Биосенсоры: основы и приложения

Относительное или полное отсутствие инсулина у больных диабетом приводит к тому, что концентрация глюкозы в крови превышает допустимые в норме узкие пределы (около 3,5-5 моль/л натощак). Около 20% диабетиков, которые в основном заболевают в возрасте около 30 лет, страдают от полного или почти полного разрушения вырабатывающих инсулин клеток поджелудочной железы (островки Лангерганса). Диабет этого типа называют инсулин-зависимым, или диабетом I типа. Для жизни больных диабетом этого типа необходимо восполнение инсулина. Обычно инсулин вводят подкожной инъекцией. И хотя такие инъекции сохраняют жизнь и в значительной степени предотвращают симптомы острой гипергликемии, они все же не могут поддерживать уровень глюкозы в крови на недиабетическом (контрольном) уровне. Иногда содержание глюкозы падает до слишком низких величин (гипогликемия), что сопровождается неприятными проявлениями и опасной потерей сознания; часто, однако, оно столь высоко, что, как всерьез полагают, оказывает весьма существенные и длительные воздействия на ткани в глазах, нервах, почках и кровеносных сосудах.

Поэтому в течение последних нескольких лет принимались интенсивные меры к улучшению диабетического контроля. Один из важных подходов в этой области заключается в контролируемом вливании инсулина из портативного насоса "с незамкнутым контуром" [41, 42], что фактически является имитацией секреции инсулина у здоровых людей. Эти приборы могут поддерживать гликемию почти в норме по меньшей мере в течение нескольких лег, однако при самых различных обстоятельствах, например после интенсивной тренировки, в ходе случайной болезни или менструации, есть опасность потери контроля. Логическое развитие этих систем - "замыкание контура" и установление обратной связи, управляющей скоростью вливания инсулина, при помощи имплантируемого глюкозного сенсора. В конечном итоге такая искусственная поджелудочная железа может стать целиком имплантируемой, но это направление находится пока на самой ранней стадии развития, поэтому, прежде чем прогресс станет реальностью, необходимо решить бесчисленное множество технологических, биологических и этических проблем.

Между тем имплантируемые глюкозные сенсоры, не связанные с насосами, все еще имеют значительные преимущества, если необходимо дать тревожный сигнал о гипогликемии, предупредить надвигающуюся гипергликемию или кетоацидоз и вообще получать непрерывную информацию о содержании глюкозы в крови, что даст возможность пациенту самому скорректировать и отрегулировать инсулиновую терапию.

Возможные применения биосенсоров.

Если определить биосенсоры как идеальные приборы, пригодные для имплантации, позволяющие проводить непрерывное наблюдение, уникально чувствительные и свободные от помех, то люминесцентные методы еще должны развиваться и развиваться. Совершенно ясно, однако, что как методы трансляции малых концентраций биологических соединений в легко обрабатываемый сигнал, они заслуживают внимания.

Потенциальные возможности этих методов велики, особенно если учесть, что они обладают достаточной чувствительностью и не требуют предварительного разделения пробы. Существующее аппаратурное оформление этих методов в целом является традиционным в том смысле, что подготовленный образец помещают в ячейку или кювету, которую при детектировании излучаемого света ставят перед вакуумным фотоумножителем. Недавние разработки в этой области позволяют предполагать, что в недалеком будущем будет налажен серийный выпуск новых, более удобных приборов.

Моделью для многих приборов на основе описанных реакций может служить рассматриваемое ниже устройство, в котором используется оптическое волокно диаметром ~3,3 мм [12]. В этом приборе, измеряющем концентрацию пероксида водорода в буферном растворе, пероксидазу иммобилизуют в прозрачном полиакриламидном геле и вводят люминол как в гель, так и в раствор. С помощью фотоумножителя, помещенного на другом конце волокна длиной 61 см, можно детектировать концентрации до 10~6М. Указывается, что в отличие от других ферментных электродов нет необходимости в том, чтобы продукт ферментативной реакции диффундировал к поверхности электрода. Таким образом, время отклика прибора очень мало, около 4 с. При этом, однако, возникает проблема, связанная с тем, что сигнал лимитируется массопереносом. Использование световода простой формы позволяет сделать конструкцию приборов удобной и работоспособной [4]. Так что эта идея заслуживает внимания. При реализации такого подхода основные проблемы, вероятно, связаны с иммобилизацией фермента. В случае иммуносенсоров, конечно, возникают трудности, обуславливаемые крайне низкой скоростью установления равновесия при связывании лиганда с антителом. Тем не менее благодаря высокой чувствительности детектирования света и независимости от процессов на электроде дальнейшие исследования в этой области представляются перспективными. Развитию аналитических приборов на основе биолюминесценции препятствует трудность получения люциферазы. Однако последние обнадеживающие успехи в этой области, в частности клонирование бактериальной люциферазы [3] и фотопротеина экорина [7], позволяют надеяться, что такой проблемы больше не существует. Теперь можно полагать, что редкость данного организма не будет в дальнейшем сдерживать попытки разработки на его основе новых аналитических методов.

Как и в случае любых приборов, основанных на использовании ферментов, возникает вопрос об устойчивости. Уже накоплен довольно большой опыт по использованию люцифераз, иммобилизованных на различных подложках. Препараты люциферазы светляка пока еще недостаточно устойчивы для применения в биосенсорах, однако устойчивость бактериальной люциферазы постоянно улучшается по мере появления лучших методов иммобилизации. Теперь бактериальную люциферазу можно использовать в нескольких сотнях циклов, полагая при этом, что фермент не изменился по сравнению с исходным. Сможет ли на практике этот фермент служить так долго, как немногие известные "долгожители", остается предметом дальнейшего исследования.

Еще одна проблема, возникающая при использовании хемилюминесцента и биолюминесценции в сенсорах, связана с необходимостью пополнения реагента. Коль скоро мы хотим использовать такие преимущества эмиссии света, как простота детектирования и высокая чувствительность, то в конструкции прибора необходимо предусмотреть и возможность добавления реагента. Следует понимать, что рассматриваемое явление предполагает необратимое окисление субстрата-люциферина в случае биолюминесценции и легко доступной небольшой органической молекулы в хемилюминесценции. Для многих описанных в этой главе реакций удается сделать так, чтобы их скорость зависела только от концентрации определяемого вещества. В настоящее время единственный способ достижения этого состоит во введении избытка люминесцирующего соединения. В обычном анализе такое "буферирование" самим реагентом не представляет проблемы, но нужно проявить немало изобретательности, чтобы добиться того же эффекта в пределах ограниченного рабочего объема сенсора. Если, однако, допустить, что концентрация определяемого вещества не слишком отличается от нижней границы диапазона определяемых концентраций (это предположение вполне согласуется с исключительной чувствительностью метода), то нетрудно найти приемлемую конструкцию прибора. Интересным примером долговременного обеспечения природной люминесцентной системы люциферином является сам светляк. Этот организм появляется из куколки со всем запасом люциферина, который необходим на время (около одного месяца) почти непрекращающегося импульсного свечения по ночам! Учитывая, что потребность фотоумножителей в фотонах существенно ниже интенсивности вспышки светляка, можно было бы оценить продолжительность работы сенсора. До такой оценки нельзя дать точный ответ на этот вопрос, однако в лучших случаях продолжительность работы сенсора не слишком отличается от срока службы ферментов, используемых в существующих биосенсорах. Хемилюминесцирующие соединения могут функционировать в виде твердых тел или паст; можно предусмотреть и удерживающие их полупроницаемые мембраны в сочетании с соответствующим образом измененными соединениями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ