В системах с избытком меченых антител чувствительность метода лимитируется удельной активностью меченого реагента: меченые антитела при содержании 125 I, превышающем 1 атом на молекулу белка, обладают значительно меньшей иммунореактивностью. Порог определения 125 I - 10^-17 - 10^-18 моль.

Некоторые неизотопные метки обеспечивают большую удельную активность, чем 125 I, и следовательно, более высокую чувствительность анализа. Порог определения 10-²¹ - 10-²³ моль. Одной из таких неизотопных меток является фермент щелочная фосфатаза.

В качестве примера применения иммунохемилюминесцентного анализа рассмотрим аналитическую систему IMMULITE (DPC, США). Этот пример особенно интересен тем, что фирма DPC параллельно разрабатывает и производит наборы для РИА, и проводит сравнение этих методов по анализам. В качестве метки в системе IMMULITE используется щелочная фосфатаза. Достигая высокой специфической активности, создатели этого анализатора свели к минимуму неспецифическое связывание за счет применения технологии центрифугированной промывки. Неспецифическое связывание на твердой фазе составляет около 2 молекул на миллион.

После промывки в пробирку вносится хемилюминесцентный субстрат, адамантил диоксетан, который под воздействием щелочной фосфатазы расщепляется, образуя неустойчивое соединение. Переход его в устойчивое состояние происходит с выделением фотонов, световой поток считывается люминометром. Ферментативно - усиленная хемилюминесценция обеспечивает длительное свечение, повышая возможность считывания.

Для чего же используется такая высокая чувствительность? Она необходима тогда, когда особое значение имеет измерение именно низких концентраций ряда аналитов.

В меню анализатора IMMULITE есть тесты ТТГ третьего поколения и ПСА третьего поколения. К настоящему времени известно три поколения ТТГ анализа. В основе разделения лежит функциональная чувствительность теста, которая отличается от его аналитической чувствительности. Функциональная (или клинически применяемая) чувствительность - это минимальная концентрация определяемого вещества, которая может быть измерена с коэффициентом вариации меньше 20 %.

Поколение > Функциональная > чувствительность > Аналитическая чувствительность:

1 1-2 m IU/mL > 0,5 m IU/mL.

2 0,1-0,2 m IU/mL > 0,05 m IU/mL.

3 0,01-0,02 m IU/mL > 0,005 m IU/mL.

Тест ТТГ третьего поколения в анализаторе IMMULITE имеет предел функциональной чувствительности 0,02 mIU/mL.

Работы многих специалистов доказали, что в ряде ситуаций только использование третьего поколения ТТГ может дать необходимую информацию.

Что дает применение 3 поколения ТТГ?

1 Оптимизация подавляющей терапии. Требуемая степень подавления определяется как спецификой заболевания, так и состоянием пациента. В общем случае к пациентам с дифференцированным раком щитовидной железы применяется агрессивная терапия вследствие риска возникновения метастазов. Подавление доводится до верхнего предела клинической допустимости - до значений ТТГ ниже 0.01 mIU/mL. Однако для оперируемых пациентов и пациентов с доброкачественным узловым или диффузным зобом режим лечения является менее агрессивным: уровни ТТГ поддерживаются в диапазоне от 0.01 до 0.4 mIU/mL. Терапия должна быть тщательно сбалансированной и обеспечивать требуемую степень подавления, и при этом устранять потенциально опасное воздействие ятрогенного гипертиреоза на сердце и печень, а также не провоцировать развитие остеопороза. Только ТТГ 3 - го поколения предоставляет точную и достоверную информацию для оптимизации подавляющей терапии.

2 Дифференциальная диагностика больных с супергипертиреозом и тяжелыми нетиреоидными заболеваниями, к которым применяется интенсивная медикаментозная терапия, вызывающая подавление ТТГ до уровня 0,01mIU/mL

Исследования показали, что заболевания щитовидной железы подтвердились только в 24 % случаев госпитализации пациентов, у которых анализы, сделанные с помощью 2 - й генерации ТТГ, свидетельствовали о концентрации ТТГ ниже функционального предела. Дополнительные исследования доказали, что в общем случае у больных с супергипертиреозом ТТГ 0.010 mIU/mL и ниже, в то время как у больных с тяжелыми нетиреоидными заболеваниями ТТГ значительно выше - 0.090 - 0.150 mIU/mL

3 Определение очень низких концентраций ТТГ при оптимизации гормонозаместительной терапии.

4 Определения субнормального состояния (диапазон 0,01 - 0,4 mIU/mL) тиреоидного статуса.

Тест ПСА третьего поколения также завоевал всеобщее признание как важный инструмент диагностики и постоперационного мониторирования рака предстательной железы.

ПСА третьего поколения используется для:

1. Оценки эффективности терапии у пациентов с раком предстательной железы.

2. Определения прогрессирования рака после неадекватного лечения.

3. Определения развития метастазов после лечения первичной опухоли.

4. Скрининг мужчин старше 50 лет для раннего выявления опухоли предстательной железы.

Сравнивая результаты тестов ПСА третьего поколения IMMULITE c результатами исследования системой с меньшей чувствительностью, можно сказать, что при благополучном исходе заболевания чувствительность метода не имела особого значения, тогда как при прогрессировании заболевания у пролеченного больного тест ПСА третьего поколения на 2,5 года раньше показал неблагоприятные изменения. Ранняя диагностика в таких случаях имеет решающее значение, и обеспечивается именно высокой чувствительностью теста.

Таким образом, предлагаемая высокая чувствительность тестов в меню анализатора IMMULITE - это не дань стремлению к теоретическому совершенству, а реальный инструмент для ранней диагностики заболеваний и контроля за адекватностью лечения.

2.1.1 Качественный анализ

Качественный анализ объектов исследования проводят путем сравнения полученного спектра флуоресценции образца с наиболее характеристическими пиками, обычно K_б или K_в излучения с табулированными значениями этих величин в соответствующем атласе спектральных линий ряда известных элементов. Практика проведения качественного анализа состоит либов сканировании спектра вторичного излучения в широком максимально возможном для данного прибора диапазоне длин волн, свыделением характеристических линий элементов, содержащихся в пробе, либо с целью проверки наличия конкретного вещества в пробе, проводят дискретное сканирование, ограниченное областью длин волн вторичного излучения искомого элемента [38]. В зависимости от поставленной задачи в программе «Качественный анализ» или должен быть выставлен диапазон длин волн, характерный для присутствия искомого элемента, или сканируют в диапазоне всех длин волн, определенных возможностями прибора, для определения всех возможных элементов находящихся в пробе после сравнения с атласом спектральных линий. Возможно программное определение качественного элементного состава пробы. Дополнительно оператор кроме диапазона длин волн должен установить шаг сканирования (или установить характеристическую длину волны вторичного излучения для анализа одного элемента), порядок отражения и время экспозиции.

2.1.2 Количественный анализ

Количественный анализ служит для точной оценки состава пробы. Все виды количественного анализа основаны на том, что существует функциональная зависимость между измеренной интенсивностью аналитической линии и концентрацией соответствующего элемента в образце. Высокая концентрация элемента в пробе обуславливает образование большого количества вторичных квантов излучения, имеющих энергию соответствующую этому элементу [39]. Измерением интенсивности нескольких образцов с известной, но разной концентрацией определяемых элементов (эталонных образцов), определяют для каждого анализируемого элемента функциональную зависимость. Она может быть выражена, как в аналитическом (градуировочное уравнение), так и в графическом (градуировочный график) виде. Градуировочное уравнение в общем виде записывается выражением:

C(x) = +T(x), (2)

где A₀ - коэффициент, характеризующий величину фоновой «подстановки» под аналитической линией. При нулевой концентрации элемента Х в пробе она не равна нулю;

A₁ - концентрационная чувствительность (определяется углом наклона калибровочного графика и показывает удельное изменение величины аналитического сигнала при изменении концентрации элемента в пробе).

T(x),- интенсивность аналитической линии.

Практика работы показывает, что в ряде случаев градуировочное уравнение не является линейным. Отклонение от линейности связано с фактором межэлементного влияния и эффектом матрицы. Межэлементное влияние обусловлено наличием в образце других элементов (Y,Z и др.), изменяющих (увеличивающих или уменьшающих) интенсивность вторичного излучения определяемого элемента X. В случае поглощения вторичного излучения определяемого элемента материалом образца интенсивность излучения уменьшается. Степень снижения интенсивности аналитического сигнала при определении элемента X может быть разной в зависимости от компонентного состава примесей и их содержания в пробе. С увеличением атомного номера примесных ионов вероятность поглощения кванта определяемого иона возрастает. В случае, если энергия флуоресцентного кванта элемента примеси (Y) превышает потенциал возбуждения определяемого элемента (X) и находится вблизи соответствующего края поглощения, то происходит процесс «подвозбуждения», т.е. более активный квант примеси увеличивает квантовый выход определяемого элемента, не пропорционально его содержанию в образце.

Действие двух противоположно направленных процессов обуславливает положительную или отрицательную ошибку определения с неоднозначной оценкой содержания определяемого элемента. Взаимное влияние указанных процессов, происходящих при рентгенофлуоресцентном анализе, отражается на градуировочном уравнении, которое имеет вид:

C(x) = A0+A1·О(x)+A2·О(y)·Оx, (3)

где О (х) - интенсивность аналитической линии влияющий на квантовый выход элемента Y.

Отсутствие линейности функции может быть откорректировано использованием вторичной градуировки эталонов для анализа элемента X, содержащие все элементы влияния на его определение в максимально возможном их сочетании при изменяющихся концентрациях. В этом случае калибровочный график анализа определяемого элемента будет адекватно отражать его концентрацию в пробах. Особенностью образцов для РФА могут быть предоставлены различными поправками в уравнении с учетом приоритетных процессов.

Важнейшие из них - эмпирические методы внешнего и внутреннего стандарта, использование фона рассеянного первичного измерения и метод разбавления.

В методе внешнего стандарта неизвестную концентрацию элемента C_i определяют путем сравнения интенсивности T_i с аналогическими Tст стандартных образцов, для которых известны значения концентраций Cст определяемого элемента. При этом:

C_i = Cст T_i / Tст. (4)

Метод позволяет учесть поправки, связанные с аппаратурой, однако для точного учета влияния матрицы стандартный образец должен быть близок по составу к анализируемому.

В методе внутреннего стандарта к анализируемому образцу добавляют некоторое количество ДC_i определяемого элемента, что приводит к росту интенсивности ДT_i. В этом случае:

C_i = T_iДС_i / ДT_i. (5)

Метод эффективен при анализе материалов сложного состава, но предъявляет особые требования к подготовке образцов с добавкой. Использование рассеянного первичного излучения основано на том, что в этом случае отношение интенсивности флуоресценции T_i определяемого элемента к интенсивности фона T_ф зависит в основном от C_i и мало зависит от концентрации других элементов.

В методе разбавления к изучаемому образцу добавляют большие количества слабого поглотителя или малые количества сильного поглотителя. Эти добавки должны уменьшить эффект матрицы. Метод разбавления эффективен при анализе водных растворов и сложных по составу образцов, когда метод внутреннего стандарта неприменим. Существуют также модели корректировки измеренной интенсивности T_i на основе интенсивности T_j или концентраций C_j других элементов. Например, величину C_i представляют в виде:

С_j = А_io + А_i1·T_i + А_i2·T_2i + У_аij·T_j + У_bij·T_j + У_dij·T_2. (6)

Величины a, b и d находят методом наименьших квадратов на основе измеренных значений T_i и T_j в нескольких стандартных образцах с известными концентрациями определенного элемента C_i.

2.1.3 Собственное свечение клеток и тканей животных

Отечественный ученый А.Г. Гурвич был первым, кто указал на существование собственного слабого свечения клеток животных и растений, названного им «митогенетическими лучами». Согласно А.Г. Гурвичу, митогенетические лучи - это очень слабое ультрафиолетовое излучение клеток, которое индуцирует деление окружающих клеток [40]. Хотя сам А.Г. Гурвич использовал для обнаружения лучей только "биологический детектор", то есть разные делящиеся клетки, его последователи в России [Родионов С., и Франк Г.М., 1934] и за рубежом [Aubert R., 1938] разработали физический детектор излучения: газоразрядный счетчик фотонов с кварцевым окном, прозрачным для УФ - лучей.

С помощью счетчика фотонов было изучено свечение в ходе ряда окислительно-восстановительных реакций, а также свечение биологических объектов, таких как суспензия дрожжевых клеток, проростки растений и даже нервно-мышечный препарат. Развития эта техника, однако, не получила из-за неустойчивой работы газоразрядных счетчиков и плохой воспроизводимости результатов.

В 1952 г. А. Стрелер создал высокочувствительный прибор для счета фотонов на основе фотоэлектронного фотоумножителя (ФЭУ), охлаждаемого жидким азотом, и применил его для изучения послесвечения зеленых листьев. В 1956 году группа итальянских авторов использовала сходную технику для изучения свечения проростков растений. Сверхслабое свечение животных клеток и тканей было изучено в работах. Также с помощью фотоумножителя, охлаждаемого жидким азотом. В настоящее время созданы высокочувствительные малошумящие ФЭУ, позволяющие без охлаждения регистрировать слабое собственное свечение клеток и тканей растений и животных [41].

В настоящее время слабое свечение удается изучать не только с растворах или суспензиях клеток, но и на целых органах в составе организма. На рисунке 4 изображен аппаратурный комплекс, применяемый для измерения собственного свечения тканей животного, например, печени или легкого.

Наиболее важные части комплекса - это совершенно непроницаемый для света ящик, в который помещают лабораторное животное, например крысу, и высокочувствительный приемник света - фотоумножитель, соединенный через усилитель и другие промежуточные устройства с самопишущим потенциометром или же персональным компьютером.

Рисунок 5 - Измерение собственного свечения органов лабораторного животного (в данном случае - крысы)

2.2 Получение наночастиц серебра методом химического восстановления в растворах

Наночастицы серебра в водных растворах [42]. получают путем восстановления ионов серебра с помощью глюкозы, аскорбиновой кислоты, гидразина, боргидрида натрия и других восстановителей. Реакцию восстановления проводят в различных условиях. Восстановление глюкозой проводят при нагревании до 60⁰С. Для увеличения скорости протекания реакции используют гидроксид натрия. Полученные частицы исследуют различными способами: методом рентгеновской дифракции (XRD), методом трансмиссионной электронной микроскопии (TEM), а также проводились исследования на спектрофотометре. Исследования показали, что в ходе восстановления в водных растворах были получены частицы размером 10 - 20нм, л = 1.5418 A⁰.

К способам управления размерами наночастиц, применяемым в научной практике, относятся: использование полимерных матриц, позволяющих управлять размерами нанокластеров, полимерной защиты; физические методы управления размерами (обработка ультразвуком, облучение рентгеновским излучением и использование токов высокой чистоты). Так, использование боргидрида натрия при восстановлении позволяет в большинстве случаев получить наночастицы серебра с узким распределением по размерам в пределах 2 - 8нм. Восстановление более мягким восстановителем, таким как гидразин, приводит к образованию более крупных наночастиц металлов с размерами 15 - 30 нм. При варьировании условий восстановления возможно получение практически монодисперсных наночастиц. Строение и размер продукта в большой степени зависит от условий реакции таких как температура и концентрация нитрата серебра. Например, когда температура понижается до 120⁰ или увеличивается до 190⁰, в полученном продукте доминируют наночастицы с нерегулярной структурой (формой). Начальная концентрация нитрата серебра должна быть не больше 0.1М, в противном случае будет выпадать в виде осадка металлическое серебро. Наночастицы серебра с различными размерами могут быть получены в результате увеличения времени проведения реакции.

Для исследования влияния рН на устойчивость водных коллоидных растворов, раствор нитрата серебра был предварительно обработан и его значение рН установлено по растворам NaOH и HCl. Процесс восстановления серебра шел замедленно в сильнокислых (рН 1.5) и в основных (рН 12.5) условиях. Коллоидный раствор в щелочной среде сохраняет устойчивость в течении больше, чем 2 недели без образования осадка. В то время как в кислотных условиях подобная стабильность не наблюдается, образовавшиеся агригаты сохраняются лишь в течении 5 дней при рН 1.5.

Также известны способы получения наночастиц серебра в неводных средах. Наночастицы серебра с фиксированным размером были синтезированы с помощью модифицированного высокомолекулярного процесса, который предполагает восстановление нитрата серебра с этиленгликолем в присутствии стабилизаторов, таких как поливинилпирролидон [43]. Несмотря на то, что принцип селективности для этих систем еще не полностью изучен, предполагают, что селективная адсорбция ПВП на различных кристаллографических плоскостях серебра определяет морфологию продукта.

Оптические измерения коллоидных наночастиц серебра в этаноле показывают единственный максимум при длине волны 395 нм, который связан с поверхностным плазменным резонансом. Это и соответствует сферическим наночастицам серебра размером 5 - 8 нм. Наблюдался процесс разрушения наночастиц при прохождении через энергетический барьер: должно накопиться необходимое для разрушения наночастиц количество энергии и, одновременно, проникнуть в запрещенную энергетическую зону и индуцировать многофотонный процесс.

2.3 Получение наночастиц серебра методом фотолиза

Процесс фотолиза, с помощью лазерного возбуждения, также может быть использован для получения наночастиц серебра в коллоидных растворах. Камат [46] в своей работе предполагал, что в процессе фотолиза наночастицы серебра теряют электроны за счет фотоэжекции, образуя переходное состояние, которое предшествует окончательному разделению больших частиц. Таками считал, что уменьшение размера частиц наблюдается после облучения нановторичными Nd:YAG лазерными импульсами. Это объясняется частичным нагревом, плавлением и испарением поверхностного слоя. Моханти [44] предполагал, что лазерное облучение разбивает наночастицы серебра на мельчайшие фрагменты, которые снова образуют частицы новых размеров. Таким образом, основным способом контроля размера образующихся наночастиц является облучение.

2.4 Получение наночастиц серебра с помощью лазерного излучения

В последние несколько лет для получения коллоидных частиц металлов использовалось лазерное облучение. Для элементов, в первых работах Мафуна [45], было показано, что получение наночастиц с помощью лазера, может быть выполнено в растворах, эта возможность используется металлическими коллоидными частицами, без учета ионов в конце процесса образования наночастиц. Изучается возможность расширения этого процесса для большего числа различных растворителей отличных от воды, что было представлено в работах Амондола [46], который предложил способ контролирования металлических кластерных соединений за счет переизлучения, мониторинга результатов с помощью исследования оптических свойств. Совсем недавно исследовалось прямое влияние лазерного излечения на золото - серебряную коллоидную смесь, что дало новые способы получения сплавов наночастиц.

Контроль размера, формы и структуры металлических наночастиц технологически важны из - за сильных корреляций между этими параметрами и оптическими, электрическими и кристаллическими свойствами.

2.5 Просвечивающая электронная микроскопия

Просвечивающая электронная микроскопия дает возможность получить в одном эксперименте изображения с высоким разрешением и микродифракционные картины одного и того же участка образца. Современные просвечивающие электронные микроскопы обеспечивают разрешение до 0,1 нм и размер участка, с которого снимается микродифракционная картина - до 50 нм. По полученному изображению можно судить о строении материала, а по дифракционной картине - о типе кристаллической решетки.

Как известно, в дифракционной картине от периодических структур имеются максимумы (рефлексы) различного порядка: нулевого, первого, второго и т.д. в зависимости от угла, отсчитанного от нерассеявшегося пучка, и периодичности структуры. Электронные микрофотографии получают в условиях, когда апертурная диафрагма вырезает из общего потока только центральный пучок (дифракционный максимум нулевого порядка). Они могут дать сведения о размерах и форме отдельных зерен, фаз и других структурных единиц.

Информация другого рода содержится в электронограмме - дифракционной картине, получаемой при пропускании максимумов более высокого порядка (при большей апертуре диафрагмы). После соответствующей обработки по ней можно судить о типе кристаллической решетки, межплоскостных расстояниях, ориентации кристаллитов и др.

Небольшие изменения в оптической системе ПЭМ позволяют наблюдать объект, как в светлом, так и в темном поле (подобно оптической микроскопии).

Существует три разновидности метода просвечивающей электронной микроскопии: прямой, полупрямой и косвенный.

Прямой метод дает наиболее полную информацию о структуре объекта, которым служит тонкая металлическая пленка (фольга) прозрачная или полупрозрачная для электронов. При исследованиях по этому методу удается различать отдельные дислокации и их скопления. Этим методом можно проводить и микродифракционный анализ. В зависимости от состава материала в зоне изучения получают диаграммы в виде точек (монокристаллы, или поликристаллы с зерном больше зоны исследования), сплошные или состоящие из отдельных рефлексов (очень мелкие кристаллики в зернах или несколько малых зерен). Расчет этих диаграмм аналогичен расчету рентгеновских дебаеграмм. С помощью микродифракционного анализа можно также определять ориентировки кристаллов и разориентировки зерен и субзерен. Просвечивающие электронные микроскопы с очень узким лучом позволяют по спектру энергетических потерь электронов прошедших через изучаемый объект, проводить локальный химический анализ материала, в том числе анализ на легкие элементы (бор, углерод, кислород, азот).

Косвенный метод связан с исследованием не самого материала, а тонких реплик, получаемых с поверхности образца. Изготовление реплик проводят либо путем напыления в вакууме на поверхность образца пленки углерода, кварца, титана или других веществ, которую можно потом отделить от образца, либо используют легко отделяемые оксидные пленки (например, для меди), получаемые оксидированием поверхности.

Полупрямой метод иногда применяют при исследовании гетерофазных сплавов. В этом случае основную фазу (матрицу) изучают с помощью реплик (косвенный метод), а частицы, извлеченные из матрицы в реплику, исследуют прямым методом, в том числе и с помощью микродифракции. При этом методе реплика перед отделением разрезается на мелкие квадратики, а затем образец протравливают по режиму, обеспечивающему растворение материала матрицы и сохранение частиц других фаз. Травление проводят до полного отделения пленки - реплики от основы. Особенно удобен метод при изучении мелкодисперсных фаз в матрице при малой объемной их доле. Отсутствие у реплики собственной структуры позволяет исследовать дифракционные картины от частиц. При прямом методе такие картины выявить и отделить от картины для матрицы очень сложно.

2.6 Растровая электронная микроскопия (РЭМ)

В основе работы микроскопа лежит принцип сканирования исследуемой поверхности тонким электронным зондом.

В результате взаимодействия зонда с веществом образуются разные токи, которые улавливаются соответствующими приёмниками и преобразуются в видеосигнал. Полученный видеосигнал поступаёт на телевизионный тракт, где он усиливается, преобразуется в телевизионный сигнал с последующим воспроизведением изображением на экране кинескопа видеоконтрольного устройства .

Тонкий электронный зонд на поверхности исследуемого образца формируется электронной оптической системой микроскопа которая включает в себя:

- источник электронов - электронная пушка;

- две формирующие электромагнитные линзы - конденсор и объектив;

- стигматор;

- отклоняющая система.

Трехэлектродная электронная пушка состоит из «V» образного катода прямого накала, управляющего электрода и анода. Анод пушки заземлен, а к катоду приложено ускоряющее напряжение отрицательной полярности. На управляющий электрод, подается отрицательное (относительно катода) напряжение смещения, которое позволяет регулировать ток пучка, выходящего из пушки, Напряжение смещения образуется в результате протекания тока эмиссии катода по сопротивлению смещения. Известно два режима работы пушки: режим насыщения и режим пространственного заряда:

1 В режиме насыщения эмитированного с катода электроны непосредственно используются для формирования пучка. В этом режиме пучок имеет структуру, определяемую неоднородностями эмиссии с катода. Эти неоднородности видны на контрольном экране в виде расходящихся полос. Вызываются они структурой вольфрамовой проволоки, образовавшейся в процессе изготовления. Режим насыщения образуется при недостаточной эмиссии катода (т.е. при недостаточном токе накала) и малом (по абсолютной величине) напряжении смещения. Этому может также способствовать слишком большая длина катода, в результате чего его вершина входит внутрь отверстия управляющего электрода.

2 В режиме пространственного заряда перед катодом образуется электронное облачко пространственного заряда, которое и является непосредственным источником. В облаке происходит усреднение электронов, эмитированных различными участками катода, поэтому электронный пучок не несет на себе следов структуры самого катода.

Рабочим режимом пушки является режим пространственного заряда. Переход от режима насыщения к режиму пространственного заряда осуществляется путем увеличения тока накала или увеличением (по абсолютной величине) напряжения отрицательного смещения. Ток накала должен устанавливаться таким, чтобы дальнейшее его увеличение не вызывало повышение яркости пятна на экране. С течением времени происходит испарение материала катода, его диаметр уменьшается и для поддержания неизменной температуры катода следует несколько снижать ток накала по сравнению с первоначальным. Это способствует увеличению срока службы катода. В рабочем режиме распределение температуры по длине катода сказывается резко неравномерным. Концы катода охлаждаются держателями, а на вершине катода происходит некоторое снижение температуры за счет отбора эмитированных электронов. Поэтому наиболее высокая температура образуется на боковых участках катода, на расстоянии, примерно, 1/3 от его вершины. В этих местах охлаждающее действие держателей не сказывается, а ток эмиссии не отбирается.

Здесь в результате наиболее интенсивного термического испарения и происходит, как правило, перегорание катода. Если перегорание катода происходит на вершине, это свидетельствует обычно о неправильном режиме работы пушки или чаще всего плохом вакууме в колоне микроскопа. В условиях плохого вакуума происходит интенсивное разрушение вершины катода положительными ионами остаточного газа.

При работе пушки с небольшим (по абсолютной величине) напряжением смещения удается получить более интенсивный электронный пучок и, следовательно, более контрастное изображение. Но при этом получения режима пространственного заряда приходится сильнее накаливать катод, что приводит к сокращению срока его службы. Поэтому, когда это возможно, особенно при работе микроскопа с небольшими увеличениями целесообразно увеличивать напряжение смещения и снижать ток накала, что поможет увеличить срок службы катода.

Если ток накала или напряжение смещения становятся недостаточными, катод приобретает собственную структуру с несколькими максимумами интенсивности, а изображение исследуемого объекта на экране кинескопа становится многоконтурным или размазанным.

Электронный пучок выходящий из пушки, имеет форму слабо расходящегося конуса, вершина которого, кроссовер, лежит между анодом и управляющим электродом. Кроссовер, отображается с уменьшением в плоскости исследуемого образца посредством двух линзовой оптической системы.

Первая линза - конденсор даёт промежуточное уменьшенное изображение кроссовера, которое затем перебрасывается в плоскость образца второй линзой - объективом.

Перед зазором конденсора и после него установлены 2 ограничивающие диафрагмы, которые предотвращают попадание пучка на стенки внутренних каналов полюсных наконечников и отклоняющей системы.

Между конденсором и объективом установлена отклоняющая система и стигматор, намотанные на общем каркасе.

Стигматор предназначен для исправления астигматизма объективной линзы, который вызывается неоднородностью материала линзы, неточностями изготовления или загрязнения, возникшими в процессе работы. Эти причины обуславливают искажения формы пятна на образце, (вместо круглого, оно становится эллиптическим), что приводит к размазыванию деталей изображения в определенном направлении.

При изменении тока объектива вблизи положения точной фокусировки (перефокусировка - недофокусировка) происходит поворот эллипса на 90°, соответствующий поворот направления размытия деталей на изображении.

Коррекция астигматизма объектива производится путем предварительного искажения формы пучка; входящую в объективную линзу. Для этого служат катушки электромагнитного стигматора. Стигматор состоит из 8 катушек, разделенных на две электрические независимые секции. Каждая секция состоит из соединенных последовательно четырех катушек, намотанных на общем каркасе. Катушки включены таким образом, что поля противоположных катушек направлены навстречу друг другу.

Результирующее поле подобной конфигурации вызывает сжатие электронного пучка в одном направлении и растягивание его в одном направлении и растягивание в противоположном, при изменении направлении тока в одной из секций катушек на противоположное происходит поворот эллипса на 90°. Оси катушек одной секции стигматора сдвинуты относительно другой на 45°, что позволяет путем независимого изменения величины и направления токов в секциях регулировать величину и направление вносимой эллиптичности пучка перед объективом.

На общем каркасе со стигматором ближе к зазору объектива намотана отклоняющая система развертки, состоящая из строчных и кадровых отклоняющих катушек, оси которых взаимно перпендкулярны.

Объективная линза отображает промежуточное изображение источника на образце. При регулировки тока объектива производится фокусировка пятна на образце, следовательно, и фокусировка изображения. В зазоре объектива установлена юстируемая апертурная диафрагма, которая определяет апертуру электронного пучка на образце. При уменьшении диаметра этой диафрагмы апертура уменьшается; вместе с тем снижаются и аберрации объектива, которые пропорциональны апертуре пучка.

Уменьшение апертуры вызывает также увеличение глубины резкости изображения, но при уменьшении диаметра диафрагмы происходит также снижение тока зонда на образце и понижение контраста изображения. Поэтому диаметр апертурной диафрагмы выбирается обычно в пределах 0,5 - 1,0 мм в зависимости от конкретных условий работы.

Разрешающая способность растрового микроскопа определяется в основном диаметром зонда на образце. При этом предполагается, что ток пучка еще достаточен для формирования видеосигнала. Диаметр зонда на образце складывается из уменьшенного линзами диаметра источника и кружков размытия, вызванных аберрациями оптики. В растровых микроскопах среднего разрешения наиболее существенной является сферическая аберрация объективной линзы, пропорциональная кубу апертуры пучка на образце. Существенно снизить сферическую аберрацию можно путём значительного уменьшения коэффициента сферической аберрации, что происходит при помещении исследуемого образца в пределы немагнитного зазора объективной линзы. Возможность помещения образца в немагнитный зазор объектива является отличительной особенностью микроскопа.

Наиболее высокое разрешение наблюдается в том случае, когда образец помещается вблизи середины немагнитного зазора объектива. К сожалению, в этом случае происходит некоторое снижение глубины резкости, поэтому положение образца приходится подбирать в зависимости от конкретных условий работы и вида образцов

Диаметр канала полюсных наконечников объектива выбран достаточно большим (30 мм) для того, чтобы большинство практически встречающихся образцов можно было вводить в пределы немагнитного зазора.

Объектив, в котором образец может помещаться в область сильного магнитного поля, называется объективом высокого возбуждения или магнитным иммерсионным объективом.

При помещении образца в магнитное поле отбор вторичных электронов с него на коллектор становится невозможным. Поэтому установка образца в зазор возможна только в режиме поглощения электронов.

Для работы в режиме вторичных электронов в объектив вставляется полюсный наконечник с малым диаметром канала.

С развертывающего устройства ВКУ отклоняющие токи пилообразной формы поступают на кадровые и строчные катушки отклоняющей системы, разворачивая электронный зонд в телевизионный растр на поверхности образца.

Для образования идеального растра на поверхности объекта и экране кинескопа необходимо, чтобы:

- движение луча вдоль каждой строки происходило с постоянной скоростью;

- расстояние между строками были одинаковыми;

- все строки по длине были равны между собой.

Кроме того, необходимо, чтобы совпадали моменты начала и конца строк растров на объекте и приемной трубке (кинескопе). Требования постоянства скорости движения луча и сохранения одинаковых расстояний между сроками диктуется тем, что только в этом случае четкость изображения и яркость свечения экрана будут постоянны по всему полю. Требования равенства длины всех строк обуславливается тем, что растр должен иметь прямоугольную форму.

В точке встречи электронного зонда с исследуемым образцом возникают вторичные, отраженные, поглощенные и прошедшие насквозь электроны (при исследовании тонких пленок прозрачных для электронов). Любой из этих токов можно собрать на коллектор и использовать в качестве полезного видеосигнала. Сигнал с коллектора поступает в телевизионный видеоусилительный тракт, где производится его усиление, коррекция и введение в видеоусилитель различных импульсных сигналов. Сформированный телевизионный сигнал модулирует приёмной электронно-лучевой трубки (кинескопа) по яркости и на экране воспроизводится увеличенное изображение поверхности исследуемого объекта.

Увеличение изображения равно отношению размеров растров на экране кинескопа и поверхности исследуемого объекта.

Наиболее простым режимом работы растрового микроскопа является получение видеосигнала в поглощенных электронах. Предельное разрешение для этого режима 0,5 мкм. Для достижения предельного разрешения образец помещается в середину магнитного поля объектива. При этом диаметр зонда на образце достигает минимума. Так как снятие видеосигнала происходит непосредственно с образца, то образец подключается к входу высокочувствительного видиоусилителя. Поэтому образец должен быть хорошо изолирован, экранирован и иметь минимальную емкость относительно корпуса. Кроме того, на образец подается постоянный потенциал отрицательной полярности для улучшения отбора с образца вторичных электронов. Образование видеосигнала происходит следующим образом:

При взаимодействии первичного пучка с образцом возникает вторичный эмиссионный ток, образуя напряжение видеосигнала. Сопротивление нагрузки выбирается порядка 50 - 100 кОм. Отсюда понятны требования минимальной ёмкости образца относительно корпуса, ибо эта ёмкость шунтирует сопротивление нагрузки. При снятии сигнала с образца в образовании сигнала участвует все уходящие с образца вторичные электроны независимо от направления их начальных скоростей. Постоянный потенциал на образце подбирается в зависимости от материала исследуемого образца и его положение относительно поверхности наконечника объектива. Наилучшее разрешение достигается при симметричном расположении образца относительно поверхности наконечника объектива. Как уже говорилось выше, для достижения предельного разрешения объект необходимо помещать в магнитное поле объективной линзы, при этом объективный отрезок становится очень малым (при этом минимальным становится коэффициент сферической аберрации), а апертурной угол пучка на объективе сравнительно большим. Поэтому глубина резкости изображения на приборе в режиме поглощенных электронов получается небольшой и лежит в пределах 1 - 3 мкм.

В растровом электронном микроскопе JEOLJSM - 7500F изображение исследуемого объекта формируется при сканировании его поверхности точно сфокусированным (5 - 10 нм) лучом электронов. Такой луч часто называют электронным зондом. Диаметр зонда может составлять 5 - 1000 нм. При взаимодействии электронов с поверхностью исследуемого материала протекает ряд сложных процессов, приводящих к появлению излучений различной природы. Эти излучения можно регистрировать с применением различных приборов и датчиков. Для формирования картины поверхности используют отраженные электроны и вторичные электроны. Создаваемые ими сигналы после их регистрации приборами усиливают, а затем используют для модуляции яркости изображения на электронно - лучевой трубке, развертка которой синхронна со смещением электронного зонда. Таким образом, каждой точке на поверхности образца ставится в соответствие точка на экране электронно - лучевой трубки. Яркость изображения точки пропорциональна интенсивности сигнала от соответствующей точки на изучаемой поверхности.

При использовании сигнала от отраженных электронов получается информация от слоя толщиной 1 - 2 мкм и диаметром существенно большой зоны падения электронного луча. Изображение поверхности получается с не очень высоким разрешением, зато отличается сильным черно - белым контрастом. Такой режим может быть полезен при изучении структуры на металлографических шлифах.

При использовании сигнала от вторичных электронов достигается наибольшее разрешение, так как вторичные электроны возникают в слое толщиной порядка 1 нм, а зона их возникновения ограничена областью вокруг падения электронного луча. Контрастность изображение несколько ниже, чем при использовании отраженных электронов, однако оно имеет стереометрический характер.

Недостатком метода РЭМ является возможность исследования только проводящих материалов. Для исследования изоляторов на их поверхность обычно напыляют тонкую пленку электропроводящего вещества, например углерода.

В связи с тем, что при облучении материала электронами возникает рентгеновское излучение в РЭМ, широкое применение находит также метод рентгеноспектрального микроанализа (РСМА). Поэтому почти для всех растровых электронных микроскопов предусмотрено конструктивное совмещение этих методов. Имеется возможность регистрировать спектры длин волн компонентов рентгеновского излучения и энергий рентгеновских квантов. Это обеспечивает проведение высокочувствительного (десятые - тысячные дошли процента) качественного и количественного анализа химического состава поверхности изучаемого материала, в том числе в отдельно выбранной точке.

2.6.1 Рентгенофазовый анализ (РФА)

Надежным экспериментальным методом получения данных о структуре и динамике кристаллической решетки твердых тел в условиях таких внешних воздействий, как давление и температура, является рентгенофазовый анализ.

Он обладает рядом важных преимуществ. Например, исследуется само твердое тело в неизменном состоянии и результатом анализа является непосредственно определение вещества или его составляющих.

Рентгеновские лучи исследуют кристалл, т е само соединение; в случае полиморфных тел рентгеновские лучи дают возможность различить отдельные модификации, свойственные данному веществу. Для исследования вещества требуется очень небольшое количество вещества, которое в процессе проведения аналитической операции не разрушается.

Структурные исследования в рамках развития синтеза новых материалов, свойства которых определяются особенностями строения на наноуровне, - является одной из самых перспективных направлений применения рентгенофазового анализа.

При рентгенофазовом анализе наноматериалов редко удается получить рентгенограммы с набором узких рефлексов, достаточным для идентификации состава содержащихся в них частиц. На некоторых рентгенограммах из всего набора рефлексов, характерных для данной фазы, наблюдается лишь два - три уширенных максимума.

Это, прежде всего, характерно для свежеполученных образцов, содержащих наночастицы с размерами в несколько нанометров. Чтобы получить более надежную информацию о составе таких образцов, их обычно «закаливают» при нагревании, что дает рентгенограмму гораздо более информативной.

Основной задачей рентгенофазового анализа (РФА) является идентификация различных фаз в их смеси на основе анализа дифракционной картины, даваемой исследуемым образцом. Определение вещества в смеси проводится по набору его межплоскостных расстояний и относительным интенсивностям соответствующих линий на рентгенограмме.

Когерентно рассеянные рентгеновские лучи интерферируют между собой, при этом дифракционной решеткой для рентгеновского излучения служит кристаллическая решетка, поскольку межплоскостные расстояния в кристалле сравнимы с длиной волны излучения.

2.6.2 Рентгеноструктурный анализ (РСА)

Дифракция рентгеновских лучей была открыта в 1912 году немецкими физиками М. Лауэ, В. Фридрихом и П. Книппингом. Направив узкий пучок рентгеновских лучей на неподвижный кристалл, они зарегистрировали на помещенной за кристаллом фотопластинке дифракционную картину, которая состояла из большого числа закономерно расположенных пятен. Каждое пятно- след дифракционного луча, рассеянного кристаллом.

В основе РСА лежит взаимодействие рентгеновского излучения с электронами вещества, в результате которого возникает дифракция рентгеновских лучей. Дифракционная картина зависит от длины волны используемых рентгеновских лучей и строения объекта. Для исследования атомной структуры применяют излучение с длиной волны ~ 1 ангстрема (Е), т. е. порядка размеров атомов. Методами РСА изучают металлы, сплавы, минералы, неорганические и органические соединения, полимеры, аморфные материалы, жидкости и газы, молекулы белков, нуклеиновых кислот и т.д. Наиболее широко РСА применяют для установления атомной структуры кристаллических тел. Это обусловлено тем, что кристаллы обладают строгой периодичностью строения и представляют собой созданную самой природой дифракционную решётку для рентгеновских лучей.

2.6.3 Дифракционный анализ

Существует несколько типов дифракционного анализа: рентгеноструктурный анализ (РСА), нейтронография, электронография. Геометрическая теория дифракции всех трёх излучений -- рентгеновских лучей, электронов, нейтронов -- одинакова, но физическая природа взаимодействия их с веществом различна, что определяет специфику и области применения каждого из методов. Рентгеновские лучи рассеиваются электронными оболочками атомов, нейтроны (через короткодействующие ядерные силы) -- атомными ядрами, электроны -- электрическим потенциалом атомов.

Дифрактограмма может быть зарегистрирована с помощью фотопленки или специальных датчиков, перемещающихся относительно образца и чувствительных к рассеиваемому излучению. В первом случае получают двумерное изображение рефлексов (пятен или колец), а во втором - одномерную зависимость интенсивности излучения в функции от смещения датчика (обычно углового) относительно образца.

Полученные в эксперименте дифрактограммы можно сравнивать со справочными (эталонными) и, таким образом, интерпретировать экспериментальные данные [47].

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Наночастицы серебра были получены разработанным методом кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления. Синтез наночастиц осуществляли путем восстановления ионов серебра в водном растворе в присутствии биосовместимых лигандов-стабилизаторов (поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль) при совместном воздействии ультрафиолетового излучения длиной волны 280-400 нм и ультразвуковых волн частотой 1,7 МГц,параметрами, что позволяет получить синергетический эффект физических факторов при синтезе наночастиц серебра. Технология приготовления наночастиц серебра путем кавитационно - диффузионного фотохимического восстановления заключается в том, что к 1% - ному раствору AgNO₃ добавляют 5%-ный раствор NaOH в объемном соотношении 5:1, образовавшийся осадок Ag₂O пятикратно отмывают бидистиллированной водой. Параллельно готовят навеску лиганда и растворяют его в бидистиллированной воде до получения 1%-ного раствора (полное растворение лиганда в растворе). Соотношение AgNO₃ и лиганда по массе сухого вещества должно составлять 1:3. В полученную взвесь Ag₂O в бидистиллированной воде вносят 1%-ный раствор лиганда при интенсивном перемешивании. После образования однородного раствора доводят объем раствора бидистиллированной водой до получения 0,0059 М раствора серебра и далее проводят фотохимическое восстановление этого раствора в течение 60 мин под действием ультрафиолетового облучения и ультразвуковых волн. В исследовании использованы несколько образцов наночастиц, полученных в растворах с разной концентрацией серебра: 100 мкг/мл; 50 мкг/мл; 10 мкг/мл.

Для оценки размеров полученных наночастиц была проведена их электронная микроскопия на микроскопе JEOLJSM-7500F в режиме SEI, LEI, COMPO и ADD с ускоряющим напряжением от 2 до 10 кВ, в зависимости от индивидуальных особенностей образца.

1) разрешающая способность: не хуже 1 нм при 15 кВ, не хуже 2,1 нм при 1 кВ;

2) увеличение в диапазоне от 20х до 900000х;

3) рабочий диапазон ускоряющих напряжений от 100В до 30 кВ;

Рисунок 6 - Растровый электронный микроскоп (РЭМ) JSM - 7500F

4) использует детекторы: вторичных электронов, отраженных электронов,STEM-детектор, энергодисперсионный детектор;

5) система микроанализа состава отдельных образцов.

Для исследования, полученные тонкоплёночные образцы наклеивались на держатель с помощью токопроводящей пасты. Исследование проводилось в режимах детектирования отраженных электронов (COMPO), а также в режиме детектирования вторичных электронов (SEI). С увеличением до 100000 раз и ускоряющим напряжением 10 кВ.

Средний размер частиц определяли по диаграмме дисперсности. Диаграмма дисперсности строилась по выборке на фотографии. Точность определения размера частиц ±1%.

Исследование производили непосредственно на момент синтеза, через месяц, полгода и год от их получения в рамках государственного задания, с использованием оборудования "Центра коллективного пользования диагностики структур и свойств наноматериалов" ФГБОУ ВПО Кубанский государственный университет (г.Краснодар).

Также производили оценку агрегативной устойчивости с помощью растворов электролитов NaCl и Na₃PO₄ в концентрациях 1%, 5% и 10% соответственно на момент синтеза, через месяц, полгода и год от его начала. Измерение оптической плотности полученных растворов проводилось на фотометре КФК-3.

Рисунок 7 - Фотометр КФК - 3

Принцип действия фотометра основан на поочередном измерении потоков излучения с выхода монохроматора: , прошедшего через «холостую» пробу (растворитель или контрольный раствор) и Ф, прошедшего через исследуемый раствор; преобразовании их фотоприемником в электрические сигналы , U и ( - сигнал при неосвещенном фотоприемнике) и представлении их на индикаторе в виде коэффициентов пропускания, оптической плотности, скорости изменения оптической плотности и концентрации исследуемых растворов.

В качестве тест-штаммов работе использованы 15 клинических изолятов P. aeruginosa, A. baumanii и E. coli (по 5 штаммов каждого микроорганизма). Идентификацию выделенных культур проводили бактериологическим методом с использованием автоматического анализатора VITEK. Для определения минимальной эффективной концентрации наносеребра в препарате изучали его противомикробное действие в концентрации 10 мкг/мл; 8 мкг/мл; 5 мкг/мл; 3 мкг/мл; 1 мкг/мл. Чувствительность клинических изолятов P. aeruginosa, A. baumanii и E. coli к наночастицам серебра определяли методом серийных разведений в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Результаты учитывали после 18-20-часового культивирования в термостате при 37 °С. Контрольные высевы из разведений с отсутствием видимого роста бактерий осуществляли на среду АГВ. Питательную среду АГВ готовили из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя и автоклавировали 20 минут при 121 °С.



РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

При анализе данных электронной микроскопии полученных растворов наночастиц серебра можно отметить следующее: при получении наночастиц описанным выше методом порядка 25% наночастиц имеет средний размер 20-30 нм, 50% частиц - средний размер приблизительно 10-15 нм (рис. 8), спустя месяц распределение по размерам принципиально не изменяется. Через полгода и год от момента их получения 50% частиц имели средний размер 20-30 нм, а доля частиц с размером 10-15 нм снизилась до 30 %. Максимум оптической плотности водных растворов наночастиц серебра, измеренный на фотоэлектрокалориметре, находился в области 410 нм (рис. 9) и оставался неизменным по прошествии всех указанных выше временных промежутков от момента синтеза, что также говорит о минимальной агрегации частиц при хранении.