пухлин черевної порожнини та заочеревинного простору. Для всіх пацієнтів фіксувались такі клініко-патологічні параметри: стать, вік, стадія пухлини. Кожен зразок складався із трансформованої та нормальної тканини прямого кишечника. Інформація про матеріл наведено в таблиці 3.1.

В таблиці дано класифікацію пухлин за системою TNM.T - первинна пухлина: Т0 - дані про первинну пухлину відсутні;Tis - carcinoma in situ, обмежена слизовою оболонкою; Т1 - карцинома вражає підслизову оболонку, Т2 - проникає у м'язову оболонку; Т3 - пухлина вражає підсерозну оболонку, не поширюється на інші органи; Т4 - вражає прилеглі органи чи перфорує вісцеральну очревину. N - регіональні лімфатичні вузли: NX - лімфовузли не можуть бути оцінені на предмет метастатичного ураження, N0 - відсутні метастази у лімфовузли, N1 - від 1 до 3 метастазів у регіональні лімфовузли; N2 - метастази у 4 чи більшій кількості регіональних лімфовузлів. М - віддалені метастази: МХ - не можна оцінити наявніть віддалених метасмазів; М0 - відсутні віддалені метастази; М1 - віддалені метастази наявні [58].

Із усіх зразків було відібрано 22 пари, які гістологічно становили однорідну групу аденокарцином прямого кишечника.

Таблиця 3.1 Інформація про досліджувану групу пацієнів

3.3 Методи дослідження

3.3.1 Виділення ДНК

Одразу після резекції зразки тканин заморожувались в рідкому азоті, після транспортування зберігались при -80 оС. Виділення ДНК проводили за допомогою Sigma-Aldrich™ TRI reagent Kit. Зразки пухлин і умовно нормальних навколопухлинних тканин заморожували в рідкому азоті, потім зразок вагою 50-100 мг гомогенізували в фарфоровій ступці в постійній присутності рідкого азоту.

Отриманий матеріал поміщали в 1,5 мл пробірки типу епендорф і ресуспендували в 1 мл TRI reagent, інкубувал при кімнатній температурі 5 хвилин, щоб забезпечити повне руйнування нуклео-протеїнових комплексів. Після цього додавали 0,2 мл хлороформу, активно змішували, та інкубували при кімнатній температурі 2-15 хвилин. Потім центрифугували на 12 000 ? g 15 хвилин при 2-8 °C, при чому спостерігали розділення 3 фаз у пробірці: верхня безколірна - містить РНК, інтерфаза - містить ДНК, нижня червона органічна фаза - містить білки та ліпіди. Верхню фазу потрібно видалити. Далі відбирали інтерфазу, переміщували у нову пробірку, додавали 0,3 мл 100 % етанолу, змішували переворотами та інкубували 2-3 хвилини при кімнатній температурі, центрифугували на 2 000 ? g 5 хвилин при 2-8 °C.

Видаляли супернатант та відмивали 2 рази 1 мл 0,1 М тринатрійцитрату (10 % розчин етанолу), кожного разу інкубуючи не менше 30 хвилин при кімнатній температурі; центрфугували на 2 000 ? g 5 хвилин при 2-8 °C, ресуспендували осад ДНК в 1,5-2 мл 75 % етанолу, інкубували 10-20 хвилин при кімнатній температурі. Висушували осад ДНК 5-10 хвилин та розчиняли у 0,3-0,6 мл 8 мМ NaOH, що збезпечує повне розчинення ДНК гранул. Центрифугувати на 12 000 ? g 10 хвилин щоб видалити будь-який нерозчинний матеріал та переносили супернатант у нову пробірку.

Оцінка якості та концентрації виділеної ДНК проводилась на спектрофотометрі Thermo Scientific NanoDrop 2000. Оцінку чистоти ДНК у зразках проводили за співвідношенням оптичних щільностей при довжинах хвиль А260 та А280.

Оцінку якості ДНК проводили з допомогою 0,8 % агарозного гелю. Приготування агарозного гелю: в мірну колбу вносили 0,8 г агарози і доводили обє'м 1?TAE буфером до 100 мл. Розчин нагрівали до повного розчинення агарози і додавали 5 мкл 1% розчину бромистого етидіуму. Суміш заливали у камеру з гребінкою. Коли гель застиг, гребінку виймали, а пластину гелю поміщали в камеру для електорфорезу і заливали 1x TAE буфером. Проби геномної ДНК готували наступним чином: брали необхідний обсяг ДНК і додавали до нього 1 мкл буферу для нанесення. В лунки вносили по 6 мкл проб. Входження проб проводилось при 3,63 В/см протягом 10 хв, прогонка гелю при 5,45 В/см протягом 40 хв. Після закінчення електорофорезу гель аналізували на трансілюмінаторі.

3.3.2 Метил-специфічна ПЛР гена FOXP1

Для перевірки рівня експресії гена FOXP в клітинах зразків аденокарциноми прямого кишечника людини було використано метод метил-специфічної ПЛР. Метод плягає у попередній хімічній денатурації ДНК та перетворенні неметильованих С в U; підбору праймерів, комплетентарних до нездатних до перетворення 5-метил цитозинових азотистих основ (метильованих CpG регіонів промоторних ділянок генів, що корелює із зменшенням їхньої експресії), проведення ПЛР. При чому не відбувається ампліфікація зразків, де цільова ділянка була неметильована.

Попередня бісульфітна обробка зразків ДНК була виконана за допомогою EZ DNA Methylation Kit. Попередньо були приготовені CT Conversion Reagent (додавали 750 мкл води, 210 мкл М-Dilution buffer до спеціально розробленого CT Conversion Reagent) та M-Wash Buffer ( додавали 24 мл 100% етанолу до 6 мл. концентрованого M-Wash Buffer).

Для ДНК 200-500 нг: до виділеної ДНК додавали 5 мкл M-Dilution Вuffer та доводили об'єм до 50 мкл водою; змішували піпетуванням, інкубували при температурі 37 °C 15 хв, до кожного зразка додавали 100 мкл CT Conversion Reagent, інкубували зразки при 50 °C 12-16 годин, після чого інкубували при температурі 0-4 °C 10 хв. Потім додавали 400 мкл M-Binding Buffer в колонки та поміщали її в мікропробірку.Після цього поміщали зразки, що інкубувалися, на колонки, де містився M-BindingBuffer, щільно закривали та перемішували кількаразовим обертанням. Потім центрифугували на швидкості 10 000 ? g 30 с, очищали мікропробірки, додавали 100 мкл M-Wash buffer на колонку, центифугували на максимальній швидкості 30 с, додавали 200 мкл M-Desulphonation Buffer та інкубували при кімнатінй температрурі 15-20 хв, центифугували на повній швидкості 30 с. Після цього додавали 200 мкл M-WashBufferу колонки, центифугували на повній швидксті 30 с, додавали ще 200 мкл M-WashBuffer та центифугували наступні 30 с, поміщали колонки у 1,5 мл мікроцентифужні пробірки, додавали 10 мкл M-Elution Buffer безпосередньо на колонки, центрифугували на повній швидкості 30 с для елюювання ДНК, після чого вона готова для ПЛР.