Адаптация некоторых животных к среде обитания

3.1 Выбор объекта исследования

В качестве объекта исследования были выбраны животные, постоянно обитающие в воде - пресноводные моллюски. Одной из причин такого выбора является то, что все они испытывают наиболее тесный контакт с окружающей средой по сравнению с другими экологическими группами животных. Пресноводные гидробионты постоянно испытывают техногенную нагрузку вследствие попадания токсических веществ в воду из воздуха, с поверхности почвы и в ходе прямого загрязнения водной среды. По причине своей малоподвижности пресноводные моллюски не могут достаточно быстро переместиться в более благоприятные места обитания и поэтому они вынуждены адаптироваться к изменившимся условиям, вырабатывая определенные механизмы биохимической адаптации к токсическому воздействию.

Именно гидробионты являются удобным объектом для изучения механизмов адаптации, выявления границ индивидуальной изменчивости, что позволяет делать выводы о степени устойчивости и чувствительности к техногенному фактору.

Для исследования были отобраны наиболее часто встречающиеся и простые для определения до вида моллюски: живородка речная (Viviparus viviparus), прудовик обыкновенный (Lymnaea stagnalis), прудовик ушковый (Lymnaea auricularia). Данные виды моллюсков широко распространены в водоемах Московской области и являются удобными объектами для сбора и временного содержания в лабораторном микрокосме.

3.2 Оптимизация условий ПЦР

Одним из наиболее важных составляющих анализа молекулярного полиморфизма фрагментов ДНК является подбор олигонуклеотидных праймеров и оптимизация условий ПЦР (полимеразная цепная реакция). При подборе праймеров опирались на известные исследования по выявлению внутривидового полиморфизма у хорошо изученных видов моллюсков, генетически родственных исследуемому нами виду, таких, например, как Helix aspersa, Biomphalaria glabrata, а также других видов беспозвоночных животных - представителей круглых червей, являющихся генеалогическими предками моллюсков, таких, например, как Caenorhabditis elegans и Schistosoma mansoni. В ходе исследования исследования был протестирован 21 праймер (табл. 1). Наиболее удачные из них отбирали по результатам экспериментов.

Таблица 1. Характеристики олигонуклеотидных праймеров для амплификации полиморфных фрагментов ДНК V.viviparus

Примечания

*Праймеры, в названиях которых присутствуют обозначения F (forward, прямой) и R (reverse, обратный), использованы попарно; при отсутствии таких обозначений соответствующий праймер служил прямым и обратным одновременно.

**В скобках приведены ссылки на следующие литературные источники: 1 - [Antunes, 2010], 2 - [Guiller, 2000], 3 - [Martin, 2002], 4 - [Raghavana, 2007]; прочерк - данные не опубликованы

Температуру плавления каждого праймера для ПЦР определяли, руководствуясь следующими эмпирическими формулами:

1) Tm°C = [(A+T) ? 2] + (G+C) ? 4] (если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований);

2) Tm = 22 + 1.46 ? ([2 x (G+C)] + (A+T)) (если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований).

В том случае, если продукты ПЦР с конкретным праймером на электрофореграмме были нечеткими, либо были представлены в небольшом количестве, или же присутствовали неспецифические продукты ПЦР, то температуру отжига корректировали до достижения наибольшей четкости и максимального числа специфических фрагментов ПЦР (рис.2).

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации ДНК речной живородки: 1 - маркер молекулярной массы (200, 500, 1000 - размер фрагментов маркера, п.н.), 2-5 - праймеры Hita2-F&R; 6-9 - TCRS; 10-13 - TCR2; 14 - AACC; 5 - BGR2; 16 - Ha11-F&R

ДНК, выделенная из мышечной ткани каждой особи каждого вида, была использована для постановки ПЦР с каждым из отобранных нами праймеров. Наиболее четкие результаты были получены для вида живородка речная (V. viviparus). ДНК, выделенная из мышечной ткани живородки, могла храниться в замороженном виде в течение продолжительного периода. Продукты ПЦР на электрофореграммах были наиболее четкими, представлены большим количеством фрагментов (более 20), что делало их удобными для статистической обработки. Результаты эксперимента хорошо воспроизводились на разных наборах для постановки ПЦР-реакции.

Из всей совокупности отобранных праймеров, наиболее удачными для амплификации полиморфных фрагментов ДНК живородки оказались ААСС, АТГГ, Ha2-F&R, Ha5, Ha11, Ha11-F&R, Hita2, Hita5-F&R, ТС5.4, TC1R1S, ТСЗ.1, TC1R2, BGR2-F&R. На электрофореграммах с каждого из них наблюдались отчетливо различимые продукты ПЦР, представленные в большом количестве и были удобными для последующей обработки. Именно эти праймеры были использованы на следующих этапах исследования.

Остальные праймеры не подошли для исследования, поскольку продукты ПЦР электрофореграммах не были обнаружены или же были сложно различимы и представлены в небольшом количестве, что затрудняло их дальнейшую обработку. Кроме того, продукты ПЦР с данными праймерами не всегда воспроизводились должным образом, и для дальнейшего ПЦР-анализа мы их не использовали.

Для остальных видов моллюсков результаты оказались неоднозначными. На электрофореграммах продукты ПЦР были нечеткими, представлены в небольшом количестве (менее 5 фрагментов), зачастую плохо разделялись между собой или не всегда воспроизводились в одних и тех же условиях. В итоге статистическая обработка таких результатов оказалась затруднительна, и от использования этих видов моллюсков в качестве объектов исследования было решено отказаться.

3.3 Выбор и характеристика водоемов

Для исследования были выбраны водоемы, расположенные на территории Москвы и Московской области: водохранилища Пестовское, Пироговское, Химкинское, Клязьминское и река Москва в верхнем течении относительно территории г. Москвы. По берегам каждого из этих водоемов было выбрано несколько станций сбора гидробионтов (табл. 2).

Таблица 2. Расположение станций сбора материала

*Примечание: в обозначениях станций сохранены оригинальные номера, присвоенные в ходе значительно более масштабного исследования, только часть результатов которого получена при участии автора и стала предметом обсуждения в настоящей работе

При выборе станций учитывались следующие особенности:

1) доступность (наличие подходов, подъездов, свободный допуск),

2) наличие в водоеме исследуемых видов моллюсков,

3) ожидаемый уровень загрязненности вследствие близости техногенных объектов (населенных пунктов, промзон, крупных автомагистралей, сельскохозяйственных угодий), территориальная разобщенность водоемов, исключающая свободное распространение моллюсков,

На данном этапе работы был проведен сбор информации о районах, где расположены исследуемые водоемы. Далее была изучена прибрежная зона водоемов, дна и непосредственно толщи воды, взяты пробы грунта для приготовления вытяжек и анализа химического состава и количества основных загрязнителей водоемов, а именно полихлорированных бифенилов (ПХБ), Cu2+, Zn2+, Pb2+, Ni2+, Cr3+, Cd2+, нефтепродуктов. Анализ был произведен в химической лаборатории ООО «Биотест», Москва (табл. 3).

Таблица 3. Содержание основных загрязнителей в грунте исследованных водоемов*

Примечания

*Доверительные интервалы для всех значений чрезвычайно малы и составляют 2-4%

Поскольку проанализированные загрязнители склонны к аккумуляции и определялись в донных отложениях, их содержание в вытяжках из грунта существенно превышает их концентрацию в воде и указанные значения ПДКводн. Величина ПДКводн. в данном случае приведена только для ориентира и сравнительной оценки токсичности разных веществ.

Химический анализ воды в местах сбора моллюсков не проводился, так как является сезонным показателем, зависящим от многих факторов - осадков, силы течения, растворимости веществ, взаимного влияния их друг на друга, поведения в водном растворе, температуры воды, освещенности, деятельности живых организмов, населяющих водоемы.

Станции 1.1-1.3 расположены в малонаселенной местности на берегу Пестовского водохранилища, образованного посредством строительства гидроузла на реке Вязь. Водохранилище судоходно. Используется для водоснабжения Москвы. Его юго-западная часть соединяется с Икшинским водохранилищем, северная часть - с Пяловским водохранилищем, а северо- западная часть - через Пестовскую плотину с Учинским водохранилищем. На водохранилище располагаются пристани «Хвойный Бор», «Зелёный Мыс»,

«Лесное», «Михалёво» и «Тишково». Является популярным местом отдыха.

Берега водоема сильно заросли водной и прибрежноводной растительностью; преобладают рогоз, осоки, рдест, роголистник, кувшинка. Среди беспозвоночных в изобилии встречены личинки вислокрылок, подёнок, веснянок, моллюски - живородка, прудовик, перловица, беззубка, множество пиявок, бокоплавов, водяных осликов, попадаются мелкие раки. Вблизи берега держится множество мальков плотвы. Цветение воды отсутствует. На дне мало детрита, автотрофных организмов и бентосных животных (малощетинковых червей, личинок комаров-долгоножек). В целом гидробиологическое состояние водоема благоприятное, явных признаков загрязнения воды, замусоривания берегов не выявлено.

ПХБ, Zn2+, Cd2+ на станции обнаружено не было, содержание катионов меди колеблется в пределах ПДК, содержание Pb2+, Ni2+, Cr3+ превышает величину ПДК незначительно, тогда как нефтепродукты превышают значение ПДК в 10 раз.

Станции 8.1, 8.2 и 8.4 расположены на берегу Пироговского водохранилища вдали от автомагистралей, промышленных и населенных районов. Водохранилище является частью Клязьминского водохранилища от Чиверево до Пироговской плотины, судоходно. На берегу водохранилища находится популярное место отдыха «Бухта радости» с одноимённым причалом. Соединено с Пяловским и Химкинским водохранилищами искусственным каналом им. Москвы. На восточном окончании построена плотина, сквозь которую вытекает река Клязьма. Водохранилище популярно среди яхтсменов и любителей гидроцикла [Чухрай, 1969]

Берега водоема и прибрежная зона сильно заросли растительностью, из высших растений преобладают рогоз, осоки, рдест, роголистник. Глубина прибрежной зоны увеличивается постепенно. Явных признаков загрязнения и замусоривания не отмечено. Вода прозрачная, дно в основном песчаное, иногда встречаются заиленные участки; детрит содержит остатки растительного и животного происхождения. Вода стоячая, практически отсутствует течение. В водоеме обнаружено много червей, моллюсков, личинок подёнок, вислокрылок, стрекоз, комаров-долгоножек, мошек. Встречаются ракообразные и рыбы. Среди моллюсков были встречены живородка, прудовик обыкновенный, прудовик ушковый. Общее состояние водоема весьма благоприятное.

ПХБ и Cd2+ на станции не обнаружены, а остальные токсиканты, находятся в количествах, превышающих значение ПДК в 3-5 раз.

Станция 9.1 расположена на берегу Клязьминского водохранилища вблизи от автомагистралей, промышленных и населенных районов. Водоем является судоходным. На берегах водохранилища располагаются зоны отдыха с гостиницами, ресторанами, кафе для детей, мини-зоопарком. Распространён яхтенный и парусный спорт. По берегам расположено множество лодочных станций, с вёсельными и моторными лодками, катамаранами, катерами и водными мотоциклами, большое количество пляжей и причалов. Берега водоёма заселены, левый берег местами распахан [Нарочницкий, 1980]. Вполне вероятны загрязнения металлической пылью и топливом, отходами с предприятий, а также бытовыми отходами.

Берега не имеют обильной растительности. Водная растительность также встречается редко. Течение практически отсутствует. Глубина водоема быстро нарастает. Дно в прибрежной зоне песчаное; детрит, содержащий остатки растительного и животного происхождения, встречается на небольшом удалении от берега.

Ил серого цвета и в нем содержатся организмы, приспособленные к недостатку кислорода и высокому содержанию углекислоты, также имеются включения растительного и животного происхождения (в основном раковины брюхоногих моллюсков). Среди гидробионтов преобладают тубифициды, личинки ручейников, стрекоз, пиявки, а также моллюски вида живородка речная и мелкие двухстворчатые моллюски. В водохранилище водятся плотва и подлещик.

Все исследованные токсиканты за исключением Cd2+ значительно превышают ПДК; содержание Cd2+ в пределах нормы. В целом состояние водоема можно оценить, как неудовлетворительное.

Станции 10.1-10.4 находятся на берегу Химкинского водохранилища вблизи от автомагистралей и населенных районов - водохранилище расположено на северо-западе Москвы на границе районов Южное Тушино, Северное Тушино, Покровское-Стрешнево, Войковский, Головинский, Левобережный и подмосковного города Химки. Над поверхностью водохранилища построены три автомагистрали и железнодорожный мост. Водоем является судоходным. На водохранилище расположены Северный речной вокзал, от причалов которого отходят теплоходы, связывающие Москву с пятью морями, и Северный речной порт столицы. Имеются также пассажирские пристани Захарково и Дубовая Роща. Берега водохранилища являются популярным местом отдыха. Близ водохранилища размещены водноспортивные комплексы. На акватории водохранилища традиционно проводятся различные спортивные соревнования [Нарочницкий, 1980].

Берега густо заросли осокой; водная растительность скудна, присутствуют нитчатые зеленые водоросли, на поверхности воды - ряска. Течение практически отсутствует. Глубина водоема медленно нарастает. Дно в прибрежной зоне песчаное. Ил серого цвета, и в нем содержатся организмы, приспособленные к недостатку кислорода и высокому содержанию углекислоты, так же так же имеются включения растительного и животного происхождения (в основном раковины брюхоногих моллюсков).

Среди гидробионтов отмечено много тубифицид, личинки вислокрылок, ручейников, комаров-долгоножек, мошек, водяные ослики, бокоплавы, брюхоногие моллюски. Общее состояние водоема удовлетворительное.

Станции характеризуются значительным превышением уровня ПДК по всем исследованным показателям, что свидетельствует о неудовлетворительном состоянии водоема.

Станции 12.1-12.3 расположены на берегу реки Москвы недалеко от места впадения в нее реки Истры вблизи от автомобильных дорог, дачных поселков и садовых товариществ. Вероятны загрязнения, удобрениями, химическими веществами, используемыми в дачном хозяйстве, а также бытовыми отходами.

Для верхнего течения Москва-реки характерно чередование перекатов с быстрым течением, плёсов с замедленным течением и наличие омутов, где проточность воды почти равна нулю. Глубина водоема быстро нарастает. Река в месте сбора материала около 100 м в ширину, течение медленное, берега густо заросли осокой, водная растительность скудна, присутствуют нитчатые зеленые водоросли, на поверхности воды - ряска. Процессы фотосинтеза угнетены. Грунт песчано-каменистый. В местах сбора моллюсков наблюдается значительная толщина ила (до 50-60 см), поскольку из-за слабого течения происходит интенсивное отложение наносов. Ил серо-черного цвета с запахом H2S, и в нем содержатся организмы, приспособленные к недостатку кислорода и высокому содержанию углекислоты. Вблизи дна преобладают восстановительные процессы; много детрита (слой 20-30 см) темно- коричневого цвета, состоящего из остатков растительного и животного происхождения. Планктон Москва-реки весьма беден, фитопланктон также не отличается высоким разнообразием. Донная фауна верхней части Москва-реки довольно разнообразна, но качественно небогата. Макробеспозвоночные представлены в основном личинками комаров-звонцов, олигохетами Tubifex tubifex, моллюсками живородка речная и мелкими двухстворчатыми моллюсками, встречаются речные раки. Во множестве присутствуют мальки рыб, ловится крупная рыба.

В глубоких омутах и ямах, где течение очень слабое или совсем отсутствует, грунт илистый, обычно встречаются лещ, язь. В прибрежных, сильно заросших растительностью участках, а также в заливах обитают плотва, линь, краснопёрка, серебряный карась.

Все показатели на станции значительно выше предельно допустимых концентраций, что свидетельствует о неблагоприятном состоянии водоема Общее состояние водоема можно охарактеризовать как неудовлетворительное.

3.4 Кластеризация экспериментальных данных

Термин «кластерный анализ» в действительности включает в себя набор различных алгоритмов статистической обработки данных. Общий вопрос, задаваемый исследователями во многих областях, состоит в том, как организовать наблюдаемые данные в наглядные структуры. Существует точка зрения, что в отличие от многих других статистических процедур, методы кластерного анализа используются в большинстве случаев тогда, когда нет каких-либо априорных гипотез относительно классов, но исследование все еще находится в описательной стадии. Большое достоинство кластерного анализа в том, что он позволяет производить разбиение объектов не по одному параметру, а по целому набору признаков. Кроме того, кластерный анализ в отличие от большинства математико-статистических методов не накладывает никаких ограничений на вид рассматриваемых объектов, и позволяет рассматривать множество исходных данных [Hartigan, 1975].

Назначение алгоритма кластеризации состоит в объединении объектов (например, животных) в достаточно большие группы (кластеры), используя некоторую меру сходства или расстояние между объектами (различие).

Типичным результатом такой кластеризации является иерархическое дерево (древовидная диаграмма, дендрограмма), которое описывает близость отдельных точек и кластеров друг к другу и в графическом виде представляет последовательность объединения кластеров. Дендрограмма начинается с каждого объекта в классе (в левой части диаграммы). На данном этапе каждый объект считается отдельным кластером. Постепенно, очень малыми шагами критерий о том, какие объекты являются уникальными, а какие схожими между собой, ослабляется. Другими словами, понижается порог, относящийся к решению об объединении двух или более объектов в один кластер.

В результате, связывается вместе всё большее и большее число объектов и объединяется всё больше и больше кластеров, состоящих из всё сильнее различающихся элементов. Окончательно, на последнем шаге все объекты объединяются вместе. На этих диаграммах вертикальные оси представляют наблюдения, горизонтальные - расстояние объединения. Так, для каждого узла в графе (там, где формируется новый кластер) можно увидеть величину расстояния, для которого соответствующие элементы связываются в новый единственный кластер.

Наиболее общим типом расстояния является Евклидово расстояние. Оно является геометрическим расстоянием в многомерном пространстве. В результате успешного анализа методом объединения появляется возможность обнаружить кластеры (ветви) и интерпретировать их (рис. 3).

Рис. 3. Дендрограмма, построенная при помощи программы Statistica 10.0 по данным молекулярного полиморфизма речной живородки с разных станций сбора

На первом шаге, когда каждый объект представляет собой отдельный кластер, расстояния между этими объектами определяются выбранной мерой. Однако когда связываются вместе несколько объектов, возникает вопрос, как следует определять расстояния между кластерами. Другими словами, необходимо правило объединения или связи для двух кластеров. Для этого применяются различные методы. Мы использовали метод попарной группировки невзвешенных средних (в англоязычной литературе - unweighted pair-group method using arithmetic averages, UPGMA). В этом методе расстояние между двумя различными кластерами вычисляется как среднее расстояние между всеми парами объектов в них. Этот метод наиболее эффективен, когда объекты в действительности формируют различные «рощи» [Sneath, 1973] (в нашем случае - популяции моллюсков или грунты определенным составом загрязнителей) и показал ожидаемые результаты в ходе нашего и предыдущих аналогичных исследованиях, из года в год производимых в лаборатории экологической биохимии МГОУ (сотрудники лаборатории любезно предоставили мне возможность участвовать в исследовании и снабдили данными, недостающими для построения законченной работы, в частности описаниями станций сбора моллюсков, данными химического анализа грунта, итогами оптимизации исследования молекулярного полиморфизма моллюсков методом ПЦР и кластерного анализа биологической информации, за это автор выражает им искреннюю признательность и благодарность).

Кластерный анализ количественных данных о загрязнениях водоемов выявил распределение всех точек сбора по группам. Каждую группу формируют станции, наиболее сходные между собой, как правило, расположенные в одном водоёме (рис. 4).

1.1

1.3

1.2

8.1

8.4

8.2

9.1

10.1

10.2

10.3

10.4

12.1

0 1 2 3 4 5 6

Евклидово расстояние

Рис. 4. Дендрограмма распределения загрязнений по станциям сбора материала. По вертикали - номера станций

Станции 1.1-1.3 были получены при анализе проб грунта, собранных по берегу Пестовского водохранилища. Далее - аналогично: 8.1, 8.2 и-8.4 - Пироговское водохранилище, 9.1 - Клязьминское водохранилище, 10.1-10.4 - Химкинское водохранилище, 12.1-12.3 - р. Москва близ Ильинского шоссе.

Взаиморасположение кластеров на дендрограмме указывает на сходные и различные водоемы, формирующие удобную модельную систему для исследования межпопуляционных различий моллюсков в зависимости от качества среды их обитания.

В результате статистической обработки данных, полученных после ПЦР, была построена дендрограмма, на которой особи распределились по кластерам в соответствии с расположением станций сбора. Все станции сбора, расположенные на одном водоеме, образовали более крупные кластеры. Этот результат полностью соответствует ожиданиям выявить наименьшие различия между группами особей, отобранных из одной популяции (водоема), а также указывает, на то, что изолированные популяции становятся непохожими друг на друга, накапливая всё большие генетические различия (рис. 5).

1.1

1.3

1.2

8.1

8.2

8.4

9.1

12.1

12.2

12.3

10.1

10.2

0 2 4 6 8 10 12 14

Евклидово расстояние

Рис. 5. Дендрограммы распределения полиморфных ПЦР-фрагментов в популяциях V.viviparus по станциям сбора материала. По вертикали - номера станций.

В пределах одного водоема, но на некотором удалении могут возникать популяции, непохожие друг на друга генетически. Причиной этого может служить территориальная изоляция, характерная для столь малоподвижных видов как брюхоногие моллюски, особенно, живородка, которая на всех стадиях индивидуального развития остается привязанной к субстрату.

3.5 Обсуждение результатов

Все водоемы, в которых собирались моллюски, имели различные гидрологические характеристики: показатели сапробности, содержание токсических веществ в грунте, проточность, техногенная нагрузка на водоем. При этом характеристики некоторых из исследованных водоемов оказались очень близки, что в свою очередь повлияло на распределение моллюсков таким образом, что популяции, обитающие в географически разделенных водоемах, оказывались сходны между собой на генетическом уровне.

Состав продуктов ПЦР является молекулярной характеристикой генома. Они без ограничений передаются по вертикали и горизонтали, но поскольку амплифицированные фрагменты в большинстве своем локализованы в нетранскрибируемой части генома, их полиморфизм, скорее всего, никак не проявляется фенотипически, а, следовательно, не подвергается естественному отбору. Однако, поскольку мутации ДНК, индуцированные внешними факторами, могут отразиться на составе продуктов ПЦР, этот признак, помимо естественного процесса накопления спонтанной изменчивости может характеризовать степень воздействия среды обитания на организм, а значит, сказывается и на кластеризации определенных групп особей.

Моллюски со станций 8.# (Пироговское вдхр.) оказались наиболее близки особям со станции 9.1 (Клязминское вдхр.), что в целом соответствует распределению этих станций по уровню загрязненности грунта в указанных водоемах. Более того, данные водоемы географически близки друг другу, будучи связанными в одну аквасистему (рис. 6).

Рис. 6. Карта-схема местности, где расположены Клязьминское и Пироговское водохранилища (по данным Яндекс-карты)

Следующими по степени сходства набора полиморфных фрагментов на дендрограмме расположились моллюски, собранные на станциях 12.# (р. Москва) и 1.# (Пестовское вдхр.), однако, данные водоемы по загрязненности имеют наибольшие различия между собой, а кроме того, территориально эти акватории чрезвычайно разобщены - более 50 км по прямой и отсутствие всякой естественной связи между ними по воде (не считая искусственных каналов с регулируемым стоком и направлением течения в р- не Покровское-Стрешнево, г. Москва). Каковы же могут быть условия обитания, приведшие к генетической близости данных популяций моллюсков, нам выяснить пока не удалось.

Неслучайность выявления этого сходства в обоих случаях подтверждается наибольшей близостью особей, собранных в одном и том же водоеме (кластеры станций 12.1-12.3 и 1.1-1.3 формируются независимо друг от друга, см. рис. 4).

Станции 10.# формируют кластеры, удаленные от остальных на обеих дендрограммах, т.е. особи живородки, обитающей в Химкинское вдхр., генетически отличаются от представителей других популяций данного вида моллюсков так же, как и сам водоем по данным о химическом загрязнении грунта. В то же время, Химкинское вдхр. имеет хоть и удаленную, но непосредственную связь с Клязьминским вдхр. через Канал им. Москвы (чуть более 12 км по воде).

Тем не менее, эта связь практически не сказалась на различии этого водоема от других, выявленном как по химическому составу грунта, так и по набору полиморфных ПЦР-фрагментов речной живородки.

Учитывая, что степень загрязненности играет, пожалуй, решающую роль в кластеризации станций 10.1-10.4, можно предположит, что именно этот фактор повлиял на внутривидовую дифференциацию моллюсков данного водоема вследствие генетической адаптации к условиям обитания.

Таким образом, мы получили данные о молекулярной дифференциации моллюсков, неоднозначно свидетельствующие о причинах этого процесса.

Не исключено, что одним из факторов внутривидовой дифференциации действительно является техногенная загрязненность и экологическое состояние водоемов - мест обитания популяций живородки.

Однако, судя по результатам исследования, это не может служить единственной причиной накопления генетических различий между популяциями (напр., со станций 1.# и 8.#) или сохранения первородного сходства между ними (напр., со станций 8.# и 9.1).

Очевидно, что при отсутствии жестких факторов отбора, случайный мутационный процесс так же может привнести существенный вклад в изменчивость, и в таком случае свидетельствовать уже не о различии условий обитания, которые могут быть вполне близкими или даже единообразными, как напр., в Пестовском и Пироговском водохранилищах (станции 1.# и 8.#), а о времени разобщения данных акваторий и формирования новых мест обитания моллюсков после расселения их из исходного водоема.

Иными словами, быть свидетельством истории происхождения водоемов, если таковая по каким-либо причинам не ясна.

Таким образом, применение ПЦР- анализа молекулярного полиморфизма моллюсков помимо прикладного - оценки загрязненности и мониторинга экологического состояния водоемов обретает еще один, уже теоретический аспект - исследование происхождения водоемов по данным о расселении и формировании изолированных популяций моллюсков.

Заключение

Неоднородность генотипа и фенотипа особей, входящих в популяцию, имеет большое экологическое значение. В зависимости от конкретных условий больше шансов выжить у особей с определенным набором признаков, которые затем снова восстанавливают всю популяцию.

Полиморфизм может быть обусловлен как внешними факторами, необходимостью приспосабливаться к меняющимся условиям обитания, так и генетическими причинами. Чаще всего невозможно выделить одну причину возникновения внутривидового полиморфизма, как правило, данное явление индуцируется комплексом факторов.

В нашем исследовании на примере Московской области показано существование молекулярного полиморфизма среди популяций пресноводного моллюска Viviparus viviparus L., обитающих в водоемах, различных по своим экологическим характеристикам, гидрологическому состоянию и химическому составу донных отложений. Широкое изучение природных водоемов позволило сделать определенные обобщения о закономерностях межпопуляционного полиморфизма. Особи, принадлежащие к разным популяциям, отличаются друг от друга по набору полиморфных ПЦР-фрагментов ДНК, что соотносится с общим состоянием водоема - чем ближе водоемы по своим экологическим характеристикам или происхождению (или расположению), тем больше сходства на молекулярном уровне проявляют моллюски, обитающие в них.

Как показали наши собственные и имеющиеся в литературе данные, использование молекулярных маркеров полиморфизма актуально для расширения спектра методов биоиндикации и биологического мониторинга природных вод, сохранения и улучшения состояния водоемов, изучения эволюции акваторий и других факторов изоляции и внутривидовой дифференциации гидробионтов. Дальнейшие исследования в этой области позволят выявить дополнительные факторы, влияющие на процесс возникновения генетических различий между популяциями и расширить область практического и теоретического применения столь технологичного и высокоточного метода как ПЦР-анализ генетического полиморфизма гидробионтов.

Выводы

1. Живородка речная Viviparus viviparus L. по сравнению с другими представителями гидробионтов, населяющих водоемы Московской области, является наиболее удобным объектом для изучения внутривидовой дифференциации в связи с его биологическими и молекулярными особенностями.

2. Открытые водоемы Московской области, разнообразные по экологическому состоянию, гидрохимическим и гидрологическим характеристикам, формируют уникальную гидросистему с оптимальными условиями для изучения возможностей метода ПЦР-анализа молекулярного полиморфизма.

3. Подобраны оптимальные условия для амплификации полиморфных фрагментов ДНК речной живородки, выявлена внутрипопуляционная молекулярная однородность моллюсков, обитающих в одном водоеме, и межпопуляционная дифференциация особей из различных водоемов по комплексу специфичных ПЦР-продуктов на электрофореграммах.

4. Степень различия изолированных популяций живородки речной определяется не только загрязненностью и экологического состояния водоемов, но и множеством других факторов (проточность водоемов, температура воды, состав грунта, разнообразие кормовой базы и других, природа которых нами пока не выявлена), влияющих на процесс внутривидовой дифференциации и микроэволюцию пресноводных гидробионтов.

Литература

1. Алтухов Ю. П., Рычков Ю. Г., 1970. Популяционные системы и их структурные компоненты. Генетическая стабильность и изменчивость // Журн. общ. биологии. Т.31. С.507-526.

2. Брагинский Л.П., 1972. Пестициды и жизнь водоемов. Киев, Наукова думка. 179 с.

3. Высоцкая Р.У., Немова Н.Н., 2008. Лизосомы и лизосомальные ферменты рыб. М.: Наука. 284 с.

4. Григорьев А.И., 2008. Экология человека: учебник для вузов. М.: Просвещение. 240 с.

5. ГОСТ Р 53218-2008. Атомно-абсорбционный метод определения содержания тяжелых металлов. М.: Стандартинформ. 2009. 11 с.

6. ГОСТ Р 54503-2011. Вода. Методы определения содержания полихлорированных бифенилов. М.: Стандартинформ. 2013. 32 с.

7. ГОСТ Р 52406-2005. Вода. Определение нефтепродуктов методом газовой хроматографии. М.: Стандартинформ. 2007. 25 с.

8. Дроганов Е.И., Поликарпова Л.В., Дроганова Т.С., Цветков И.Л., Коничев А.С., 2014. Биохимический и молекулярный полиморфизм в популяциях речной живородки (Viviparus viviparus L.) // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». №2. С. 20-29.

9 Догель В.А., 1981. Зоология беспозвоночных: учебник для ун-тов / ред. Полянский Ю.И. М.: Высшая школа. 606 с.

10. Иваченко Л.Е., 2010. Роль множественных форм ферментов сои в процессе биохимической адаптации к условиям выращивания // Успехи современного естествознания. №9. С. 96-98.

11. Коничев А.С., Цветков И.Л., Попов А.П. и др., 2012. Практикум по молекулярной биологии. М.: КолосС. 151 с.

12. Кутикова Л.А., Старобогатов Я.И., 1977. Определитель пресноводных беспозвоночных европейской части СССР (планктон и бентос). Л.: Гидрометеоиздат. 516 с.

13. Лаврентьева Е.В., Банзаракцаева Т.Г., Раднагуруева А.А. и др., 2012. Основы молекулярных механизмов регуляции генов пептидаз в прокариотической клетке: Учебное пособие. Улан-Удэ. 66 с.

14. МУ 2.1.7.730-99. Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест: Методические указания. М.: Минздрав России, 1999. 19 с.

15. Нарочницкий А. Л., 1980. Москва. Энциклопедия. М.: Советская энциклопедия. 688 с.

16. Небел Б., 1993. Наука об окружающей среде. М.: Мир. Т.1. 420 с.

17. Немова Н.Н., Высоцкая. Р.У., 2004. Биохимическая индикация состояния рыб. М.: Наука. 216 с.

18. Парк Д.В., 1973. Биохимия чужеродных соединений. М.: Медицина. 287 с.

19. Патрушев Л.И., Минкевич И.Г., 2007. Проблема размера геномов эукариот // Успехи биологической химии. Т.47. С.293-370.

20. Пыхтеева Е.Г., 2009. Металлотионеин: биологические функции. Роль металлотионеина в транспорте металлов в организме // Актуальные проблемы транспортной медицины. Т.18, №4. С.44-58.

21. Саловарова В.П., Приставка А.А., Берсенева О.А., 2007. .Введение в биохимическую экологию: Учеб. пособие. Иркутск: Иркут. гос. ун-т. 159 с.

22. Стручкова И.В., Брилкина А.А., Веселов А.П., 2011. Регуляция биосинтеза белка: Учебно-методическое пособие. Н.-Новгород: Нижегородский госуниверситет. 101с.