Выделение секреторных гранул из лимфоцитов
Основные типы лимфоцитов по функциональным и морфологическим признакам как клеток иммунной системы и ее ключевого звена. Дезоксирибонуклеазы секреторных гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА. Методы выделения и изучения лимфоцитов.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 07.12.2013 |
| Размер файла | 480,8 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования
"КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"
ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ
КАФЕДРА БИОХИМИИ
Специальность: 020208 - Биохимия
Специализация: 012307 - Молекулярная биология
КУРСОВАЯ РАБОТА
ВЫДЕЛЕНИЕ СЕКРЕТОРНЫХ ГРАНУЛ ИЗ ЛИМФОЦИТОВ
Студент III курса Группа 100
А.Е. Яхин
Научный руководитель д. б. н., профессор кафедры биохимии
З.И. Абрамова
Казань-2013
Содержание
- Введение
- Глава I. Обзор литературы
- 1.1 Лимфоциты
- 1.2 Дезоксирибонуклеазы секреторных гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА
- 1.3 Методы выделения и изучения лимфоцитов
- 1.4 Заключение по обзору литературы
- 1.5 Цели и задачи
- Глава II. Материалы и методы
- Глава III. Результаты и их обсуждение
- Выводы
- Список литературы
Введение
Недавние сообщения [1,2] подчеркивают роль апоптоза, аутоиммунитета и Т-лимфоцитов, как потенциально важных факторов в патогенезе хронических обструктивных заболеваниях легких и, в частности, Т-опосредованного иммунного ответа при астме.
Лимфоциты являются ключевым звеном иммунной системы и участвуют почти во всех иммунных и аутоиммунных реакциях, очень важна их роль при аллергических реакциях [3]. Обычно при изучении и оценке иммунного состояния организма, а также исследовании молекулярных механизмов, по которым протекают многие заболевания, главным объектом изучения являются лимфоциты.
Поэтому очень важным этапом в проведении таких исследований является получение чистых и жизнеспособных популяций лимфоцитов.
Глава I. Обзор литературы
1.1 Лимфоциты
Лимфоциты - клетки иммунной системы, представляющие собой разновидность лейкоцитов группы агранулоцитов, белых кровяных клеток. Лимфоциты - главные клетки иммунной системы, обеспечивают гуморальный иммунитет (выработка антител), клеточный иммунитет (контактное взаимодействие с клетками-жертвами), а также регулируют деятельность клеток других типов. В крови взрослого человека в норме содержится 20-35 % лимфоцитов (1000-3000 кл/мкл). В то же время кровь содержит только около 2 % лимфоцитов, находящихся в организме, остальные 98% находятся в тканях. Лимфоциты обладают уникальным свойством - способностью распознавать антигены. Лимфоциты образуются в лимфатических узлах, миндалинах, червеобразном отростке, селезенке, вилочковой железе (тимусе) и костном мозге. Большинство покоящихся лимфоцитов представляют собой малые лимфоциты - небольшие клетки с темным ядром, что обусловлено конденсацией хроматина и сравнительно небольшим количеством цитоплазмы, содержащей разрозненные митохондрии. По морфологическим признакам выделяют два типов лимфоцитов: большие гранулярные лимфоциты (чаще всего ими являются NK-клетки или, значительно реже, это активно делящиеся клетки лимфоидного ряда - лимфобласты и иммунобласты) и малые лимфоциты (T и B клетки) [4].
По функциональным признакам различают три типа лимфоцитов: B-клетки, T-клетки, NK-клетки.
· В-лимфоциты распознают чужеродные структуры (антигены) вырабатывая при этом специфические антитела (белковые молекулы, направленные против чужеродных структур).
секреторная гранула лимфоцит иммунная
· Т-лимфоциты выполняют функцию регуляции иммунитета. Т-помощники стимулируют выработку антител, а Т-супрессоры тормозят ее.
· NK-лимфоциты осуществляют контроль над качеством клеток организма. При этом NK-лимфоциты способны разрушать клетки, которые по своим свойствам отличаются от нормальных клеток, например, раковые клетки. Содержание Т-лимфоцитов в крови составляет 65-80 % от общего количества лимфоцитов, В-лимфоцитов - 8-20 %, NK-лимфоцитов - 5-20 %. В образовании антител центральная роль принадлежит B-лимфоцитам. При этом B-лимфоциты обеспечивают специфический приобретенный иммунитет совместно с другими малыми лимфоцитами - T-лимфоцитами, используя разнообразные механизмы, направленные в большинстве случаев на расширение пределов эффективности врожденного иммунитета.
Лимфоциты класса T образуются в зобной железе, или тимусе, откуда они и получили свое обозначение - "T": предшественники T-лимфоцитов поступают в тимус, где и происходит их созревание. T-лимфоциты подразделяются на ряд подклассов. Главные из них это две различные, неперекрывающиеся субпопуляции: клетки одной из них несут маркер CD4 и в основном "помогают" в осуществлении иммунного ответа или индуцируют его (T-хелперы), клетки другой несут маркер CD8 и обладают преимущественно цитотоксической активностью (цитотоксические T-лимфоциты (T-киллеры).
1.2 Дезоксирибонуклеазы секреторных гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА
Изучение нуклеазного состава гранул лимфоцитов связано с ролью этих нуклеаз в развитии заболеваний, характеризующихся нарушениями в иммунном ответе. Иммунная система атакует аутологические ткани, приводя к глубоким изменениям. В этом случае ткани инфильтрируются Т-лимфоцитами, некоторых из них с цитотоксической активностью (цитотоксические Т-лимфоциты; ЦТЛ), что приводит к Т-опосредованному аутоиммунному заболеванию.
Лимфоцит-опосредованный цитолиз связывают с работой специфической нуклеазной активностью цитотоксических клеток [7]. Это кислая ДНКаза с молекулярной массой 66 кДа активируется ионами Ca2+ и ингибируется Zn2+, специфична к ДНК. У больных рассеянным склерозом данная нуклеазная активность повышается и становится чувствительной к оксиду азота, но теряет чувствительность ионам цинка.
Некоторые моменты при развитии астмы и орган-специфических аутоиммунных заболеваний (например, инфильтрация лимфоцитов в очаге заболевания) подвели нас к поиску и изучению нуклеазной активности секреторных гранул лимфоцитов крови пациентов с АБА.
1.3 Методы выделения и изучения лимфоцитов
Градиенты плотности для выделения лимфоцитов из цельной периферической крови человека.
Фиколл 400 представляет собой гидрофильный полимер сахарозы, имеющий высокий молекулярный вес. Молекулярный вес Фиколла составляет 400000. Осмотическое давление его растворов ниже, чем растворов сахарозы эквивалентной концентрации, что позволяет использовать изотонические градиенты плотности и сохранять физиологические и морфологические свойства клеток и органелл в процессе центрифугирования. Фиколл 400 широко применяется в каждодневной работе с разделением клеток крови и для разделения клеток и органелл путем осаждения под действием силы тяжести. [5]
Фиколл-пак представляет собой готовый к употреблению стерильный раствор плотностью 1,077 г/мл, используемый для выделения лимфоцитов периферической крови человека путем простой и быстрой процедуры Фиколл-Пак представляет собой смесь Фиколла 400 (5.7 % вес/объем) и диатризоата натрия (9,0 % вес/объем). Фиколл-Пак используется для выделения лимфоцитов при определении тканевой совместимости и цитотоксичности. Процедура выделении позволяет получать высокий выход жизнеспособных лимфоцитов без нарушения соотношения между Т - и В-клетками.
Перколл - уникальная среда для центрифугирования в градиенте плотности, специально предназначенная для поддержания физиологических условий в процессе центрифугирования. Среда представляет собой стерильный коллоидный раствор частиц двуокиси кремния, покрытых поливинилпирролидоном (ПВП). Перколл нетоксичен для клеток и может образовывать градиенты с плотностью в диапазоне до 1,3 мг/мл. Градиенты можно преформировать, либо они формируются спонтанно при центрифугировании. Перколл имеет низкую осмоляльность (20 мосм/кг H2O), благодаря чему на протяжении градиента фактически поддерживаются физиологические условия. Вследствие большого размера частиц центрифугирование раствора перколла при умеренных скоростях приводит к формированию градиента плотности. Поэтому разделение обычно происходит очень быстро. Среда, используемая для центрифугирования, может быть изотоничной по всему объему благодаря включению в нее солей или сахарозы. Не составляет труда создать пологий градиент, что позволяет проводить весьма эффективное разделение мембранных фракций по их плавучей плотности.
Свойства перколла:
1. Диапазон плотностей пригоден для равновесного центрифугирования клеток, вирусов и субклеточных частиц с константой десиментации > 70S.
2. Устанавливается на физиологическую ионную силу и pH.
3. Низкая вязкость.
4. Не проникает сквозь биологические мембраны.
5. Может быть стерилизован многократно.
6. Совместим с биологическими материалами.
7. Легко отделить от очищенного материала.
8. Нет существенного эффекта гашения при регистрации радиоактивности. [5]
Ультрацентрифуга
Ультрацентрифуги - наиболее узкоспециализированный тип приборов, служащий главным образом для исследовательских задач, седиментации вирусов, выделении субклеточных структур, белков и других высокомолекулярных соединений, нуклеиновых кислот и, в целом, разделения частиц размером 100 нм и менее. Принцип работы ультрацентрифуги аналогичен остальным лабораторным центрифугам, но по своим техническим параметрам они значительно превосходят все лабораторные модели. Они способны достигать скорости 150 000 об/мин и ускорения свыше 1 000 000g. Кроме угловых и бакетных роторов, центрифуги могут оснащаться проточными или зональными роторами с одной большой внутренней полостью для разделяемой жидкости. По исполнению ультрацентрифуги могут быть как настольными, так и напольными. Производятся приборы данного класса компаниями Beckman Coulter и Thermo Scientific.
Мы использовали ультрацентрифугу компании Beckman Coulter OptimaTM L-series.
Напольные ультрацентрифуги серии Optima L способны работать на скорости 100 000 об/мин (L-100K) с ускорением до 694000Чg/802000Чg (табл.1). Центрифуги комплектуются огромным рядом угловых и горизонтальных роторов, снабжены надёжным вакуумированным индукционным приводом, системой управления и контроля на базе микропроцессора и безопасной для окружающей среды системой охлаждения, в которой не используются фторированные углеводороды или другие жидкие хладагенты, встроенной системой коррекции дисбаланса ротора до 10%. Серия Optima L в полной мере соответствует установленным требованиям при работы с биологически опасными материалами, имеются соответствующие сертификаты на биобезопасность на нескольких уровнях. Центрифуги подключаются к сети 220В, что позволяет размещать их в любом удобном месте. [6]
Таблица 1. Технические характеристики ультрацентрифуг серии Optima L
|
Диапазон скоростей |
Optima L-90K: 1 000 - 90 000 об/мин, с шагом 100 об/мин Optima L-100K: 1 000 - 100 000 об/мин, с шагом 100 об/мин |
|
|
Контроль скорости |
± 20 об/мин |
|
|
Максимальное ускорение |
Optima L-90K: 694000Чg Optima L-100K: 802 000 Ч g |
|
|
Вместимость |
1 500 мл |
|
|
Объём образца в одной ячейке |
от 230 мкл до 250 мл |
|
|
Режимы работы |
По таймеру до 99 часов 59 минут в режим HOLD w2t |
|
|
Установка температуры |
0°. +40°C, с шагом 0.1°С |
|
|
Контроль температуры |
± 0,5°C от установленного значения |
|
|
Контроль дисбаланса |
±5 мл или 10% при объёме менее 5 мл |
|
|
Температура окружающей среды |
+15°. +40°C |
|
|
Система охлаждения |
Используется экологически безопасный хладогент |
|
|
Профили ускорения |
- быстрый: от 0 об/мин до заданной скорости; медленный: от 0 до 500 об/мин, далее быстрый разгон до установленной скорости |
|
|
Профили торможения |
- динамическое торможение; медленное (до 500 об/мин быстрое торможение, далее медленная остановка; без торможения |
|
|
Программы |
9 программ, устанавливаемых пользователем, возможность отложенного старта |
|
|
Система уменьшения трения |
да |
|
|
Тепловыделение |
1 кВт |
|
|
Уровень шума |
менее 57 дБ |
|
|
Внешние габариты |
В: 1207 Ч Г: 673 Ч Ш: 940 мм |
|
|
Вес |
465 кг |
|
|
Требования к электросети |
220-240 В,20 А, 50 Гц (однофазный ток) |
Зонально-скоростное центрифугирование
От технически грамотного осуществления процесса ультрацентрифугирования зависит успех эксперимента, а также сохранность и срок службы дорогостоящей машины. Поэтому давайте разберемся, что представляет собой метод ультраценрифугирования.
Особенности этого типа центрифугировнаия отражены в названии: "скоростное", потому что частицы разделяются по скорости оседания, причем плотность их значительно больше, чем плотность среды, и "зональное" так как частицы разных размеров оседают более или менее ограниченными слоями - зонами. Частицы разных размеров очищаются не раздельно, а одновременно, при одном центрифугировании.
Исходную смесь частиц наносят в виде тонкого слоя на более плотную среду, заполняющую весь объем пробирки бакет-ротора. В ходе центрфугирования наиболее тяжелые частицы быстро продвигаются ко дну пробирки. За ними с отставанием, но тоже в виде отдельного слоя, двигаются менее крупные частицы, затем еще более мелкие и т.д. Таким образом, образуются дискретные зоны, или полосы частиц, отличающихся друг от друга скоростью оседания. [7]
Равновесное центрифугирование
Идея метода состоит в создании такого градиента по длине пробирки (в бакет-роторе), чтобы плотность среды центрифугирования у дна была больше, чем у наиболее плотных частиц, а у мениска - меньше, чем у наименее плотных. При достаточно длительном центрифугировании частицы будут перемещаться вдоль градиента до тех пор, пока не достигнут положения, в котором плотность среды равна их плавучей плотности. Движение прекращается, частицы различной плотности располагаются в разных участках градиента. Таким образом, осуществляется фракционирование частиц по их плотности.
Такое разделение имеет следующие особенности:
1. Размеры частиц и их массы не будут сказываться на окончательном распределении. Положение на градиенте будет определяться только плотностью частиц.
2. Движение частиц к положению равновесия будет происходить как из области более низкой плотности градиента, чем их плавучая плотность, так и из области более высокой плотности. Таким образом наряду с седиментацией будет происходить и флотация. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий начальный слой препарата на жидкость, заполняющую пробирку. Можно даже весь препарат смешать с полным объемом градиентной среды.
3. Процесс центрифугирования должен быть весьма длительным, так как при подходе к положению равновесия частицы будут двигаться очень медленно.
4. Вязкость среды в связи с этим является нежелательным фактором.
5. При равновесном ультрацентрифугировании возможна заметно большая загрузка препаратом, чем при зонально-скоростном центрифугировании.
6. В области равновесия частицы расположатся в виде полосы, ширина которой определится соотношением двух процессов:
концентрирования за счет седиментации - флотации и тепловой диффузии частиц. Эта ширина будет тем меньше, чем круче градиент плотности среды и чем больше масса частиц - увеличение массы уменьшает склонность к диффузии. [7]
Электрофорез
Электрофорез (от электро - и греч. рhoresis - несение, перенесение) - метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к передвижению во внешнем электрическом поле. Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, основными из которых являются: напряженность электрического поля, величина электрического заряда, скорость и размер частицы, вязкость, рН и температура среды, а также продолжительность электрофореза [8].
Физический принцип метода заключается в следующем: биологические макромолекулы несут определённый электрический заряд благодаря наличию групп, способных к электролитической диссоциации и концентрации протонов в среде (рН). Под действием электрического поля, в зависимости от знака суммарного заряда положительно заряженные макромолекулы перемещаются к катоду (отрицательно заряженному электроду), а отрицательно заряженные - к аноду (положительному электроду), причём трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. Такое явление носит название электрофореза. Электрическое поле создают в токопроводящих растворах с помощью электродов. [2]
Факторами, обусловливающими подвижность биополимеров в геле, являются: суммарный заряд, масса, форма, линейные размеры макромолекулы и пор геля.
Основой электрофоретического разделения является разная скорость движения заряженных молекул в электрическом поле. Подвижность возрастает с увеличением суммарного заряда. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине дорожки.
С другой стороны, разделяемые молекулы движутся в геле. Природа любого геля - ситоподобная структура, в которой молекулы воды удерживаются внутри трехмерной сетки, образованной длинными полимерными молекулами. Используемые гели содержат много жидкости (80-99.5%), в которой (т.е. в рабочем буфере) мигрируют макромолекулы. Фракционируемые макромолекулы любых размеров сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду и снижает скорость движения молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к месту нанесения, чем меньшие (в агарозном, крахмальном и полиакри-ламидном гелях).
Электрофорез ДНК. В основе разделения нуклеиновых кислот электрофорезом в агарозном геле лежит принцип молекулярного сита, так как нуклеиновые кислоты имеют отрицательный суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией остатков фосфорной кислоты. Величина заряда мало зависит от рН окружающей среды и для всех нуклеиновых кислот отношение заряда к массе практически одинаково, поэтому фракционирование их при электрофорезе идёт за счёт различия размеров и формы молекул. Скорость миграции и эффективность разделения различных образцов нуклеиновых кислот в агарозном геле определяется размером молекул и их конформацией, концентрацией агарозы, напряжённостью электрического поля [8].
ДНК: молекулярная масса измеряется в парах азотистых оснований (base-pairs, англ.), сокращенно - bp, соответственно - килоbp (1000 bр) или кbр.
Молекулы одинакового размера, но различной формы, например фибриллярные и глобулярные белки, обладают разной подвижностью из-за различий в силе трения и электростатического взаимодействия с окружающей средой.
Буфер создает и стабилизирует рН носителя и, тем самым, влияет на скорость миграции разделяемых веществ. С ростом рН ионизация органических кислот возрастает, а оснований, наоборот, уменьшается, и, следовательно, меняется их электрофоретическая подвижность. Оптимальное значение рН рабочего буфера обусловливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков исходной смеси.
Рабочие значения напряжения и тока подбирают не только с учетом обеспечения теплоотвода, как для белков, но и с таким расчетом, чтобы напряженность электрического поля в геле не превышала 5 В/см геля. При больших значениях напряженности поля крупные молекулы нуклеиновых кислот могут, деформируясь, "протискиваться" через поры геля независимо от своей массы. Видно, что проведение электрофореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля и область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается.
Особенности электрофореза белков. Белки - это цвиттер-ионы, т.е. молекулы, имеющие и положительно (+) заряженные и отрицательно (-) заряженные радикалы. Поэтому молекула белка в растворе при любом рН, отличным от изоэлектрической точки, имеет определенный преобладающий заряд (+) или (-) и мигрирует к соответствующему полюсу в постоянном электрическом поле. Позднее был разработан метод ступенчатого электрофореза (диск - электрофорез (от англ. "discontinuous" - прерывистый). Отличительная особенность диск-электрофореза - это полимеризация на пластине двух гелей: рабочего (мелкопористого) и над ним - "формирующего" (крупнопористого) геля. Диск-электрофорез - метод, сочетающий в себе разделение белков по их общему электрическому заряду, по величине молекулярной массы и по форме. Использование двухслойного носителя с различным размером пор и двух буферов, отличающихся между собой по составу и рН, обеспечивает концентрирование исследуемых белков в узкой стартовой зоне. Это важно для чёткого разделения смеси белков.
Раствор, в котором мигрируют белки, удерживается сеткой полиакриламидного геля (ПААГ). ПААГ служит при электрофорезе поддерживающей средой и принимает активное участие в процессе разделения макромолекул благодаря эффекту молекулярного сита.
В качестве носителя при диск-электрофорезе используют ПААГ, который имеет структуру трехмерной сетки. Получают его сополимеризацией акриламида и сшивающего агента N,N метиленбисакриламида. Подбирая соответствующую концентрацию акриламида получают гель с нужным размером пор. При работе с глобулярными белками пользуются соотношением между средней молекулярной массой белков (М) и концентрацией (С) акриламида, которую надо взять для полимеризации, например (см. табл.2):
Таблица 2. Выбор концентрации акриламида в зависимости от мол. массы белка
|
М |
С, % |
|
|
10000 - 30000 |
15,0 - 30,0 |
|
|
30000 - 100000 |
7,5 - 15,0 |
В качестве катализаторов при получении ПААГ - геля используют персульфат аммония и N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). Варьируя концентрацией полимера можно получить гели с широким диапазоном пор.
Для удобства изложения используются следующие обозначения: Т - процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему их раствора, С - процентное отношение массы метиленбисакриламида (Бис) к общей массе обоих мономеров.
На практике для исследования белков часто Т составляет 30 %, а С-2,6 %. Чтобы приготовить растворы используют следующий расчет:
Количество Бис > Т С / 100 = 302,6/100=0,76г.
Количество акриламида > 30 г - 0,76 г =29,24 г.
Навески акриламида и бис-акриламида растворяют в 100 мл дН2О.
Характеристика миграции белков. Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле (Rf?) пропорциональна их подвижности в свободной жидкости (RfO), которая определяется отношением суммарного заряда макромолекулы к её массе. Фактором, обуславливающим отличие Rf? от RfO, является сила трения о гель. Сила трения зависит от соотношения линейных размеров белков и пор геля, и, следовательно, от молекулярных масс белков. Молекулярные массы большинства белков не превышают 500000, поэтому использование гелей агарозы не целесообразно. Как правило, электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем от 5% до 20 % акриламида.
Как говорилось выше, белки являются цвиттер-ионами. Их суммарным зарядом, а, следовательно, и отношением заряда к массе можно управлять изменением рН буфера, в котором полимеризуется ПААГ и ведется электрофорез. Оптимальное значение рН рабочего буфера обуславливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков, составляющих смесь. Таким образом, рН рабочего буфера не должно слишком отличаться от изоэлектрических точек всех белков смеси (при изоэлектрической точке все белки имеют нейтральный заряд). Для кислых белков оптимальные значения рН - нейтральное или слабощелочное. Белки мигрируют от катода (-) к аноду (+). Для щелочных белков (гистонов, белков рибосом и т.д.) целесообразно использовать слабокислые буферы (рН = 4 - 5). Эти белки различаются по величине суммарного положительного заряда и мигрируют в направлении от анода (+) к катоду (-). Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда.
Для однозначного определения молекулярной массы белка по скорости его миграции при электрофорезе полипептидную цепочку распрямляют (рис.1). Такой приём используется при электрофорезе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (ДСН - C12H25OSO3Na).
Рис. 1. Схема денатурации белка
Разделение белков по размеру с использованием додецилсульфата натрия (ДСН). Суть метода. Электрофорез в ПААГ-ДСН позволяет фракционировать белки только по молекулярной массе. Для этого белки обрабатывают трёхкратным избытком ДСН-Na (1,4 мг ДСН-Na на 1 мг белка). Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Постоянство соотношения детергент/белок делает постоянным отношение () заряда к массе любого белка. Благодаря электрическому отталкиванию остатков серной кислоты на поверхности белка полипептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жёсткого эллипсоида вращения (рис.2).
Рис. 2. Схематичное изображение полипептидной цепочки после добавления ДСН
Размер малой оси эллипсоида равен 1,6 нм, большой - линейно связан с числом аминокислотных остатков, т.е. с молекулярной массой.
Электрофоретическая подвижность (Rf?) связана с молекулярной массой белка (М) соотношением: Rf? = A - B lg M, где А и В - коэффициенты пористости геля и др. условий.
Величину электрофоретической подвижности (Rf) определяют в относительных единицах, выражающих отношение пути миграции белка к миграции бромфенолового синего за время электрофореза.
Одновременно проводят электрофорез белков-"маркёров", молекулярные массы которых известны. [9]
1.4 Заключение по обзору литературы
Итак, многолетние исследования показывают, что ДНКазы представляют собой лабильную систему, чутко реагирующую на различные прямые и опосредованные воздействия.
ДНКазы важны не только в процессах нуклеинового обмена, но и для поддержания физиологической концентрации ДНК в организме человека. Например, повышение концентрации ДНК в крови может привести к накоплению ДНК-белковых комплексов, индукции наработки анти-ДНК антител и развитию различного рода патологий. Развитие аутоиммунных заболеваний также связывают с изменением активности нуклеаз иммунокомпетентных клеток.
Идентификация новых нуклеаз, в том числе апоптотических, должна проложить путь для дальнейших исследований по раскрытию новых функций нуклеаз и осветить скрытые связи между апоптотической деградацией ДНК и заболеваниями человека. [10]
Таким образом, объяснимо наше внимание к изучению свойств нуклеаз лимфоцитов, выделенных из периферической крови больных бронхиальной астмой.
1.5 Цели и задачи
В связи с изучением литературы по данному вопросу целью работы явилось освоение метода выделения секреторных гранул Т-лимфоцитов и характеристика их белкового состава методом электрофореза.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Освоить метод ультрацентрифугирования и работу на ультрацентрифуге Beckman Coulter OptimaTM L-series.
2. Выделить фракцию Т-лимфоцитов низкоскоростным центрифугированием в градиенте плотности фиколла.
3. Выделить секреторные гранулы Т-лимфоцитов методом ультрацентрифугирования.
4. Определить в секреторных гранулах наличие белковых фракций методом электрофореза.
Глава II. Материалы и методы
Объект исследования. Объектом изучения служили лимфоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров. Забор крови (5 мл) осуществлялся путем венопункции кубитальной вены. Кровь забирали в пробирки, содержащие антикоагулянт Na2-гепарин. Забор крови проводился в поликлинике инфекционно-аллергических заболеваний, Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии.
Выделение Т-лимфоцитов. Собранные образцы крови разводили физиологическим раствором: 2 мл ФСБ + 3 мл крови. Осторожно перемешивали и медленно наслаивали разведенную кровь на 5 мл градиента плотности фиколла-400 (=1.077 г/см). Центрифугировали в течение 40 минут при 3000 об/мин при комнатной температуре (Eppendorf 5810 R). При разделении лимфоциты образуют плавающее кольцо на поверхности фиколла. Дозатором отбирали кольцо лимфоцитов и переносили в чистые пробирки. Лимфоциты отмывали 5 мл физиологического раствора: центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин (Eppendorf 5810R). Супернатант сливали, осадок суспенизировали раствором фосфатно-солевого буфера (5 мл) и центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин (Eppendorf 5810 R).
Получение экстракта гранул из цитоплазмы лимфоцитов. лимфоциты промывали в 1 мл 0.32 М сахарозы в 0,01 М трис-буфере, рН 7,3 и 1 мл 0.003 М CaCl2 в 0.01 М трис-буфере, рН 7,3. Центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге К-24. К полученному осадку добавляли 1 мл 0.01 М трис-буфера рН 7,3 и разрушали клетки в стеклянном гомогенизаторе Поттера 2 мин (в "ледяной бане”), добавляли 3 мл 0.01 М трис-буфера и оставляли на 30 мин в "ледяной бане”. Центрифугировали в течение 15 мин при 2300 об/мин, 4С (Eppendorf 5810R), отбирали супернантант. Осадок промывали в 1 мл 0.01 М трис-буфере и центрифугировали в течение 15 мин при 2300 об/мин (Eppendorf 5810R). Собирали супернатант. Процедуру повторяли еще один раз. супернатанты объединяли, таким образом, был получен "постядерный" супернатант. Готовили раствор фиколла (=1.080 г/см). Полученный раствор центрифугировали при 19500 об/мин в течение 10 мин на центрифуге Beckman (с ротором SW55). Поверх полученного градиента перколла наслаивали 2.5 мл "постядерного” супернатанта и центрифугировали при 19500 об/мин в течение 35 мин. Для удаления фиколла, центрифугировали при 45000 об/мин в течение 2,5 часов при 4С, при этом образовывался плотный осадок фиколла.
Надосадочную жидкость, в которой содержатся секреторные гранулы, отбирали для дальнейшей работы.
Электрофорез. Диск-электрофорез проводили в денатурирующих условиях (с ДСН) в 8% разделяющем геле.
Сначала собирали камеру для электрофореза (BioRad). Затем готовили 8% разделяющий гель по схеме:
|
Запасной раствор акриламида |
5,5 мл, |
|
|
дН2О |
9,5 мл |
|
|
Буфер для разделяющего геля (с 0,4% ДСН) |
5,0 мл |
|
|
ТЕМЕД |
100 мкл |
|
|
10% ПСА |
100 мкл |
Разделяющий гель заливали между стеклами камеры, не доводя до верха 2 см, и оставляли полимеризоваться 40 мин.
Готовили 4,5% концентрирующий гель по схеме:
|
Запасной раствор акриламида |
1,0 мл, |
|
|
дН2О |
2,75 мл |
|
|
Буфер для концентрирующего геля (с 0,4% ДСН) |
1,25 мл |
|
|
ТЕМЕД |
50 мкл, |
|
|
10% ПСА |
50 мкл |
Наносили концентрирующий гель поверх застывшего разделяющего геля и вставили гребёнку. Оставили полимеризоваться 20 мин.
После полимеризации устанавливали стеклянную камеру в аппарат для электрофореза, заливали камеру электродным буфером, убирали гребенку.
Образцы готовили по схеме:
|
Образец (1мг/мл) Х |
50 мкл |
|
|
Буфер для проб |
5мкл |
|
|
БФС |
5 мкл |
Пробы прогревали на водяной бане при 96ОС в течение 3 мин, с последующим охлаждением до 20О С.
Режим проведения электрофореза:
Вносили в кармашки по 20 мкл проб.
Электрофорез вели при постоянной силе тока. До входа образцов в Р.Г. - ток 20 мА, основной режим - 40-45 мА. Когда полоса БФС дошла до границы геля, электрофорез останавливали.
После электрофоретического разделения гель помещали в кристаллизатор, содержащий раствор 7% уксусной кислоты и 20% спирта (1ч - 24ч) для фиксации.
Окрашивание серебром. Гель отмывали четыре раза по 5 мин в б/дН2О. Гель переносили на 20 мин в 50% -ный раствор этилового спирта, затем ополаскивали в течение 5 мин в б/дН2О. Переносили в раствор 50% -ного спирта, содержащего 0,05% формальдегида, на 15 мин, отмывали 5 мин в б/дН2О, вновь переносили в 50% -ный раствор этилового спирта, отмывали два раза по 5 мин в б/дН2О. Воду сливали и гель заливали свежеприготовленным раствором аммиачного серебра. Для получения 100 мкл красящего раствора (0,36-0,4) г азотнокислого серебра растворяли в 50 мл б/дН2О, добавляли 100 мкл 45% -ного NaOH и титровали до полного растворения коричневого осадка 10% -ным раствором свежеприготовленного аммиака (не более 2 мл!), доводили общий объем до 100 мл б/дН2О. Окрашивание вели не более 15 мин при постоянном встряхивании, чтобы серебро не успело осесть на поверхность геля. Гель переносили в б/дН2О и промывали пять раз по 1 мин. Заливали свежее приготовленным раствором проявителя, содержащим 0,038% формальдегида / 0,005% лимонной кислоты. Если белковые полосы не проявлялись, гель отмывали в 0.5% растворе красной кровяной соли, промывали в б/дН2О, пока гель не станет прозрачным, и повторяли процедуру окрашивания серебром. Время появления полос (6 мин). Гель промывали в б/дН2О в течение 2 ч, сменяя воду каждые 5 мин.
Глава III. Результаты и их обсуждение
Лимфоциты являются ключевым звеном иммунной системы и участвуют почти во всех иммунных и аутоиммунных реакциях, очень важна их роль при аллергических реакциях. [3] Обычно при изучении и оценке иммунного состояния организма, а также исследовании молекулярных механизмов, по которым протекают многие заболевания, главным объектом изучения являются лимфоциты.
Поэтому очень важным этапом в проведении таких исследований является получение чистых и жизнеспособных популяций лимфоцитов.
Основные методы выделения лимфоцитов из периферической крови основаны на центрифугировании гепаринизированной крови в градиенте плотности, что позволяет разделить клетки крови в зависимости от их плотности и осмолярности. Первые методы разделения лимфоцитов включали использование фиколла в качестве агента для формирования градиента плотности, преимущество которого видели в отделении лимфоцитов от моноцитов. При этом получали популяции лимфоцитов с достаточно высоким уровнем чистоты. [11]
Мы выбрали методику, которая позволяла разделять мононуклеарные клетки (МНК) и гранулоциты периферической крови человека с высокой степенью дифференцировки. Стандартная методика позволяет легко получить фракцию МНК, но обычно небольшое количество гранулоцитов все-таки остается, так как есть различия в плотностях в группах МНК у различных образцов. Однако разделение может быть улучшено, подбором осмотической концентрации раствора. Авторы работы [12] показали, что например, использование фиколл-изопак при разделении лейкоцитов и гранулоцитов дает высокую степень очистки из крови человека.
Секреторные гранулы из лимфоцитов выделяли методом описанным в работе [13,14] используя градиент плотности перколла. Особенности работы с ультрацентрифугой:
1. Ротор перед употреблением необходимо охладить, т.е. выдержать в холодильнике при температуре центрифугирования.
2. Пробирки с образцами тщательно уравновесить на электронных весах до четвертого знака после запятой.
Немаловажную роль при патологии отводят нуклеазам лимфоцитов.
Ранее было показано, что лимфоциты крови пациентов с астмой имеют характерные морфологические изменения структурных компонентов. Эти изменения являются результатом биохимических реакций.
По данным литературы [15] описана экспрессия ДНКазной активности (это кислая ДНКаза с молекулярной массой 66 кДа активируется ионами Ca2+ и ингибируется Zn2+, специфична к днДНК) ассоциированной с цитоплазматическими гранулами в активированных CD4+-лимфоцитах человека и участие этих Т-клеток в развитии аутоиммунных заболеваний, что натолкнуло нас на изучение возможного присутствия гранул-ассоциированных ДНКаз в Т-лимфоцитах крови не только пациентов с астмой, но и здоровых людей.
Для этого нам и надо было освоить метод и выделить гранулы из лимфоцитов. В результате была получена фракция, содержащая гранулы, из которой были экстрагированы белки.
Чтобы убедиться, что белки присутствует в белковом экстракте гранул, выделенных из лимфоцитов, мы провели электрофорез (рис.3) и определили их молекулярную массу.
|
1 2 3 |
1 - белковый экстракт гранул на интермитирующей стадии; 2 - белковый экстракт гранул на персистирующей стадии; 3 - маркеры: 68кДа-БСА, 45кДа - ЯА, 29кДа - карбоангидраза: (окрашивание нитратом серебра); |
Рис. 3. Электрофореграмма белков гранул лимфоцитов в полиакриламидном геле.
Дорожки 1 и 2 - образцы экстракта гранул, 3 - маркеры.
Молекулярные массы белков из секреторных гранул составляют: 66 069, 63 095, 50 108, 68 000, 60 255 Да.
Выводы
1. Освоен метод скоростного и равновесного центрифугирования.
2. Освоена работа на ультрацентрифуге Beckman Optima TM L-series.
3. Освоен метод выделения экстракта секреторных гранул Т-лимфоцитов.
4. Освоен метод определения молекулярной массы белков и установлена молекулярная масса белков секреторных гранул Т-лимфоцитов: 66 069, 63 095, 50 108, 68 000, 60 255 Да.
Список литературы
1. Urboniene, D. Autoimmunity in pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease/ D. Urboniene, R. Sakalauskas, B. Sitkauskiene // Medicina (Kaunas). - 2005. - V.41, N.3. - P. 190-195.
2. Kopinski, P. Apoptosis of alveolar lymphocytes in sarcoidosis and in control group is more frequentin smokers then in nonsmoking persons/ P. Kopinski, G. Przybylsk., B. Balicka-Slusarczyk et al // Przegl Lek. - 2006. - V.63. - P.841-847.
3. vignola, a. m. Airway inflammation in mild intermittent and in persistent asthma/ a. m. vignola, p. chanez, a. m. campbell, et al. // am j respire crit care med. - 1998. - v.157. - p.403-409;
4. Ccылка на источник инет
5. Фармация Файн Кемиклз. Каталог продукции 1983. - С. - 71-76.
6. Ccылка на инет
7. Остерман, Л.А. Методы изучения белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование.
8. Невзорова, Т.А. Физико-химические методы в биохимии. 2005 г
9. Ссылка на зи
10. Parrish, J. Z. Cuts can kill: the roles of apoptotic nucleases in cell death and animal development / J. Z. Parrish, X. Deng // Chromosoma. - 2006. - V.115, № 2. - P.89-97.
11. Feucht, HE. Efficient separation of human T lymphocytes from venous blood using PVP-coated colloidal silica particles (percoll) /HE. Feucht, M. R. Hadam, F. Frank, G. Riethmuller . // J Immunol Methods. . - 1980. - V.38. - P.43
12. Boyum, A. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality/ A. Boyum, D. Lovhaug, L. Trasland et al. // Scand. J. Immunol. - 1991. - V.34. - P.697-712.
13. Podack, E. R. Cytolytic T cell granules. Isolation, structural., biochemical and functional characterization/ E. R. Podack., P. J. Konigsberg // J. Exp. Med. - 1984. - V.1. - P.695-710
14. Kornberg, A. Supplement to DNA replication / A. Kornberg/ - San Francisco: W. H. Freeman & Co, 1982. - P.1-203.
15. Pio, R. Granule associated DNase in T4 and T8 lymphocytes from patients with autoimmune diseases / R. Pio, A. Gonzalez, M. J. Lopez-Zabalza et al. // Biochimica et Biophysica Acta. - 1998. - V.1406. - P.51-61.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Общая характеристика B-лимфоцитов. Характеристика субпопуляций, рецепторы и маркеры В-лимфоцитов. Антигенраспознающие рецепторы B-клеток: общая характеристика. Субпопуляции В-лимфоцитов, распознание антигенов рецепторами иммуноглобулиновой природы.
реферат [495,4 K], добавлен 02.10.2014Метод пульс-электрофореза для разделения ДНК индивидуальных хромосом. Выделение ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки и измерение конечной концентрации ДНК. Выделение ДНК из культивируемых клеток: лимфоцитов, прокариот, грибов и растительных клеток.
контрольная работа [576,0 K], добавлен 11.08.2009Основные функции иммунной системы. Генез Т- и В-лимфоцитов. Общие закономерности нарушений иммунной системы. Способность организма отвечать на действие антигена клеточными и гуморальными реакциями. Процессы развития патологических процессов в организме.
реферат [391,2 K], добавлен 23.09.2014Первичные (центральные) и вторичные (периферические) органы иммунной системы. Ведущая роль вилочковой железы (тимуса) в регуляции популяции Т-лимфоцитов. Костный мозг как орган иммунной системы. Контроль селезенки за цитологическим составом крови.
реферат [17,7 K], добавлен 29.10.2011Анализ регуляторной, терморегуляторной, дыхательной, гомеостатической, питательной и защитной функций крови. Исследование форменных элементов крови. Химический состав тромбоцитов. Характеристика сферы действия лейкоцитов. Место лимфоцитов в системе крови.
презентация [630,7 K], добавлен 27.01.2016Морфологическая разнообразность лимфоцитов, экспрессирование ими особых у каждой субпопуляции поверхностных маркеров. Различие Т-клеток по своим антигенраспознающим рецепторам. Дифференцировка В-клеток, активация Т и В-клеток, вызывающая синтез маркеров.
реферат [17,0 K], добавлен 26.09.2009Специфичность и ее значение, взаимодействие антигена и антитела. Основные элементы иммунной системы организма, селекция антител, структура белковой молекулы. Теория "клональной селекции", возникновение разнообразия лимфоцитов или их предшественников.
реферат [21,8 K], добавлен 05.06.2010Иммунология в древности. Основные имена в микробиологии и иммунологии. Период изучения субпопуляций лимфоцитов и гормонов тимуса. Иммунология как фундаментальная наука. Выделение общей иммунологии, иммунотолерантности, иммунохимии, иммуноморфологии.
реферат [19,4 K], добавлен 11.07.2014Понятие, классификация и причины возникновения хромосомных заболеваний. Технология выявления аномального хромосомного набора. Установление кариотипа ядер лимфоцитов периферической крови с помощью микроскопа Leica DM2500 и программы Видео-Карио-Тест.
научная работа [821,8 K], добавлен 24.02.2015Функции первичных и вторичных лимфоидных органов: селезенка, белая и красная пульпа, лимфоузлы, лимфоциты слизистых оболочек. Тимус как место размножения и созревания Т-клеток, участки размножения и созревания В-клеток, схема циркуляции лимфоцитов.
реферат [18,9 K], добавлен 26.09.2009
