Микротрубочки предстали как особые внутриклеточные структуры (особенно внутри жгутика) благодаря применению методов электронной микроскопии. В 1946 г. Джакус и Холл продемонстрировали наличие одинаковых по диаметру трубчатых структур в ресничках Paramecium. Впоследствии трубчатые структуры обнаружили почти во всех клетках. Стали считать, что они характерны для эукариотичсского уровня организации. Однако микротубулярные структуры были обнаружены и у прокариот -- в цитоплазме спирохет. Морфологически и биохимически эти микротрубочки подобны тем, которые наблюдаются в эукариотических клетках. Это открытие поддержало «экзогенную гипотезу» происхождения микротрубочек эукариот, согласно которой реснички и жгутики клеток высших организмов считаются приобретенными извне--путем симбиоза клеток, ранее не имевших жгутиков или ресничек, со спирохетами, содержавшими микротрубочки.

Микротрубочки представляют собой длинные полые цилиндры, наружный диаметр которых около 24 нм, а внутренний--15 нм. В большинстве клеток длина трубочек обычно не превышает нескольких микрон, хотя в некоторых специализированных клетках, например в моторных нейронах центральной нервной системы, трубочки могут быть длиной в несколько сантиметров. Стенка микротрубочки (около 5 нм толщиной) построена из продольно ориентированных протофибрилл. Протофибриллы состоят из глобулярных субъединиц (их очень хорошо видно в электронный микроскоп при негативном окрашивании), содержащих только один белок - тубулин (рис. 5). Помимо того, что микротрубочки имеют прямое отношение к подвижности клетки, они участвуют и в других процессах, более или менее связанных с подвижностью, например в поддержании формы клетки, во внутриклеточном транспорте веществ, в секреции клеточных продуктов, в движении хромосом при делении клетки и, возможно, в осуществлении сенсорных связей, а также в перемещении компонентов клеточной мембраны. Микротрубочки могут быть рассеяны по всей цитоплазме, а могут быть собраны в организованные структуры.

Рисунок 5. «Электронные, микрофотографии микротрубочек в краевых областях эритроцитов тритона»: а -- продольный срез, на котором: видна линейная упаковка субъединиц в микротрубочках; б--поперечный срез; видно, что стенка каждой микротрубочки образована тринадцатью субъединицами. Негативное окрашивание. Ч200 000.

Чтобы понять, как клетка движется с помощью микротрубочек, мы рассмотрим их организацию в ресничках жгутиках эукариотических клеток, в сократимом аксостиле некоторых жгутиконосцев, а также в микротубулярной сети цитоплазмы животных клеток.

4.1.1 Микротрубочки в ресничках и жгутиках

Эукариотические реснички и жгутики представляют собой специализированные структуры, выступающие за пределы клеточной поверхности и способные двигаться. Эти два типа органелл идентичны по своей структуре; в функциональном отношении между ними обнаруживаются лишь незначительные, различия; Жгутики и реснички удается легко и в довольно больших количествах отделить от клеток, иногда просто энергичным встряхиванием клеточной суспензии. Это облегчило исследование их структуры и химического состава.

Структурная организация ресничек и жгутиков практически во всех исследовавшихся клетках отличается удивительным единообразием: центральную пару микротрубочек окружает кольцо из микротрубочек (обычно парных). Микротрубочки связаны между собой поперечными мостиками; вся конструкция называется аксонемой жгутика. Расположение микротрубочек и мостиков в аксонеме изучено в настоящее время довольно подробно; оно схематически представлено на рис. 6. В центре находится пара микротрубочек, окруженных общей оболочкой из белковых колец, плоскость которых наклонена к оси аксонемы. Стенка каждой из центральных микротрубочек образована тринадцатью продольными рядами (протофибриллами) белковых субъединиц. Эту центральную структуру, окружают девять расположенных по кольцу пар микротрубочек. В каждом дублете одна микротрубочка (основная или А) имеет полностью замкнутую стенку, состоящую из 13 протофибрилл (рис. 7); другая микротрубочка (микротрубочка В) имеет серповидное сечение и примыкает к микротрубочке А, так что ее стенка состоит из меньшего числа протофибрилл, обычно из 10. Каждая микротрубочка А соединена с микротрубочкой В соседнего дублета с помощью мостика из белка, называемого нексином. От обращенной внутрь поверхности микротрубочки А отходит по направлению к центру белковый выступ -- так называемая радиальная спица. Вдобавок каждая микротрубочка А имеет двойной ряд боковых ручек (их длина около 14 нм), построенных из белка (динеина) и направленных к соседнему дублету. Все эти выступы расположены с определенной периодичностью относительно оси микротрубочки А и, как будет видно из дальнейшего, играют очень важную роль в генерации движения. Описанное выше строение аксонемы соответствует всей средней части жгутика, т. е. за исключением его концевой части и основания, где аксонема устроена несколько иначе. На самом конце центральная пара микротрубочек обычно длиннее, чем окружающие ее периферические дублеты, так что жгутик на конце заострен. Нередко микротрубочки В бывают короче микротрубочек А, и периферические дублеты вблизи конца жгутика переходят в одиночные трубочки (рис. 6). На одиночных микротрубочках А в этой области жгутика выступов нет.

Рисунок 6. «Схематическое изображение аксонемы жгутика». Показана взаимосвязь между элементами структуры на разных уровнях: а -- на конце жгутика, б -- в средней части и в -- на уровне базального тела.

Рисунок 7. «Схематическое изображение расположения тубулиновых субъединиц в микротрубочке»: а -- поперечный срез; б -- вид сбоку.

Специализированная структура -- базальное тело, -- из которой исходит жгутик, находится в цитоплазме клетки у основания жгутика. Она может быть различна в клетках разных типов, однако при этом основные, общие черты сохраняются. В базальном теле ресничек Tetrahymena piriformis наряду с микротрубочками А и В имеются еще микротрубочки С (они образованы десятью протофибриллами), так что по периферии реснички располагаются не дублеты, а триплеты микротрубочек, Эти триплеты связаны между собой боковыми выступами (поперечными мостиками) и прикреплены к центральному кольцу радиальными спицами (рис. 6). Базальное тело реснички или жгутика по своей структуре, похоже на центриоль животных клеток. И базальное тело, и центриоль действуют как организаторы ассоциации микротрубочек; в первом случае/образуется ресничка или жгутик, во втором -- мнтотическое веретено.

Еще одна интересная часть жгутика -- это так называемый воротничок, кольцевой валик, окружающий основание жгутика там, где он выходит из клетки. В электронный микроскоп па поперечных срезах воротничка в этой области видны волокнистые соединения между периферическими дублетами жгутика и внутренними слоями клеточной мембраны. Они жестко закрепляют микротрубочки в клеточной мембране и участвуют в движении жгутика.

Подвижность ресничек и жгутиков обусловлена свойствами именно аксонемы, но не других компонентов этих органелл (т. е. клеточной мембраны, цитоплазмы и др.).

4.1.2 Самосборка микротрубочек и ее регуляция

Актин широко распространен во всех эукариотических клетках. Его можно обнаружить как в растворимой мономерной форме, так и в полимерной -- в виде филаментов. В некоторых активно передвигающихся клетках (амебы, макрофаги, тромбоциты) актин преобладает среди белков клеточного экстракта: его содержание может достигать 20--30% от общего белка, В менее подвижных клетках содержание актина заметно меньше--1--2% от общего белка. Однако если вспомнить, что в эукариотической клетке одновременно присутствуют многие, тысячи различных белков, то такое небольшое количество весьма существенно.

Благодаря относительно высокому его содержанию актин удается выделить из клеточных систем. Более акриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Выявились три основных полипептида, один из которых соответствует актину. Два других белка (мол. массы 230 000 и 250000), по-видимому, ответственны за I поддержание актина в неполимеризованном состоянии. Обработка протеолитическим ферментом (трипсином) позволяет отделить мономерный актин от высокомолекулярных белков. Акросомальную реакцию у сперматозоидов Thyone можно вызвать различными актива- I торами; повышение, внутреннего рН освобождает актин от связанных с ним белков, делая тем самым возможной полимеризацию. Процесс полимеризации инициирует 1 специфическая структура, которую можно увидеть на дне акросомальной чаши и которая называется актомером. Она представляет собой пучок из примерно 25 коротких микрофиламентов, заключенный в плотное аморфное вещество. В момент активации актомер начинает действовать как ядро полимеризации, из которого вырастают микрофиламенты.

Па основании этих и других данных высказано предположение, что полимеризацией и ростом микрофиламентов управляют какие-то организующие центры, подобно тому, как центр, управляющий жгутиковым синтезом, регулирует сборку микротрубочек.

Специфические точки роста актиновых филаментов обнаружены в семенных клетках Mitylus и Limulus, a также при формировании кишечных ворсинок; вполне возможно, что они есть и во многих других объектах. Действительно, в немышечных клетках часто видно, что микрофиламенты прикреплены к определенным точкам клеточной мембраны, однако пока неясно, управляют ли эти точки сборкой микрофиламентов или же прикрепление к ним происходит уже после.

Рисунок 10. «Пучки актиновых микрофиламентов в клетках культуры ткани, окрашенных флуоресцирующими антителами Ядра - фиолетовые».

4.3 Микротрубочки, микрофиламенты и клеточные мембраны

Есть основания считать цитоплазматические микротрубочки и микрофиламенты тесно взаимосвязанными структурами одной и той же системы. Они играют сходную роль в генерации движения, встречаются в одних и тех же клетках в роли опорных структур, ведут себя сходным образом в зависимости от фазы клеточного цикла и образуют морфологически похожие структуры. К сожалению, приходится отметить, что, несмотря на приведенные выше соображения, у нас нет прямых доказательств взаимосвязи между микротрубочками и микрофиламентами. Многие данные, полученные различными методами, косвенно, но с большой вероятностью указывают на то, что между этими двумя системами есть связь, так что почти все признают, что такая связь на самом деле существует.

Например, с морфологической точки зрения исследовали распределение в клетке микротрубочек и микрофиламентов, особенно в процессе митоза. Фудживара и Поллард с помощью антител к тубулину, меченных флуоресцеином, и антител к миозину, меченных родамином, сравнили распределение микротрубочек и микрофиламентов в одной и той же клетке. В полностью распластанных клетках они не обнаружили морфологических связей между этими двумя типами волокон. Однако в митотическом веретене обусловленная миозином флуоресценция так сочеталась с флуоресценцией микротрубочек, что это указывало на тесную взаимосвязь между микрофиламентами и микротрубочками.

Более косвенные данные получены в опытах с ингибиторами микротубулярных структур (колхицин или его производное колцемид) и ингибиторами микрофиламентов (цитохалазин В). В качестве примера такого подхода мы рассмотрим влияние ингибиторов микротрубочек и микрофиламентов на явление образования «шапки» (capping), наблюдаемое в клетках млекопитающих. Реакция образования «шапки» возникает после обработки клетки бивалентными антителами или другими лигандами, способными взаимодействовать с белками на клеточной мембране. Она заключается в том, что связываемые молекулы лиганда скапливаются на ограниченном участке клеточной поверхности, образуя как бы шапку. Образование такой шапки угнетается цитохалазином-В, откуда следует, что микрофиламенты играют активную роль в перемещении молекул в мембране клетки. Во многих системах угнетение образования шапки удается снять колхицином или другими веществами, вызывающими деполимеризацию микротрубочек. Если разрушить и микротрубочки, и микрофиламенты комбинированным действием колхицина и цитохалазина-В, образовавшаяся шапка, которая обычно довольно стабильна, распадается, так что молекулы, из которых она состояла, распределяются по всей поверхности клетки. Эти результаты указывают на то, что и микротрубочки, и микрофиламенты участвуют в регуляции перемещения молекул в клеточной мембране: микрофиламенты проявляют сократительную активность, а микротрубочки служат для них опорой. Можно также предполагать, что для латерального перемещения белков в липидном бислое мембраны необходимо прямое взаимодействие между микрофиламентами и мембранными белками.

Есть, однако, и более прямые данные о том, что микрофиламенты соединены с поверхностными белками, т. е. с клеточными мембранами. В разных лабораториях различными методами показано, что непосредственно под шапкой, образующейся на лимфоцитах (после обработки антителами) или на клетках гранулезы яичников (после обработки конканавалином А), собирается много микрофиламентов. Там же накапливаются миозин и тубулин. В более поздней работе применили метод осаждения актина из лизатов клеток мышечным миозином, после чего идентифицировали вещество, преципитирующее вместе с актином; показано, что актин осаждается вместе с молекулами, обычно находящимися на внешней поверхности клеточных мембран, такими, как антигены Н-2 и иммуноглобулины. Количество иммуноглобулинов, связанных с актином, больше в клетках с «шапками», чем в клетках с неизмененным распределением антигенов по поверхности. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что агрегация поверхностных белков в «шапку» вызывается возникновением новых связей с актином. Это может служить дополнительным свидетельством в пользу того представления, что микрофиламенты контролируют, по крайней мере, некоторые типы перемещения компонентов мембраны.

Приведенные выше данные демонстрируют также, что актиновые филаменты прямо связаны с мембранами. Результаты, полученные с помощью других методов и на других объектах, также указывают на это. Например, микрофиламенты часто выделяются при очистке цитоплазматических мембран. Впервые это показано для Acanthamoeba caslellani, а впоследствии подтвердилось практически для всех типов клеток. В очищенных препаратах мембран микрофиламенты можно увидеть в электронный микроскоп (причем они прикреплены к внутренней поверхности мембраны); кроме того, при электрофорезе препаратов мембран в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия обнаруживается актин.

Далее, есть прямые микроскопические наблюдения примембранных областей, в которых много микрофиламентов. Иногда, например, в случае ворсинок, очень четко видно, что микрофиламенты прикреплены к мембране на конце ворсинки. На электронных микрофотографиях поперечных сколов ворсинок центральный пучок микрофиламентов соединен с мембраной ворсинки как бы спицей.

Как микрофиламенты прикрепляются к мембране, пока неясно. Непосредственно ли присоединены микрофиламенты к мембранам или же их связь осуществляется через какие-то другие белки? Второе предположение кажется более правдоподобным; наиболее вероятные кандидаты на роль такого связующего белка -- а-актинин или подобные ему белки. Показано, что а-актинин присутствует в кончике ворсинки -- там, где микрофиламенты прикрепляются к ее мембране; кроме того, он обнаружен в цитоплазматической мембране и в мембранах секреторных везикул вблизи микрофиламентов. Таким образом, предполагается, что б-актинин играет одну и ту же роль и в мышечных волокнах (где он связывает актиновые нити с Ж-мембранами) и в немышечных клетках. Возможно, микрофиламенты взаимодействуют с мембранами также через посредство миозина, и есть данные, указывающие на то, что миозин может выступать как трансмембранный белок.

Менее убедительны эксперименты, поставленные с целью выявить прямое взаимодействие, между микротрубочками и мембранами. По данным многих исследователей, колхицин связывается с мембранами, однако из-за того, что такому связыванию могут способствовать самые разные факторы, это нельзя расценивать как доказательство присутствия тубулина в клеточной мембране. Более прямые данные, указывающие на то, что тубулин входит в состав мембран, получены на синаптосомах головного мозга и на мембранах ресничек некоторых моллюсков. Во всяком случае, связь с мембранами для тубулина, по-видимому, не столь обычное явление, как для актина.

Кратко рассмотрев данные о взаимодействиях между микротрубочками, микрофиламентами и мембранами, и помня о распределении элементов цитоскелета в животной клетке, мы можем обсудить роль цитоскелета и клеточной мембраны (рис. 11).

Рисунок 11. «Предполагаемые взаимоотношения между микротрубочками, микрофиламентами и клеточной мембраной».

Согласно предполагаемой модели, в интерфазных клетках микротрубочки образуют внутренний каркас, расходясь от центра к периферии клетки. Этот каркас не участвует непосредственно в генерации движения, а служит опорой для расположенных ближе, к поверхности клетки структур.

5. Генерация движения микрофиламентами

Микрофиламенты могут генерировать движение двумя различными способами: путем скольжения -- согласно этому механизму актиновые и миозиновые нити скользят друг относительно друга - или же просто путем сборки и дезагрегации пучков микрофиламентов. Опять мы сталкиваемся с удивительным соответствием между системой микрофиламентов и системой микротрубочек: обе системы генерируют движенце, одними и тещи же способами. Это представляет интерес с эволюционной точки зрения, поскольку указывает на то, что системы, которые возникли, по-видимому, независимо друг от друга, решили проблему генерации движения одинаково, хотя и с помощью различных материалов.

Модель скольжения микрофиламентов, описывающая зависимые от актомиозина движения немышечных клеток, исходит из данных о сокращении мышц, модель которого можно применить с незначительными модификациями к микрофиламентам.

В немышечных клетках такая система подвижности состоит из актиновых микрофиламентов, один конец которых прикреплен к каким-либо структурам клетки (к клеточной мембране, микротрубочкам или другим органеллам, а другой конец свободен;, менаду свободными концами двух противолежащих актиновых микрофиламентов находятся биполярные миозиновые нити. Когда два противолежащих актиновых микрофиламента скользят вдоль миозиновой нити, их свободные концы сближаются, а закрепленные концы тянут за собой те структуры, к которым они присоединены. В мышцах всё это происходит в структурах, специально предназначенных для генерации движения (саркомерах). Саркомер состоит из двух пучков актиновых нитей (они прикреплены к Z-мембранам, ограничивающим саркомер) с миозиновыми нитями между ними. В результате скольжения нитей саркомер укорачивается, что соответствует сокращению мышцы. В немышечных клетках такое скольжение приводит к сближению структур, к которым прикреплены противоположные концы микрофиламентов

Рассмотрим теперь, как же при взаимодействии актиновых и миозиновых нитей возникает скольжение. Инициатором является миозин, точнее головки его молекулы, где находятся центры АТРазной активности. Миозиновые головки отличаются большим сродством к АТР, и при его избытке каждая головка связывает одну молекулу АТР.

Рисунок 12. «Модели взаимодействия актина и миозина. Вверху, мышце; посередине и внизу: в немышечных клетках».

Связав АТР, миозиновая головка сразу же переходит в активированное состояние с высоким сродством к актину и прикрепляется к одной из актиновых субъединиц ближайшего микрофиламента. Связывание с актином немедленно вызывает гидролиз АТР, за счет выделившейся - при этом энергии головка поворачивается на небольшой угол, что немного перемещает актиновый филамент, к которому головка прикреплена. При утилизации новых порций АТР такой цикл повторяется многократно, скольжение становится заметным. Мы привели весьма упрощенное описание процессов, связанных с актомиозинзависимой сократимостью мышечных волокон. Более полное описание читатель найдет в другой книге этой же серии (R. М. Simmons Muscle Contraction"). Этот основной механизм взаимодействия актина и миозина можно, по-видимому, распространить также и * на немышечные клеточные системы.

5.1 Регуляция скольжения белками микрофиламентов