Адаптация некоторых животных к среде обитания

1.1 Основные источники загрязнения

Тяжелые металлы. Группу тяжелых металлов можно отнести к микроэлементам, в этом ряду одни крайне необходимы для жизнеобеспечения живых организмов, другие вызывают противоположный эффект и, попадая в организм, приводят к его отравлению или гибели. [Небел, 1993]. Основное внимание уделяется тяжелым металлам, имеющим удельную плотность свыше 5 г/см3 - ртуть, медь, никель, кобальт, свинец, цинк, кадмий, хром, олово. К этой группе по своим свойствам примыкает мышьяк. При некоторых условиях и другие металлы (например - алюминий, сурьма, титан и др.) могут проявлять высокую токсичность. Источником загрязнения окружающей среды металлами являются предприятия горнорудной, металлургической отраслей промышленности, энергетики и транспорт [Филенко, 2007].

Важной особенностью металлов является устойчивость загрязнения. Сам элемент разрушиться не может, переходя из одного соединения в другое или перемещаясь между жидкой и твердой фазами. Возможны окислительно- восстановительные переходы металлов с переменной валентностью. Перемещение металлов возможно через атмосферу в связи с летучестью некоторых металлов или их соединений (Pb, As, Sn, Zn, Cd, Hg, Cu, Se) и через воду в связи со способностью образовывать в естественных условиях растворимые соединения (As, Zn, Cd, Сu, Se, Сг). Все металлы и их соединения способны адсорбироваться и переноситься взвешенным в природных водах ве- ществом. Со временем происходит депонирование металлов в донных осадках [Филенко, 2007].

Металлы в растворенной фракции могут находиться в виде гидратированных ионов, неорганических и органических соединений и комплексов, в том числе с хелатообразователями, гуминовыми, фульвовыми кислотами, полисахаридами, всегда присутствующими в природных водах.

Нефть и нефтепродукты. Любая нефть представляет собой сложную смесь алканов (парафиновых и ациклических насыщенных углеводородов), цикланов (нафтенов) и ароматических углеводородов, кислородных, сернистых и азотистых соединений, меркаптанов, сульфидов, пиридинов, гидропиридинов, гидрохинолинов, воды, минеральных солей.

На живые организмы нефть оказывает комплексное действие, как механическим путем, так и за счёт отравления компонентами, обладающими биологической активностью (растворимыми в воде компонентами).

Пестициды. Ядохимикаты до настоящего времени остаются необходимым средством борьбы с организмами, повреждающими промышленную и сельскохозяйственную продукцию, строения и сооружения, служащими переносчиками или хозяевами возбудителей различных заболеваний. Некоторые ядохимикаты - биоциды - специально созданы для вмешательства в ход биологических процессов в водной среде. Среди них могут быть выделены альгициды - средства подавления водной растительности, моллюскоциды - средства уничтожения моллюсков- переносчиков паразитарных заболеваний, ихтиоциды - средства воздействия на популяции рыб, считающихся сорными, сляймициды - средства предотвращения обрастаний материалов слизеобразующими организмами, и др.

В составе большинства пестицидов, выделяется лишь несколько химических групп, к которым эти соединения относятся. Это группы хлорорганических, фосфорорганических, металлорганических соединений, производные карбаминовой кислоты и мочевины.

Полихлорированные бифенилы (ПХБ). Эти соединения широко использовались во многих странах мира в качестве диэлектриков, антифризов, наполнителей гидравлических систем, пластификаторов. Загрязнения возможны при утечках в процессе их производства и применения. Особенностью этих соединений является их низкая химическая активность и, как полагают, отсутствие токсичности для млекопитающих. В связи с этим применение таких веществ не было обусловлено необходимыми мерами предосторожности [Парк, 1973; Филенко, 2007].

Диоксины. Обычно эти соединения являются побочным продуктом некоторых химических производств и присутствуют в качестве примесей к хлорорганическим пестицидам. Диоксины отличаются необычайно высокой стабильностью в окружающей среде и сродством к липидам тканей организмов. Эти свойства определяют высокую накопительную способность этих соединений [Парк, 1973; Филенко, 2007].

Синтетические поверхностно-активные вещества (СПАВ). СПАВ характерны тем, что каждая молекула такого вещества имеет фрагменты, обладающие разной способностью к растворению в полярных и неполярных растворителях. В стиральные порошки входят линейные алкилированные сульфонаты (ЛАС), заместившие ранее использовавшиеся аикилбензенсульфонаты, основные и анионные ПАВ. Хотя ЛАС быстрее разрушаются в растворах, их токсичность несколько выше.

ПАВ относительно устойчивы в окружающей среде и в организме животных. В некоторых загрязняемых природных водах уровень ПАВ может достигать 5 мг/л.

Использование СПАВ в качестве эмульгаторов при борьбе с утечками нефти с точки зрения экологии недопустимо, так как это приводит к повышению концентрации чужеродного агента в окружающей среде в дополнение к нефти и к повышению растворимости в воде токсичных компонентов нефти.

Компоненты и отходы сырья биологического происхождения.

Со сточными водами или при специальном применении в водные объекты могут попадать и такие ядовитые веществам растительного происхождения как алкалоиды: никотин, анабазин, кофеин, стрихнин, атропин, кониин, телепатин.

Это группа азотистых соединений, обладающих основными свойствами, в большинстве своем являются сильными ядами, но в малых дозах используются в качестве лекарственных веществ. Токсичными для гидробионтов оказываются широко распространенные в природе, в соке и смоле хвойных деревьев камфора, тимол и другие терпены (непредельные углеводороды), а также эфирные масла из сосновой смолы и канифоли. Эти вещества загрязняют воду в результате лесосплава или при попадании в воду листового и хвойного опада. Все они действуют преимущественно как нервные яды. Смола растений (особенно из хвои сосны) состоит из смеси смоляных кислот, древесного спирта, ароматических альдегидов, эфирсодержащих масел и других соединений. Токсичными для рыб являются продукты выщелачивания древесины и коры, продукты, выделяемые из хвойной смолы и ягод, например, эфирные масла туи.

Помимо этих основных групп, важность для токсикологии может представлять появление в водной среде продуктов хлорирования и отходов химических производств, родственные по структуре и своему биологическому действию некоторым пестицидам.

1.2 Условия и механизмы возникновения адаптации

Жизнь в водоеме, в отличие от наземных условий, характеризуется большей зависимостью гидробионтов от факторов среды. Поэтому водные экосистемы, сообщества, организмы особо чувствительны к нарушению химического состава среды. Проблемы, возникающие при изменении внешних условий, и потенциальные средства, с помощью которых данный организм может избежать вредных последствий этого изменения, непосредственно зависят от того, насколько быстро изменяется внешняя среда. Как правило, чем быстрее происходит изменение, тем сильнее будет его воздействие на организмы. Чем большим временем располагает организм для адаптации, тем более основательно он может перестроить свои фундаментальные биохимические механизмы.

При изучении изменений, происходящих в организме под влиянием совокупности экологических (природных и антропотехногенных) факторов, применяют термин «адаптация».

Под адаптацией понимают все виды врождённой и приобретённой приспособительной деятельности, которые обеспечиваются физиологическими реакциями, происходящими на клеточном, органном, системном и организменном уровнях. Адаптация тесно связана с эволюцией организмов и устойчиво адаптированными считаются те, которые приспособились к изменённым условиям, размножаются и дают в новой среде обитания жизнестойкое потомство. Существуют две принципиально различные формы адаптации: генотипическая и фенотипическая.

Генотипическая адаптация характеризуется, прежде всего, тем, что на основе наследственности, мутаций и естественного Отбора происходит формирование современных видов животных и растений. Генотипическая адаптация стала основой эволюции потому, что ее «достижения» закреплены генетически и передаются по наследству.

Следующей формой адаптации, приобретаемой в ходе индивидуального развития, является фенотипическая адаптация, формирующаяся в процессе взаимодействия особи с окружающей средой и обеспечивающаяся глубокими структурными изменениями организма. Фенотипическую адаптацию можно охарактеризовать как процесс, в результате которого организм приобретает отсутствовавшую ранее устойчивость к определенному фактору внешней среды и таким образом получает возможность жить в условиях, ранее не подходящих для обитания. При первой встрече с новым фактором среды в организме нет готового, вполне сформированного механизма, обеспечивающего современное приспособление. Имеются только генетически детерминированные предпосылки для формирования такого механизма.

Иными словами, генетическая программа организма предусматривает не заранее сформировавшуюся адаптацию, а возможность ее реализации под влиянием среды. Это обеспечивает реализацию только тех адаптационных реакций, которые жизненно необходимы. В связи с этим следует считать выгодным для сохранения вида тот факт, что результаты фенотипической адаптации не передаются по наследству. В быстро меняющейся среде следующее поколение каждого вида рискует встретиться с совершенно новыми условиями, в которых потребуется не специализированные реакции предков, а потенциальная, оставшаяся, до поры и времени неиспользованная возможность адаптации к широкому спектру факторов.

Различают три типа приспособительного поведения живых организмов в ответ на действие неблагоприятного раздражителя: бегство от неблагоприятного раздражителя, пассивное подчинение раздражителю либо активное противодействие за счёт развития специфических адаптивных реакций. Система жизнеобеспечения организма, наряду с механизмами поддержания равновесия внутренней среды (гомеостаз), представлена и генетическими программами развития, осуществление которых невозможно без постоянного изменения этой внутренней среды (гомеокинез), реализуемого посредством многообразных адаптивных процессов (реакций, механизмов, ответов и т.д.). Именно на поддержание генетических программ развития, являющихся ведущей движущей силой в живом организме, направлена деятельность систем репродуктивного, энергетического и адаптационного гомеостата [Григорьев, 2008].

Любой токсический фактор вызывает развитие стресса, который сопровождается закономерными фазными изменениями биохимических показателей организма. Динамика большинства биохимических процессов при стрессе проходит три основные закономерные фазы, описываемые S- образной адаптационной кривой Селье.

К настоящему времени накоплен достаточно большой материал о реакции различных биохимических показателей, а также о чувствительности ферментных систем на изменения тех или иных условий окружающей среды или на присутствие токсических факторов.

Селье назвал факторы, воздействие которых приводит к адаптации, стресс-факторами. Другое их название - экстремальные факторы. Экстремальными могут быть не только отдельные воздействия на организм, но и изменённые условия существования в целом. Всю сумму разнообразных воздействий на животных принято делить на две категории: летатьные и сублетальные. Воздействие летальных факторов несовместимо с жизнью, приспособление к ним невозможно. Жизнь при действии сублетальных факторов возможна за счет перестройки физиологически адаптивных механизмов, которыми располагает сам организм. При чрезмерной силе и длительности действия раздражителя сублетальный фактор может перейти в летальный.

По времени развития адаптация может быть срочной и долговременной. Срочная адаптация - немедленный ответ организма на действие внешнего фактора - осуществляется путем ухода от фактора (избегание) или мобилизацией функций, которые позволяют существовать, несмотря на действие фактора. Такого рода биохимическая адаптация происходит настолько быстро, что она не может быть связана с изменениями в экспрессии генов или со значительной перестройкой клеточных структур в результате биосинтетических процессов. Немедленная адаптация нередко осуществляется путем модуляции активности уже имеющихся ферментов. У целого ряда видов животных различных систематических групп (черви, моллюски, рыбы) наблюдаются колебания активности ферментов при токсическом воздействии на организм [Цветков, 2009; 2013]. Такая быстрая «подгонка» активности ферментов часто представляет собой лишь первую линию защиты организма от неблагоприятных воздействий окружающей среды. Со временем на смену этой реакции приходят изменения в экспрессии генов или - в ряду поколений - изменения на генетическом уровне.

Долговременная адаптация - это постепенно развивающийся ответ организма на многократное или длительное действие внешнего фактора. Она обеспечивает осуществление реакций, которые ранее были невозможны в условиях, несовместимых с жизнью [Григорьев, 2008].

Адаптация начинает развиваться на фоне активации неспецифического, а также специфического ответа на причинный фактор. В последующем формируются функциональные системы, позволяющие организму либо избежать действия раздражителя, либо преодолеть его неблагоприятное воздействие, либо обеспечивающие оптимальный уровень жизнедеятельности, несмотря на продолжающееся влияние этого агента.

Рассмотрение биохимической адаптации необходимо начать с анализа фундаментальных механизмов. Существует три типа адаптивных механизмов:

1. Приспособление макромолекулярных компонентов клеток организма. Существует два вида такого приспособления:

1) изменение концентрации уже имеющихся типов макромолекул, например, ферментов;

2) образование макромолекул новых типов, например, новых изозимов и аллозимов, которыми замещаются макромолекулы, ранее имевшиеся в клетке, но ставшие не вполне пригодными для работы в изменившихся условиях.

2. Приспособление микросреды, в которой функционируют макромолекулы. Сущность этого механизма состоит в том, что адаптивное изменение структурных и функциональных свойств макромолекул достигается путем видоизменения качественного или количественного состава окружающей их среды (например, ее осмотической концентрации или состава растворенных веществ). Этот механизм имеет исключительно большое значение и дополняет макромолекулярную адаптацию.

3. Приспособление на функциональном уровне, в том случае, когда изменение эффективности макромолекулярных систем, в особенности ферментов, не связано с изменением числа имеющихся в клетке макромолекул или их типов. Адаптацию в этом случае обеспечивает изменение в использовании уже существующих макромолекулярных систем в соответствии с текущими локальными потребностями в той или иной метаболической активности. Таким образом, из этих адаптаций складывается важное явление метаболической регуляции [Хочачка, 1988].

Если условия среды изменяются или организм переходит на новую стадию развития, возникают новые метаболические задачи, для решения которых могут понадобиться количественные и качественные преобразования ферментных систем, упоминавшиеся выше. Например, у эктотермного организма (температура тела которого в основном или даже полностью определяется температурой окружающей среды) при понижении внешней температуры может сильно понизиться общая интенсивность метаболизма и измениться регуляция ряда ключевых ферментов.

В определенной мере эти отклонения могут быть компенсированы повышением концентрации ферментов в клетке. Однако в некоторых случаях одного увеличения этих концентраций бывает недостаточно: может случиться так, что для восстановления адекватной каталитической и особенно регуляторной способности ферментов клетке потребуется синтезировать новые изозимы. К примеру, изучение молекулярных форм кислой фосфатазы в печени рыб при температурных адаптациях показало, что пониженная температура в среде обитания вызывает модификации спектра изоформ фермента. Так, у карпа адаптация к холоду приводит к перераспределению активности кислой фосфатазы между отдельными молекулярными формами в сторону увеличения активности низкомолекулярных гетероформ и заметному снижению активности высокомолекулярной формы.

Временные параметры биохимической адаптации варьируют в широких пределах - от длительных периодов, необходимых для эволюционного изменения аминокислотных последовательностей, до долей секунды, за которые может измениться активность уже присутствующих в клетке ферментов. Чем больше времени предоставляется для адаптивных изменений, тем больше выбор возможных стратегий.

В тех случаях, когда адаптивный процесс идет на протяжении многих поколений, популяция может использовать все стратегии приспособления. Мутации регуляторных генов приведут к изменению базальных концентраций ферментов и других молекул, т. е. к количественной макромолекулярной адаптации. Аминокислотные замены в белках обусловят появление новых изозимов, а в особых случаях - и ферментов совсем нового типа. Замены аминокислот могут облегчить выработку новых способов регуляции ферментативной активности, обеспечивающих более адекватную реакцию на сигналы, вызывающие изменения в скоростях метаболических процессов. При генетической адаптации могут также возникать совершенно новые молекулы, придающие организму способность к освоению новых местообитаний. Классическим примером такого рода адаптаций может служить появление гликопротеиновых и полипептидных «антифризов» у морских костистых рыб, живущих в высоких широтах, благодаря чему эти рыбы (в отличие от других костистых рыб) могут существовать в условиях пониженных температур.

Таким образом, организм располагает способами адаптации разной степени сложности, которые позволяют ему успешно приспосабливаться к изменениям окружающей среды.

1.3 Биохимическая адаптация

Молекулярно-биохимические факторы адаптации. Металлотионеины и стресс-белки.

Исследования, направленные на изучение накопительной способности пресноводных моллюсков, показали, что моллюски обладают определёнными механизмами детоксикации, которые служат для ограничения или устранения токсического вещества организма. Следует отметить, что во избежание повреждения клеточных структур при попадании в организм моллюсков тяжёлых металлов активизируются транспортные системы, которые способствуют перераспределению металла таким образом, что через короткое время большая часть металла оказывается связанной со специфическими белками металлотионеинами.

Связывание тяжелых металлов в различные бионеорганические комплексы происходит мгновенно при введении металлов в организм любым способом и в любой концентрации. По данным исследований, связывание ТМ с МТн в прочные комплексы происходит в основном в гепатоцитах. Это связывание помогает снизить гепатотоксическое действие ТМ.

Природная функциональная роль MTн заключается в гомеостазе цинкa и токсичных ТМ, а также МТн играет сигнальную и регулирующую роль. MTн также может участвовать в модуляции иммунных реакций. Эндогенный MTн способен модулировать иммунную реакцию in vivo, а внутриклеточный MTн модулирует иммунную функцию регулированием активности фактора транскрипции. Эти закономерности наблюдаются не только у животных разной степени сложности (от дафний и дрозофил до млекопитающих и человека), но даже у растений [Пыхтеева, 2009].

Пространственные структуры МТн млекопитающих, МТн ракообразных были получены методами двумерной ЯМР-спектроскопии и рентгеновской кристаллографии. Несмотря на то, что аминокислотные последовательности МТн разных видов различны, они имеют сходные пространственные структуры. МТн имеют гантелеподобную форму с двумя отдельными белковыми доменами, с основными узлами, созданными несколькими тетраэдрическими Me(II)Cys единицами. Все Cys включаются в связывание металлов. МТн не содержат почти никаких правильных элементов вторичной структуры [Пыхтеева, 2009].

Основная активность металлотионеинов в клетках направлена на то, чтобы в ответ на высокое содержание токсичных металлов произвести защитную реакцию. В случае пониженной концентрации катиона металла или его полном отсутствии синтез защитных белков не усиливается.

В основном осуществляется синтез металлотионеинов Сd, Zn, Cu, Hg, Au, Ag, Co, Ni, Pb, однако существенно различается количество защитных белков, образовавшихся в ответ на разные группы металлов. Некоторые металлы не вызывают образования защитных белков, например, Ca, Al, Na, Mg, U. Индуцировать синтез металлотионеинов могут не только тяжелые металлы, но и другие стресс-факторы, например: клеточное голодание, различные инфекции, повышенное содержание активных форм кислорода, воздействие проникающей радиации и химические соединения, в том числе и вещества, обладающие биологической активностью [Стручкова, 2011].

При продолжающемся поступлении металлов в ткани происходит их фиксация на неподвижных белковых образованиях в тканях паренхимы или внешних покровов.

В животном организме помимо металлотионеинов существует множество белков, индукция экспрессии которых происходит в стрессовом состоянии, обычно именуемых белками теплового шока (БТШ) или heat shock proteins (HSP). В дальнейшем их стали называть молекулярными шаперонами (цит. по [Цветков, 2013]).

Белки теплового шока образуются в клетках в ответ на действие температурного стресс-фактора, в том случае, когда подавлена экспрессия основного пула белков, участвующих в нормальном метаболизме.

Различают три главных семейства БТШ, отличающихся значениями молекулярных масс - 25, 70 и 90 кДа (hsp25, hsp70 и hsp90). Белки каждого из этих семейств широко распространены в здоровых клетках организма и способны денатурированные и неправильно свернутые белки переводить в раствор и сворачивать обратно правильным способом.

Так, при исследовании стрессового воздействия температурного и токсического факторов на амфипод было выявлено, что экспозиция амфипод при повышенной температуре вызывает многократное увеличение содержания нмБТШ даже у тех видов, у которых отсутствует конститутивный синтез нмБТШ.

Экспонирование амфипод в растворах CdCl2 различной концентрации также вызывает увеличение содержания нмБТШ, при этом максимальное количество исследуемого нмБТШ наблюдали в растворах с наибольшей концентрацией токсиканта, минимальное - с наименьшей [Шатилина, 2010].

К БТШ с молекулярной массой 70 кДа (БТШ-70 эукариот и DnaK прокариот) относятся белки, играющие важную роль как в выживании клетки в условиях стресса, так и при нормальном метаболизме. Уровень гомологии семейств данных белков при полном сходстве отдельных доменов у про- и эукариот, превышает 50%. 70 кДа БТШ являются одной из самых консервативных групп белков в природе, что скорее всего обусловлено шаперонными функциями, которые данные стресс-белки выполняют в клетках. К семейству стрессорных белков с молекулярной массой около 70 кДа принадлежат как конститутивные белки, постоянно присутствующие в клетках, так и индуцибельные белки, синтезируемые при стрессорных воздействиях. Так, в жабрах моллюсков Mutilus edulis выявлен конститутивный белок теплового шока Hsp70. При изменении солености воды уровень Hsp70 в клетках жаберного эпителия мидий повышается по сравнению с контролем (цит. по [Цветков, 2013]).

Белки теплового шока кодируются семейством эволюционно устойчивых генов, которые способны подвергаться экспрессии в ответ стрессовые воздействия окружающей среды и участвовать в процессах адаптации. БТШ вовлечены в большинство физиологических процессов всех живых организмов и являются компонентами единого сигнального механизма. Стресс-белки в комплексе с растущей полипептидной цепью, предотвращают ее неспецифическую агрегацию и деградацию от действия внутриклеточных протеиназ, способствуя правильному фолдингу белков, происходящему с участием других шаперонов. Hsp70 принимает участие в ATФ-зависимом разворачивании полипептидных цепей, делая неполярные участки полипептидных цепей доступными действию протеолитических ферментов.

Ферментативная детоксикация ксенобиотиков/

Для преобразования многих органических токсичных веществ в тканях и клетках организмов формируются неспецифические биохимические механизмы. Однако превращение большинства соединений, особенно - на первых этапах интоксикации - осуществляется с участием ферментов нормального метаболизма. Детоксикация обеспечивается прохождением реакций окисления, восстановления, гидролиза, в результате чего оказываются связанными или разрушенными химически активные группы чужеродных молекул, и повышается их полярность [Филенко, 2007].

Метаболизм ксенобиотиков проходит в две фазы. В ходе первой фазы к молекуле поллютанта либо присоединяются полярные функциональные группы, либо осуществляется экспрессия таких групп, находящихся в субстрате в скрытой форме. Это может достигаться за счет ферментативных окислительно-восстановительных или гидролитических реакций, в ходе которых молекула становится более реакционноспособной и гидрофильной. Во второй фазе происходят процессы биологической конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами (глутатион, глюкуроновая кислота, сульфат и т. д.), в результате чего липофильный и, следовательно, трудно выводимый ксенобиотик становится гидрофильным продуктом, что обусловливает возможность его быстрой экскреции. Механизм реакций конъюгации предусматривает обязательное участие в этих процессах макроэргов - соединений, богатых энергией. Значительная часть этих реакций протекает на мембранах эндоплазматической сети клеток, непосредственно в месте образования высокореактивных метаболитов при действии оксидаз со смешанными функциями (цит. по [Цветков, Коничев, 2013]).

Классическим примером биотрансформации ксенобиотиков является метаболизм бензола в организме. В ходе l-й фазы метаболизма липофильный субстрат превращается в полярный продукт путем включения в молекулу гидроксильной группы. В ходе 2-й фазы фенол взаимодействует с эндогенным сульфатом, в результате полярность образующегося продукта еще более возрастает, и водорастворимый фенилсульфат легко выводится из организма.

Среди реакций микросомального окисления особым вниманием пользуются реакции гидроксилирования с участием кислорода, НАДФН и кислородактивирующего компонента микросомальных оксидаз смешанного действия - цитохрома Р450.

Цитохром Р450 является важнейшим компонентом микросомальной монооксигеназной системы, ответственным за активацию молекулярного кислорода и связывание субстрата. Помимо цитохрома Р450 в состав этой системы входят НАДФН-цитохром Р450-редуктаза, цитохром b5 и НАДН- цитохром b5-редуктаза.

Микросомальная фракция печени рыб имеет активную систему гидроксилазы арильных углеводородов нефти. Существование такой системы у организмов зоопланктона не доказано. Полагают, что единственным процессом детоксикации арильных углеводородов у организмов зоопланктона является их выведение. Вместе с тем у ракообразных проявляется оксигеназная активность против нафталина, являющегося компонентом нефти, хотя и менее активная, чем у рыб и млекопитающих.

Изоферменты.

К биохимическим тест-системам, пригодным для оценки окружающей среды относятся, прежде всего, ферменты, как универсальные катализаторы и регуляторы обменных процессов в живой природе. Именно с регуляции метаболических процессов формируются первичные адаптивные реакции организма.

В настоящее время имеются указания на дифференциальную изменчивость белков и ферментов. Показано, что ферменты с широкой субстратной специфичностью, использующие в качестве субстратов вещества, поступающие в клетку извне, приблизительно вдвое более вариабельны, чем ферменты, использующие в качестве субстратов внутриклеточные метаболиты.

Таким образом, становится возможным использование изоферментов при изучении генетической структуры популяций. Генетические различия между популяциями для многих видов рыб были продемонстрированы с использованием изоферментов.

Согласно гипотезе Ю.П. Алтухова и Ю.Г. Рычкова, мономорфные биохимические признаки связаны с жизненно важными функциями, остающимися неизменными в меняющейся среде благодаря выработке структурной множественности родственных белковых компонентов, ответственных за реализацию этих функций, и благодаря системам генетического полиморфизма, обеспечивающим широкую адаптацию.

Применение множественных форм ферментов открыло новые возможности для геногеографии. В настоящее время определение типов географической изменчивости аллельных частот является одним из применений изоферментов в качестве генетических маркеров в эволюционной биологии. Факты постепенного изменения в том или ином направлении аллельных частот на ареале вида сразу же привлекли внимание исследователей. Вероятно, географический градиент частот связан с изменениями факторов среды. На эту тему было проведено много специальных исследований, особенно на рыбах.

Один из первых и принципиально важных примеров был обнаружен при изучении эстеразы сыворотки крови у пресноводной рыбы чукучана Catostomus clarkii. Эстеразный локус был представлен в популяциях этого вида двумя аллелями: один из них более часто встречался в южных популяциях, а другой в северных. Было высказано предположение, подтвердившееся позднее, что температура среды может быть существенным компонентом отбора, действующего через гетерозис по этому локусу.

В лабораторных условиях был проведено исследование выживаемости Drosophila melanogaster с генотипическими различиями по локусу алкогольдегидрогеназы при холодовом и тепловом шоке. В условиях опыта с тепловым шоком смертность достигала 90%, при этом она носила дифференциальный характер, так как происходил сдвиг аллельных частот в сторону того аллеля, который чаще наблюдается в части ареала с более высокой температурой. Сходные результаты были получены при изучении температурных воздействий на разные генотипические классы по локусу лактатдегидрогеназы Anoplarchus purpurescens (цит. по [Цветков, 2013]).

Косвенным свидетельством адаптивной природы биохимического полиморфизма является также дифференциальная изменчивость локусов, контролирующих ферменты с различными физиологическими функциями. Тот факт, что ферменты, катализирующие реакции в различных метаболических путях (например, в утилизации глюкозы), в среднем значительно менее полиморфны, чем ферменты с широкой субстратной специфичностью, объясняется тем, что для ферментов первой группы характерны субстраты, образующиеся в серии последовательных реакций и постоянные по своему составу, тогда как для второй группы субстраты (спирты, эфиры) поступают в основном из окружающей среды, и, следовательно, ферменты, использующие их, должны быть более гетерогенны. Таким образом, более высокая степень изменчивости ферментов с широкой субстратной специфичностью может рассматриваться как прямая адаптация к изменениям в условиях среды.

1.4 Молекулярно-генетический уровень адаптации

Особенности организации генома эукариот/

Геном эукариот по ряду признаков значительно отличается от генома прокариот, наиболее важным из которых является его избыточность. В эукариотической клетке содержится гораздо больше генов, чем в прокариотической. Объяснить повышенное содержание ДНК в эукариотическом геноме только лишь потребностью в дополнительной генетической информации вследствие усложнения организации нельзя, потому что большая часть его геномной ДНК в основном представлено некодирующими последовательностями, не несущими наследственной информации о белках и РНК. Несоответствие между размером генома и фенотипической сложностью организма, который им обладает, получило название «парадокса C».

Несмотря на то, что суммарный размер генома эукариот не зависит от их фенотипической сложности, эволюционный переход от прокариот к эукариотам сопровождался увеличением общего количества генов в их геномах. При этом большие различия в фенотипической сложности высших эукариот, имеющих приблизительно одинаковое число генов, примерно равное 104 («парадокс N»), в настоящее время пытаются объяснить уникальной комбинаторикой объединения универсальных экзонов их генов (и доменов белков) в филогенезе и во время экспрессии генов. Для геномов эукариот характерно наличие разнообразных типов повторяющихся нуклеотидных последовательностей. К ним относятся часто повторяющиеся, умеренно повторяющиеся и уникальные.

Часто повторяющиеся последовательности (сателлиты). Сателлитные НП, содержание которых в геноме эукариот может достигать 5- 50% от суммарного количества ДНК, представляют собой очень длинные (в несколько сотен т.п.н.) участки ДНК с тандемно («голова к хвосту») повторяющимися короткими блоками (5-200 п.н.).

Высокополиморфные ДНК, в состав которых входят тандемные повторы размером 1-4 п.н., называемые микросателлитами, организованы в блоки до 200 п.н. и встречаются в различных частях генома. Гомополимерные микросателлиты типа (A)n/(T)n, представляющие собой остатки ретротранспозонов, часто присутствуют в геномах животных. Напротив, гомополимеры типа (G)n/(C)n у животных крайне редки. В геноме животных достаточно часто встрчаются динуклеотидные минисателлиты типа CA/GT или CT/GA, в среднем, через каждые 20-50 т.п.н. Довольно редко в геномах животных распространены три- и тетрануклеотидные микросателлиты. Длина микросателлитов и их общее количество в геноме зависит от его размера у различных классов живых организмов.

Сателлитные ДНК размером 5-50 п.н. называются минисателлитами, они образуют блоки промежуточных размеров до 104 п.н. Макросателлитные нуклеотидные последовательности ДНК отличаются большим размером повторяющейся единицы (более 1000 п.н.). Они обнаружены, в частности, в W-хромосомах птиц, в геноме кошек и человека [Патрушев, 2007]

Умеренно повторяющиеся последовательности. Умеренно повторяющиеся некодирующие последовательности (НП) в геноме эукариот представлены генными семействами и мобильными генетическими элементами (транспозонами). Известно, что нативные транспозоны содержат конкретные гены, способные обеспечивать их сохранение в геноме. Деление умеренно повторяющихся НП на две вышеупомянутые группы довольно условно в связи с тем, что их функциональная значимость для эукариотического генома не достаточно изучена.

Мобильные генетические элементы представляющие собой НП ДНК, способные изменять свою локализацию в геноме, то есть совершать акты транспозиции. Хотя официально признанная классификация транспозонов в настоящее время отсутствует, на основании молекулярных механизмов, используемых мобильными генетическими элементами для перемещения в геноме, их разделяют на ретроэлементы и ДНК-транспозоны.

ДНК-транспозоны типичны для генома бактерий и достаточно широко представлены в геномах эукариот. Их транспозиция осуществляется, как правило, по механизму вырезания и вставки с участием транспозазы - хорошо изученного фермента класса рекомбиназ. При этом новое место интеграции мобильного элемента, как правило, находится недалеко от старого, и, в соответствии с этим, процесс перемещения ДНК-транспозонов получил название «локальных прыжков» [Патрушев, 2007].

Ретроэлементы, в отличие от ДНК-транспозонов, используют для своей мобилизации механизмы, в которых важную роль играет обратная транскрипция - синтез ДНК на матрице РНК обратной транскриптазой. Следует подчеркнуть, что в результате каждого акта транспозиции ретроэлемента его исходная НП остается в геноме на старом месте, а соответствующая копия появляется в новом генетическом локусе. Таким образом, количество копий транспозона в геноме удваивается. Это является одним из мощных механизмов увеличения размера эукариотического генома, что имеет особо важное отношение к основной обсуждаемой проблеме.

Уникальные последовательности. Содержание уникальных последовательностей в геноме, определенное на основании кинетики реассоциации фрагментированной ДНК, варьирует у разных организмов, и их доля составляет 15-98% от всей ДНК. Несмотря на то, что во фракцию уникальных последовательностей попадают многие структурные гены, большая часть уникальных последовательностей является некодирующей и обычно не заключает в себе генетической информации в общепринятом значении этого термина: не кодирует функционально значимые полипептидные цепи или РНК [Патрушев, 2007].

Хорошо известным примером уникальных нуклеотидных последовательностей (НП) являются интроны, общий размер которых, как правило, превышает суммарный размер экзонов соответствующих генов. Интроном называют транскрибируемый участок гена, последовательность которого отсутствует в зрелой РНК и удаляется из предшественника РНК разными механизмами. Зрелая РНК составлена последовательностями экзонов гена. Мозаичная экзон-интронная структура генов обнаружена у представителей большинства таксономических групп современных биологических видов. Интроны присутствуют в ядерных генах, кодирующих мРНК, рРНК (правда, пока они обнаружены только в генах высокомолекулярных рРНК низших эукариот) и отдельные типы тРНК.

Прерывистые гены часто встречаются в генах хлоропластов и митохондрий, которые кодируют информационные, рибосомные и транспортные РНК этих органелл. В то же время среди генов млекопитающих, которые почти всегда содержат интроны, встречаются исключения. Так, в большинстве генов, кодирующих пять гистонов, интроны отсутствуют; это же относится и к генам двух семейств, кодирующим ?- и Р-интерфероны. Напротив, единственный ген 7-интерферона содержит множество интронов. Не обнаружены интроны в генах 5,8S- и 5S-pPHK, а также ни в одном из генов U-PHK, 7SL-PHK и 7SK-PHK.

Мутационный процесс и молекулярные основы эволюции.

В зависимости от причин, вызывающих мутации, их принято разделять на спонтанные и индуцированные. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении жизни организма в нормальных для него условиях существования. Индуцированные же мутации появляются в результате тех или иных мутагенных воздействий окружающей геном среды или в экспериментальных условиях под действием различных мутагенных факторов [Maki, 2002].

Эндогенный мутагенез, обусловленный внутренними причинами, лежит в основе возникновения спонтанных мутаций. В результате повреждения ДНК или включения в ее цепь неправильного нуклеотида возникает премутация, которая по завершении репликации превращается в мутацию, если система репарации не справляется с возникшей проблемой. При этом количество возникающих в геноме мутаций прямо пропорционально количеству предшествующих премутаций, т.е. в конечном счете количеству возникающих повреждений ДНК [Maki, 2002].

Выявлены три основных причины спонтанного возникновения премутаций. Во-первых, молекулы ДНК in vivo характеризуются химической нестабильностью. При нейтральных значениях pH и нормальной температуре происходит гидролитическая депуринизация цепей ДНК с образованием апуриновых (AP-) сайтов и последующим разрывом фосфодиэфирных связей, дезаминирование остатков С и 5-mC с образованием U и T, соответственно и т.п.

В качестве второй причины необходимо отметить ошибки синтеза ДНК in vivo. При репликации хромосомной ДНК происходит ошибочное включение нуклеотидов, некомплементарных матричной цепи ДНК с частотой 10-7-10-8. Кроме того, во время репликации иногда имеет место проскальзывание 3?- конца растущей цепи ДНК вдоль матрицы, что может приводить к мутациям со сдвигом рамок считывания. Наконец, способность к перемене матрицы ДНК-полимеразой во время синтеза ДНК, то есть к переходу молекулы ДНК- полимеразы с одной матричной ДНК на другую без терминации синтеза ДНК, открывает путь к одновременной замене большого числа нуклеотидов [Maki, 2002].

В-третьих, в процессе нормальной жизнедеятельности эукариотических клеток образуются многочисленные эндогенные мутагены, которые после взаимодействия с ДНК повреждают нуклеотиды, что в ряде случаев может изменить ее кодирующий потенциал. Еще более часто возникают аддукты эндогенных мутагенов с нуклеотидами-предшественниками ДНК внутриклеточного пула, которые могут включаться в ДНК и изменять ее структуру [Патрушев, 2007].

В условиях нормальной жизнедеятельности организма эндогенные химические мутагены вносят основной вклад в спонтанный мутагенез. Во многих биохимических реакциях в качестве промежуточных и побочных продуктов образуются реакционно-способные метаболиты, способные взаимодействовать с ДНК. В частности, в реакциях окисления-восстановления субстратов с участием кислорода постоянно образуются свободные радикалы, которые повреждают молекулы геномной ДНК . Действие свободных радикалов на ДНК является одной из причин возникновения многочисленных модифицированных азотистых оснований, удаление которых ДНК- гликозилазами приводит к образованию апуриновых (AP) сайтов и, как следствие, одно- и двухцепочечных разрывов ДНК. Обычно, в отсутствие репарации, AP-сайты приводят к заменам нуклеотидов (AP-сайт > T), а также могут быть источником мутаций со сдвигом рамки считывания и других мутаций [Патрушев, 2007].

Существенный вклад в эндогенный мутагенез вносят эндогенные алкилирующие агенты: S-аденозилметионин (SAM), бетаин и холин. Так, предполагается, что SAM в течение суток может генерировать в каждой клетке животных образование ~4000 молекул 7-метилгуанина, 600 молекул 3- метиладенина и 10-30 молекул O6-метилгуанина. Большое число эндогенных повреждений ДНК, в том числе и AP-сайты, образующиеся под действием ДНК-гликозилаз, блокируют перемещение репликативной вилки вдоль ДНК. В этом случае синтез ДНК через поврежденный участок осуществляют специализированные ДНК-полимеразы, которые включают в строящуюся цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды с образованием премутаций [Патрушев, 2007].

Еще одним эндогенным фактором, который может вносить заметный вклад в эндогенный мутагенез у эукариотических организмов, являются мобильные генетические элементы. Образованием мутаций завершается инсерционный мутагенез, связанный с мобилизацией транспозонов, после их транспозиции в кодирующие участки генома. Так, до 10% всех спонтанных мутаций у мышей вызвано инсерциями ретроэлементов [Патрушев, 2007].

Кроме вышеперечисленных эндогенных биохимических факторов постоянными источниками мутагенов и их предшественников являются экологическая обстановка, а также жизненные привычки организмов, включая особенности питания. В частности, электромагнитное ионизирующее излучение является одной из причин образования свободных радикалов в организме, которые повреждают нуклеотиды ДНК.

Индуцированные мутации возникают под действием мутагенов; образовавшиеся клетки называют индуцированными мутантами. Мутагенами могут быть химические агенты (нитриты, алкилируюшие агенты, акридиновые красители, этиленимин, азотистый или серный иприт и т.д.), физические (ультрафиолетовые лучи - 260 нм, ионизирующее излучение) или биологические (бактериофаги). Под действием мутагена частота мутаций увеличивается и составляет 1/105-1/103.

Молекулярно-генетический полиморфизм в популяциях.

Согласно синтетической теории эволюции, элементарное эволюционное явление начинается с изменения генетического состава (генетической конституции, или генофонда) популяции. К процессам, способствующим преодолению генетической инертности популяций и приводящим к изменению их генофондов, относят мутационный процесс, популяционные волны, изоляцию, естественный отбор. По этой же причине, популяции, обитающие в контрастных условиях, будут различаться между собой на молекулярном уровне, даже если они будут незначительно удалены друг от друга [Цветков, 2011; 2013; Дроганов, 2014].

Под термином «молекулярный полиморфизм» понимают совокупность индивидуальных особенностей первичной структуры геномной ДНК, накопленная в результате мутаций и рекомбинации. Практически сразу после выявления молекулярного полиморфизма отдельных особей животных, его стали рассматривать как признак, по которому можно производить идентификацию видов, внутривидовых групп и характеризовать крупные таксоны, таких как род и семейство [Цветков, 2011; 2013; Дроганов, 2014].

Наиболее распространенными маркерами молекулярного полиморфизма долгое время являлись случайно амплифицированные с помощью ПЦР фрагменты ДНК (англ. RAPD - random amplified polymorphic DNA). Достоинством этого типа молекулярных маркеров является то, что их можно получить, не имея никакой информации о первичной структуре исследуемой ДНК, тем более что в 80-х годах прошлого века, когда RAPD стал использоваться для молекулярной дифференциации родственных генотипов, такой информации было чрезвычайно мало. Ее и сейчас не всегда достаточно, например, для молекулярной систематики и филогении редких и малоизученных видов животных, поэтому технология RAPD применяется до сих пор. Однако сложности, связанные со стандартизацией процедуры RAPD и ее воспроизведением, постепенно уводят RAPD-маркеры на второй план. И естественно, что на первый выходят другие, основанные на определенных знаниях о последовательности ДНК-маркеров, к которым относятся полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (англ. ISSR inter-simple sequence repeat), полиморфизм рестрикционных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP - restriction fragment length polymorphism) и секвенирование определенных последовательностей ДНК, чаще всего полиморфных генов и их гомологов [Цветков, 2013].