Рисунок 8 - Электронная микроскопия наночастиц серебра, полученных с применением ультразвука на момент синтеза.

Рисунок 9 -Оптические спектры поглощения раствора наночастиц серебра, полученных с применением ультразвука на момент синтеза.

Анализ агрегативной устойчивости показал, что полученные растворы устойчивы на всем диапазоне концентраций растворов NaCl и Na₃PO₄ на всем промежутке хранения от момента их получения.

Также были синтезированы водные растворы наночастиц серебра того же качественного и количественного состава, но в отсутствии ультразвуковых волн в процессе их получения. Проведенная электронная микроскопия показала, что в данных образцах наблюдался больший разброс по размерам частиц: по размерам частицы можно разделить на два вида: со средним размером 20 нм (приблизительно 50%) и средним размером около 100 нм (50%) (рис. 10).

Спустя месяц доля частиц с размером 100 нм возросла до 70%, а через полгодаи год, частицы образовали крупные бесформенные агрегаты размером более 1 мкм и сорбированными на поверхности частицами со средним размером 20 - 30 нм. По данным фотоэлектрокалориметрии происходило смещение максимума поглощения раствора с течением времени от 440 нм до 480-500 нм (рис. 11), что также говорит об агрегации наночастиц.

При исследовании агрегативной устойчивости полученных растворов выявили коагуляцию к 5% растворам NaCl иNa₃PO₄непосредственно после синтеза и ее наличие спустя один месяц после синтеза и к 1% растворам NaCl и Na₃PO₄,что связано с укрупнением наночастиц.

Рисунок 10 -Электронная микроскопия наночастиц серебра, полученных без применения ультразвука на момент синтеза.

Рисунок 11 -Оптические спектры поглощения раствора наночастиц серебра, полученных без применения ультразвука на момент синтеза.

Установлено, что нитрат серебра в концентрации 1 и 10 мкг/мл не обладает антимикробной активностью по отношению к исследуемым клиническим штаммам P. aeruginosa и A. baumanii: все тест-культуры давали видимый рост в жидкой питательной среде с препаратом (табл. 1), но в то же время подавляет рост E. coli в концентрации 10 мкг/мл. При концентрации нитрата серебра 50 мкг/мл видимый рост в жидкой питательной среде отсутствовал, однако контрольные посевы были положительны для неферментирующих грамотрицательных бактерий и отрицательны для кишечной палочки (табл. 2). Полностью подавлял рост всех индикаторных штаммов нитрат серебра только в концентрации 100 мкг/мл. В этом разведении не регистрировалось видимого роста культур микроорганизмов, контрольные посевы также были отрицательны (табл. 2).

Таблица 1-Сравнительный анализ антимикробной активности растворов наносеребра, нитрата серебра и лиганда

Штаммы	Исследуемое вещество
	Нитрат серебра	Лиганд (поливинилпирролидон)	Наночастицы серебра
	Концентрация исследуемого вещества, мкг\мл
	100	50	10	1	100	50	10	1	100	50	10	1
	Количество штаммов, давших рост
P. aeruginosa	0	0	5	5	5	5	5	5	0	0	0	0
A. baumanii	0	0	5	5	5	5	5	5	0	0	0	0
E. coli	0	0	0	5	5	5	5	5	0	0	0	0

Лиганд (поливинилпирролидон) совершенно не обладал антимикробными свойствами в концентрацияхот 1 дл 100 мкг/мл: все тест - культуры давали видимый рост в жидкой питательной среде с препаратом(табл. 1).



Таблица 2-Количество положительных контрольных посевов при использовании растворов наносеребра, нитрата серебра и лиганда

Штаммы	Исследуемое вещество
	Нитрат серебра	Лиганд (поливинилпирролидон)	Наночастицы серебра
	Концентрация исследуемого вещества, мкг\мл
	100	50	10	1	100	50	10	1	100	50	10	1
	Количество штаммов, давших рост
P. aeruginosa	0	5	5	5	5	5	5	5	0	0	3	5
A. baumanii	0	5	5	5	5	5	5	5	0	0	2	5
E. coli	0	0	5	5	5	5	5	5	0	0	0	5

Коллоидный раствор с наночастицами серебра обладал антимикробной активностью во всех исследованных концентрациях (табл. 1): в соответствующих разведениях видимый рост бактерий отсутствовал. В то же время в концентрации 1 мкг/мл коллоидный раствор с наночастицами серебра обладал только бактериостатической активностью (контрольные посевы из этого разведения были положительны у всех 15 штаммов). В концентрации 10 мкг/мл коллоидный раствор с наночастицами серебра обнаружил бактериостатические свойства в отношении 3 штаммов P. Aeruginosa и 2 штаммов A. Baumanii, тогда как на остальные тест-культуры (40% штаммов P. Aeruginosa, 60% штаммов A. Baumanii, 100% штаммовE. coli) эта концентрация препарата действовала бактерицидно (табл. 2). Высокая бактериостатическая активность раствора с наночастицами серебра в отношении коллекционных условно-патогенных штаммов E. coli указывает на возможность использования полученного коллоидного раствора в концентрации 1 мкг/мл в качестве основы для моющих средств, в том числе в социальных учреждениях при наличии аллергических реакций на традиционные моющие средства (лизоформин, аламинол и другие) у персонала и посетителей.

В экспериментах по определению минимальной бактериостатической подавляющей концентрации наносеребра в коллоидном растворе установлено её значение на уровне 3 мкг/мл. На основании вышеизложенного можно заключить, что антимикробная активность по отношению к неферментирующим грамотрицательным бактериям убывает в ряду изученных средств: коллоидный раствор с наночастицами серебра > раствор нитрат серебра > лиганд. А наиболее эффективным является использование коллоидного раствора c наночастицами серебра.

Применение серебра на лабораторных животных

Рисунок 12 - Лабораторное животное (белая крыса).

Серебро с концентрацией 0,1 - 0,03 мг/л брали и наносили на марлю и прикладывали к ране. Процесс заживления наступал гораздо быстрее, чем при обычном лечении медицинскими мазями.

При моделировании хронического абсцесса у крыс, использовали двухэтапную модель окислительного стресса. Первый этап представлял собой острую фазу окислительного стресса и моделировался путем создания межмышечного абсцесса в мягких тканях длинных мышц спины лабораторного животного с использованием имплантированного инородного тела. Второй этап отражал хроническую фазу окислительного стресса и моделировался гнойной раной, которая формировалась естественным образом при дренировании абсцесса и удалении инородного тела.

Основой модели окислительного стресса явилась известная модель раневого процесса, предложенная Л.А. Мамедовым, в модификации (А.А. Басов и соавт., патент на изобретение № 2455703, 2012). Для создания модели абсцесса крысе до начала эксперимента срезали и выбривали шерсть на средней и нижней третях спины. Затем под местной анестезией раствором новокаина 0,5% (объемом 0,5 - 1,0 мл), иглой шприца наносилось повреждение мягких тканей (область длинных мышц спины) на глубине до 2 см шириной до 1 см в предполагаемой зоне формирования абсцесса. В день начала эксперимента под хлоралозо-нимбуталовым наркозом производился разрез скомпрометированной накануне области длиной 2 см и в мягкие ткани вводился стерильный марлевый шарик диаметром 10 мм, пропитанный 1 мл жидкости с патогенным штаммом St. aureus. На рану накладывались первичные швы.

Через сутки у животных появлялась клиника нагноения раны и начинался первый (острый) период моделирования окислительного стресса. Швы снимались через 5 суток с момента инфицирования, что соответствовало переходу во вторую фазу окислительного стресса. В дальнейшем проводилось местное лечение гнойной раны под мазевыми повязками (смена повязок с мазью «Левомеколь» 1 раз в 24 часа) до ее полного заживления вторичным натяжением.



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные результаты диссертационной работы состоят в следующем:

1. В процессе получения наночастиц серебра показан положительный эффект совместного применения физических факторов: ультрафиолетового излучения, ультразвука на формирование размера наночастиц и их дальнейшей устойчивости при хранении. Комплексное воздействие ультразвука в процессе синтеза наночастиц позволяет механически диспергировать крупные частицы или агломераты наночастиц, приводя тем самым к более однородному распределению и уменьшению их размера.

2. Полученный коллоидный раствор с наночастицами серебра обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении P. aeruginosa, A. baumanii и E. coli. Эффективность противомикробного действия раствора наносеребра превышает таковую исходного нитрата серебра и лиганда. В концентрации 10 мкг/мл у коллоидного раствора с наночастицами серебра обнаружены выраженные бактерицидные свойства в отношении 40% изученных штаммов P. aeruginosa, 60% штаммов A. baumanii и 100% штаммов E. coli. В концентрации 1 мкг/мл коллоидный раствор с наночастицами серебра обладал только бактериостатической активностью по отношению ко всем представленным в работе штаммам бактерий. Минимальная бактериостатическая подавляющая концентрация наносеребра была установлена на уровне 3 мкг/мл.

3. Полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности создания лекарственной и антисептической формы коллоидного раствора с наночастицами серебра с антимикробной активностью по отношению к P. aeruginosa, A. baumanii и E. coli. на основе разработанного способа диффузионно-кавитационного фотохимического восстановления серебра.

Материалы данной диссертации были опубликованы:

1 Оптимизация физико-химических условий, используемых для получения наночастиц серебра // Материалы 11 - й международной научной конференция, «Новизна за пределами науки», Лекарство Биологии, г. София, 15 - 22 мая 2015 г. - С. 77-82.

2 Изучение физико-химических условий, влияющих на процесс получения наночастиц серебра // Материалы 11 - й международной научной конференция, «Новизна за пределами науки», Лекарство Биологии, г. София, 15 - 22 мая 2015 г. - С. 75-76.



СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Воронина Н.В. Нелинейные неосесиметричные волны на заряженной поверхности электропроводной струи // М.В Волкова, Н.В Воронина // Актуальные проблемы физики. - 2005. - С. 73-80

2. Михиенкова А.И., Муха Ю.П. Наночастицы серебра: характеристика и стабильность антимикробного действия коллоидных растворов // Environment & health. - 2011.- № 1. - С. 55-59.

3. Золотухина Е.В., Кравченко Т.А., Пешков С.В. Способ получения наночастиц серебра. Патент на изобретение № 2385293 Российская Федерация. C01G 5/00, B82B 3/00. 27.03.2010. - Б. 9. - 7с.

4. Степанов А.Л. Особенности синтеза металлических наночатиц в диэлектрике методом ионной имплантации/ А.Л. Степанов // Журнал Технического университета Аахена, Германия. - 2007. - С. 2 - 7.

5. Рогач А.Л. Образование высокодисперсного серебра при восстановлении ионов Ag+ в водных растворах / В.Н. Хвалюк, В.С. Гурин // Коллоидный журнал. - 1994. - Т.56. - №12. - С. 276-278.

6. Парсаев А.А., Абхалимов Е.В., Якимова Е.Е., Ершов Б.Г. Получение наночастиц серебра в водных растворах, содержащих карбонат - ионы // Вестник МИТХТ. - 2010.- Т. 5, № 5. - С. 24-26.

7. Муха Ю.П., Еременко А.М., Смирнова Н.П., Михиенкова А.И., Корчак Г.И., Горчев В.Ф., Чунихин А.Ю. Антимикробная активность стабильных наночастиц серебра заданного размера // Прикладная биохимия и микробиология. - 2013.- Т. 49, № 2. - С. 215.

8. Азатян Б. В. Новые закономерности и некоторые новые проблемы в цепных процессах. / Б. В Азатян , - М.: - I981. - С. I6-I7.

9. Seaton A. Nanotechnology and the occupational physician / A. Seaton // Occupational medicine. - 2006. - Vol. 56, N 5. - P. 312 - 316.

10. Вегера А.В. Синтез и физико - химические свойства наночастиц серебра / А.В. Вегера, А.Д. Зимон // Московский государственный университет технологии и управления. - 2006. - C 5-12.

11. Рэлей Дж. У. Волновая теория света / Дж. У. Рэлей - М.: Л. - 1940. - С. 103 - 132.

12. Никитин А.В., Долгова Г.В., Свиногеева Т.П. Гепатотоксическое действие антимикробных и противогрибковых средств // Анналы хирургической гепатологии. - 2008. - Т. 13, № 1. - С. 24 - 28.

13. Schultz D.A. Plasmon resonant particles for biological detection / Curr. Opin. Biotechnol. - 2003. - Vol. 14. - P.13-22.

14. МУК 4.2.1890-04 «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»: методические указания. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России. - 2004. - 75 с.

15. Воронина Н.В., Упницкий А.А. Анализ нежелательных побочных реакций на лекарственные средства в ЛОР отделении стационара // Лечебное дело. - 2007. - № 3. - С. 25-28.

16. Ершов Б.Г. Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические и каталитические свойства / Б.Г. Ершов // Журнал российского химического общества им. Д.И. Менделеева. - 2001. - Т. XLV. - № 3. - С.5-9.

17. Goldsworthy A. Biological effects of physically conditioned water / A. Goldsworthy, H. Whitney, E. Morris // Wat. Res. - 1999. - Vol. 7. - №11. - P. 1618-1626.

18. Фабелинский И. Л. Молекулярное рассеяние света / И. Л Фабелинский .-М.: - 1965. - С. 24-56.

19. Андриевский Р.А. Физика металлов и металловедение/ Р.А. Андриевский, А.М. Глезер // М.: Физматлит. - 2000. - С.34-35.

20. Барковский В.Ф. Физико - химические методы анализа / В.Ф Барковский. - М.: Высшая школа - 1972.

21. Андриевский Р.А. Наноструктурные материалы/ Р.А. Андриевский, А.В Рагуля // М.: Академия. - 2005. - С. 192.

22. Гребенюк Г.С. Формирование сверх тонких пленок на поверхности монокристаллического кремния / Г.С.Гребенюк // Физика твердого тела. - 2011. - Т.53. - №12. - С. 22-23.

23. Кокшаров Ю.А. Наночастицы: методы получения, строение и свойства/ Ю.А. Кокшаров, Г.Б Хомутов, С.П Губин // Успехи химии. - 2005. - №74. - С. 7-9.

24. Meng Chen. Preparation and Study of Polyacryamide - Stabilized Silver Nanoparticles through a One-Pot Process / Chen Meng, Li - Ying Wang, Dong - Jin Qian // Department of Chemistry and Laboratory of AdVanced Materials, Fudan University. - 2006. - С. 34-38.

25. Марк Р., Даниэль Р. Нанотехнология: простое объяснение очередной гениальной идеи / Р Марк, Р Даниэль // М.: Вильямс. - 2006. - 240 c.

26. Треушников В.М. Одностадийные фотохимические процессы формирования полимерных изделий медицинского назначения / Д.В Сивухин // В сб. трудов конференции. Общий курс физики. Атомная ядерная физика // М/: Физматлит. - 2002. - 784. c.

27. Костюченок Б.М. Основы гнойной хирургии / И.В. Вигдорчик, Ю. Е. Березов. - М.: Медицина, 1976. - 382 с.

28. Современные полимерные материалы медицине и медицинской технике. Санкт-Петербург. - 2005.

29. Нанотехнологии, биология и медицина / В.Н. Кеменов, С.Б. Нестеров.- М.: МИЭМ, 2002. - С. 248 -253.

30. Christian P. Hofmann Th. Nanoparticles: structure, properties, preparation and behavior in environmental media / F. Von der Kammer, M. Baalousha // Ecotoxicology. -- 2008. -- Vol 17. -- P. 326-343.

31. Рубина А.Б. Современные методы биофизических исследований. Практикум по биофизике, под редакцией // Москва: Высшая школа. - 1988.

32. Huber G. How to conduct a qualitative analysis / Analysis of qualitative data with AQUAD5. - 1997. - P. 23-36.

33. Dr. Peter Bodlaender. Evolution of TSH Assays / A Third Generation Viewpoint. - 1994.

34. Федоров В.Д., Светухин А.М. Лекции по гнойной хирургии. - М.: Миклош, 2005. - 365 с.

35. Бессонов Л.А. Теоретические основы электротехники /Л.А. Бессонов. - М.: Высшая школа, 1964. - 752 с.

36. CarolinF.D., Горовцов А.В., NadineS.F. Сравнение скорости подавления роста e.coli, staphylococcusaureus и pseudomonasaeruginosa современными антисептиками с целью их применения для инфицированных ран / F.D Carolin., А.В. Горовцов., S.F NadineS.F // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 10. - С. 321-327.

37. Русина И.Ф. Хемилюминесцентный метод определения содержания антиоксидантов в нативной плазме крови крыс при патологии и в процессе лечения панкреатита / И.Ф. Русина // Биохимия. - 2001. - Т.42. - № 4. - С. 237-239.

38. Шилова А. К. Кинетика и катализ. - 1969.

39. Емец Б.Г. О физическом механизме влияния низкоинтенсивного электромагнитного излучения на биологические объекты / Б.Г. Емец // Биофизика. - 1999. - Т.44. - № 3. - С. 457-513.

40. Гуревич А.Г. Теория биологического поля / А. Г. Гуревич. - М.: Наука, 1999. - 386 с.

41. Сергеев Б.М. Получение наночастиц серебра в водных растворах полиакриловой кислоты / Б.М.Сергеев, М.В. Кирюхин, А.Н. Прусов // Вестник Московского Университета. Серия 2. Химия. - 1999. - Т.40. № 2. - С. 129-133.

42. Кулаков Ю.А. Электронная микроскопия. /- М.: Знание.-1981.- 64 с.

43. Каплан И. Г. Успехи физ. наук. /- M.: - 1975 - T. - № 117 - В. 4. - С.691-704.

44. Кузьмина Л.Н.Получение наночастиц серебра методом химического восстановления / Л.Н. Кузьмина, Н.С. Звиденцова, Л.В Колесников // Журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева. - 2007. - Т. XХХ, № 8. - С.7-12.

45. Coronato Courrol Lilia A simple method to synthesize silver nanoparticles by photo-reduction / Lilia Coronato Courrol, Flavia Rodrigues de Oliveira Silva, Laercio Gomes // EPUSP. - 2007. - Vol.18. № 6. - Р. 12 - 16.

46. Wanzhong Zhang Synthesis of silver nanoparticles--Effects of concerned parameters in water oil microemulsion / Wanzhong Zhang, Xueliang Qiao, Jianguo Chen // State Key Laboratory of Material Processing and Die Mould Technology. - 2007. - Р. 17 - 21.

47. Боуэн Д.К. Высокоразрешающая рентгеновская дифрактометрия и топография /Б.К Таннер.,Д.К. Боуэн // Наука. - 2002. -C. - 274.

Размещено на Allbest.ru