Морфологічні властивості мікроорганізмів

Рис. А.4. Морфологія різних видів спірохет: а -- борелія; б -- трипонема, в -- лептоспіра; г -- спірохета; д -- кристиспіра

Серед спірохет є вільноживучі форми, які зустрічаються у прісних та солоних озерах, донних відкладеннях (Spirochaeta plicatilis, S. isovalerica). Деякі спірохети є патогенними для людини (Treponema pallidum - збудник сифілісу, Leptospira interrogans - збудник інфекційної жовтухи, Borrelia duttoni, B. persica - збудник зворотного тифу) [2].

В окрему морфологічну групу можуть бути виділені мікобактерії (нитчасті). Прямі, або зігнуті палички, іноді можуть галузитись, можливе утворення ниток, або міцелієподібних утворень (рис. А.5.) Це переважно одноклітинні та багатоклітинні мікроорганізми. Їхні нитки утворені багатьма клітинами, з'єднаними за допомогою слизу, чохлів, піхв, плазмодесмів тощо. Нитчасті є переважно водяними мікробами. Нитки трихомних бактерій можуть вільно плавати у воді (Begiattoa alba, ціанобактерії родів Oscillatoria, Spirulina) або бути прикріпленими до субстрату (Thiotrix nivea). [3] Але ці структури легко розпадаються на палички або коки. Представники: Mycobacterium tuberculosis. M. leprae [20].

Рис. А.5 Нитчасті бактерії: 1 -- Beggiatoa; 2 -- Thiothrix; 3 - Saptospira; 4- Simonsiella; 5 - Caryophanon; 6 -- ціанобактерії роду Microcoleus; 7- Leptotrix; 8 -- Sphaerotilus; 9 -- Сrenothrix.

Отже, мікроорганізми здатні формувати асоціації різноманітного рівня складності -- трихоми, агрегати правильної чи неправльної форми, а також стабільні чи нестабільні “спільноти” з іншими видами мікроорганізмів чи тканинами еукаріотів [22].

Крім перелічених основних форм прокаріотів, виявлені бактерії, які мають незвичну форму. Бактерії незвичної форми морфологічно різноманітні: тороїдальні (Microcyclus major, M. aquaticus), тубероїдні, червоподібні, нагадують правильну шестикутну зірку (рід Stella), пласкі квадратові пластинки, гантелі, черв'якоподібної форми. Архебактерії роду Haloarcula мають форму плоских неправильних трикутників і прямокутників. Вони беруть участь у процесах біодегратації природніх органічних сполук [3].

Деякі одноклітинні бактерії утворюють різноманітні вирости. Ці вирости можуть бути у вигляді простек, або стеблинок (рис. А.6.) .

Мал. А.6. Бактерії, які здатні утворювати вирости: 1- Caulobacter; 2- Hyphomicrobium; 3 - Ancalomicrobium; 4 -- Gallionella

Кількість простек може бути різною, від однієї до декількох. До того ж, простеки можуть роздвоюватись. Кількість, розмір, розташування простек є диференційною ознакою для визначення роду. Представники: Ancalomicro-bium adetum, Asticcacaulis excenticus.

Стеблинка - неклітинний виріст, не містить цитоплазми і не оточений клітинною стінкою. Клітини кокоподібні, овальні, грушоподібні [16]. Не мають пептидоглікану. Утворюють розетки або нитки. Представник: Planctomyces bekefii [20].

Слід зазначити, що більшість бактерій характеризується постійністю форми завдяки клітинній стінці. Але є бактерії для яких, характерним є плеомофізм.

Люта В. А. (2001) тлумачить поняття плеоморфізму так: “Плеоморфізм -- це здатність змінювати форму під дією різних факторів (антибіотиків, дезінфекційних розчинів, умов культивування)” [12]. Також, під плеоморфізмом розуміють різноманітність форм і розмірів мікроорганізмів залежно від віку та стадії розвитку, що зумовлюється індивідуальною мінливістю [19].

Ще в 1850 р. було опубліковано дані про зміну морфологічних форм в циклі розмноження іржастих та сажкових грибів. Ця публікація поклала початок дискусії про плеоморфізм та мономорфізм бактерій. Деякі дослідники вважали, що одна і та ж бактерія може існувати в різноманітних формах (плеоморфізм), обумовлюючи при цьому хвороби і утворюючи різні продукти метаболізму, залежно від умов росту. Прибічниками даних тверджень були такі авторитетні вчені як Т. Більрот, К. Негелі, Є. Хеліер, Дж. Лістер, Р. Ланкастер і Цонф. Інші вчені, такі як Пастер, Кон, Кох і О. Брефельд, доводили важливість вивчення чистих культур і, таким чином, підкреслювали важливість експериментів. Отже, визнання мономорфізму, тобто постійності видів бактерій, потребувало багато часу. Твердження про постійність бактерійних видів звісно викликало сумніви, адже дослідники спостерігали мінливість і мутації навіть в чистих культурах [22].

Плеоморофізм властивий таким видам бактерій як: Corynebacterium diphtheriae, Arthrobacter globiformis, нокардіобактерії, в яких в циклі розвитку спостерігається зміна форми клітин: кок-паличка-кок. До плеоморфних бактерій також належать мікоплазми (Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma mycoides , L- форми, клітини яких не мають постійної форми [20].

У процесі росту форма клітин може суттєво змінюватись від коків до паличок (і навпаки), неправильних форм, розгалужених ниток [9]. Мікроорганізми дуже пластичні і легко змінюються під впливом факторів середовища (антибіотики хімічні реагенти, підвищена або понижена температура, концентрація солей, кислотність, продукти метаболізму, дезинфікуючі агенти, лікарські засоби, інгібітори організмі тощо). В результаті можуть виникати незвичайні за формою і розміром клітини (інволюційні форми): дуже збільшені, роздуті, кулясті, колбоподібні або ниткоподібні. Вони ревертують до вихідних форм, коли дія факторів, що індукували їхнє утворення, припиняється [9, 19].

Такі зміни морфології пов'язані з порушенням або синтезу клітинної стінки бактерій, або механізму регуляції їх клітинного поділу.

Необхідно зауважити, що бактерії характеризуються високим ступенем поліморфізму (індивідуальна множинність форми, що не передається спадково) особливо під час культивування на синтетичних поживних середовищах

Властивість мікроорганізмів змінюватись під впливом різних факторів навколишнього середовища враховують у лабораторній діагностиці інфекційних захворювань, при виготовленні інфекційних препаратів, що застосовуються з інфекційною та лікувальною метою [13, 19].

Під час ідентифікації бактерій необхідно враховувати, що при частковому розчиненні клітинної стінки під впливом лізоциму (Salton, 1952) або інших факторів паличкоподібні (переважно грамнегативні) клітини перетворюються у сферичні тіла, що дістали назву сферопласти. Також існують і протопласти, які утворюються в результаті пригнічення синтезу клітинної стінки, що веде до порушення координації між ростом і поділом клітини; найчастіше це буває під впливом пеніциліну. Морфологічно вони являють собою крупні кулясті і ниткоподібні плазматичні структури. До протопластів відносять L-форми бактерій. Розрізняють стабільні і нестабільні L-форми. Стабільні за своїм властивостями дуже подібні до мікоплазм [19].

Отже, мікроорганізми у порівнянні з еукаріотами характеризується значною одноманітністю морфологічних форм.

Класифікація мікроорганізмів за Бергі

У дев'ятому виданні Визначника бактерій Бергі всі виявлені організми, віднесені в царство Prokaryotae, розділені на 35 груп.

Група 1. Спірохети. Включає порядок Spirochaetales. Тонкі спіралевидні одноклітинні форми, що володіють своєрідною морфологією й способом руху. Довжина клітин коливається від 5 до 250 мкм. Схильні до утвору аномальних форм (гранул, цист). Клітини складаються із протоплазмового циліндра, аксіальної нитки й зовнішньої оболонки. Оболонка тонка й еластична, що й забезпечує спірохетам своєрідний спосіб пересування. Грамнегативні.

Група 2. Аеробні, рухливі спіралеподібні або вигнуті грамнегативні бактерії. Прокаріоти, що входять у цю групу, мають тверду клітинну стінку, так що клітина свою форму не змінює. Рух здійснюється за допомогою одного або безлічі полярно розташованих джгутиків.

Група 3. Нерухливі грамнегативні вигнуті бактерії. Включає сімейство Spiromonaceae, що поєднує облігатно аеробні форми з характерною клітинною морфологією: від прямих паличок до кілець, не повністю або повністю закручених; при цьому в культурі одночасно можуть бути присутнім клітини різної форми.

Група 4. Грамнегативні аеробні палички й коки. Група представлена восьма родинами. До родини Pseudomonadaceae відносяться поодинокі прямі або злегка вигнуті рухливі палички. Рух здійснюється за допомогою полярно розташованих джгутиків. Типові представники родини об'єднані в рід Pseudomonas.

Група 5. Факультативно анаеробні грамнегативні палички. Поєднує 3 родини: зокрема Enterobacteriaсеае. До складу першої родини належать рухливі або нерухливі неспороутворюючі палички. Деякі види утворюють капсули.

Група 6. Анаеробні грамнегативні прямі, вигнуті або спіралевидні палички. Це палички правильної форми або схильні до плеоморфізму, неспороутворюючі, нерухливі або рухливі.

Група 7. Бактерії, що характеризуються дисиміляційним відновленням сірки або сульфату. У складі групи еубактерій з різною морфологією й наступними однаковими властивостями: грамнегативні строгі анаероби.

Група 8. Анаеробні грамнегативні коки. Представлені однією родиною Veillonellaceae. Коки, як правило, з'єднані попарно, але можуть утворювати ланцюжки або скупчення клітин.

Група 9. Рикетсії й хламідії. До складу групи включено два порядки: Rickettsiales і Chlamydiales. Перший поєднує бактерії, що характеризуються в більшості випадків сукупністю наступних ознак: плеоморфні, нерухливі, грамнегативні, з типовими для еубактерій клітинними стінками, що розмножуються розподілом всередині клітин-хазяїв. Серед рикетсій є рухливі види, що фарбуються позитивно по Граму.

Група 10. Мікоплазми. До них відносяться форми, у яких відсутня клітинна стінка. Таксономічне значення цієї ознаки дозволила всі прокаріоти, що не мають клітинної стінки, виділити в групу, привласнивши їй ранг відділу. Для них характерний яскраво виражений поліморфізм. У культурі одного виду можна одночасно виявити великі кулясті тіла, дрібні зерна, клітини еліпсовидної, дископодібної, паличкоподібної й ниткоподібної форми. Останні можуть галузитись, утворюючи структури, подібні міцеліальним.

Група 11. Ендосимбіонти. У цю групу виділені прокаріоти -- ендосимбіонти найпростіших, комах, грибів і безхребетних. Для більшості представників ендосимбіоз облігатний і їх не вдалося культивувати в лабораторії в чистій культурі.

Група 12. Грампозитивні коки. До складу групи входять представники 15 родів, що значно різняться філогенетично й фенотипічно.

Бактерії, поєднувані в сімейство Micrococcaceae -- коки, що діляться більш ніж в одній площині, схильні не розходитися після поділу й тому утворюючі скупчення сферичної або неправильної форми.

Група 13. Грампозитивні палички й коки, що утворюють ендоспори. У складі групи представники 6 родів. Два з них (Bacillus і Clostridium) найбільш численні й цікаві. Рід Bacillus поєднує рухливі паличкоподібні клітини, розміри яких коливаються в досить широких межах. Джгутики розташовані перитрихіально. Фарбування по Граму по-різному: позитивно або позитивно тільки в молодій культурі. До складу роду Clostridium входять палички, що відрізняються від попереднього роду формою спороутворення й облігатно анаеробним способом існування.

Група 14. Грампозитивні палички правильної форми. Група -- конгломерат, що складається з 7 родів, об'єднаних декількома загальними морфологічними й фізіологічними ознаками: клітини паличкоподібної форми (від кокоподібних до подовжених, від поодиноких до здатних утворювати ланцюжки).

Група 15. Грампозитивні палички неправильної форми. Група різноманітна. Більшість -- грампозитивні палички неправильної форми, що ростуть у присутності повітря й не утворюють ендоспор, але є в групі бактерії, що мають форму коків або паличок правильної форми, що зафарбовуються негативно по Граму, що і є строгими анаеробами.

Так, до роду Corynebacterium відносяться форми, схильні до морфологічної мінливості. Крім коротких паличок у культурі можна виявити кокоподібні форми, клітини, що мають булавоподібні випинання, слабкорозгалуджені форми. Для представників цього роду характерний утворення фігур, що складаються із розташованих під кутом або, що примикають друг до друга дочірніх клітин.

Група 16. Ковзаючі бактерії, які утворюють плодові тіла. Джгутики відсутні. Не здатні до ковзання по твердій поверхні. За нестачі поживних речовин клітини здатні агрегуються з утворенням плодових тіл, що формуються з видозміненого слизу та клітин, часто яскраво забарвлені і видимі неозброєним оком. Їх плодові тіла варіюють за будовою від простих грудочок до складних структур.

Група 17. Грампозитивні коки. Не здатні утворювати спори. Серед яких виділяють:

аеробні коки, які можуть розташовуватись попарно, тетрадами та утворювати скупчення;

факультативні анаеробні чи мікроаерофільні коки, які розташовуються попарно, утворюють ланцюги, кластери, тетради;

строго анаеробні коки, які зустрічаються в парах, тетрадах чи пакетах кубічної форми.

Група 18. Грампозитивні коки і палички, які утворюють ендоспори. Серед коків лише один рід ж рухомим (в тетрадах чи кубічних пакетах). Частіше виявляють рухомі палички.

Група 19. Грампозитивні палички правильної форми, які не утворюють спор. Паличковидні клітини (від коковидних до видовжених паличок чи ниток), Незабарвлені (лише для одного роду характерна світло-жовта пігментація).

Група 20. Грампозитивні палички не правильної форми, які не утворюють спор. У деяких моєуть бути присутні булавовидні форми, ниткоподібні елементи чи одночасно палички або ниткоподібні елементи і коковидні форми. Деяким видам характерний цикл розвитку палички/коки. Один з родів включає в себе організми від грамнегативних до грам варіативних.

Група 21. Мікобакетрії. Аерлбні, нерухомі, спор не утворюють. Мають паличковидну форму, характеризуються кислотостійкістю. За Грамом фарбуються слабко. Іноді утворюють нитки, що галузяться. Повітряний міцелій не утворюють.

Група 22-29 Актиноміцети. Грампозитивні бактерії. Утворюють нитки, що галузяться чи гіфи у вигляді міцелія, який має бути стабільним чи розпадатися на паличковидні чи коковидні елементи. Деякі види мають джгутики.

Група 31. Метаногени. Суворо анаеробні. Здатні утворювати метан як кінцевий продукт метаболізму. Можуть давати синьо-зелену флуоресценсію при опроміненню світлом з довжиною хвилі 420 нм.

Група 32. Сульфадредукуючі археї. Суворо анаеробні, здатні утворювати із сульфату в процесі дисиміляційної сульфатредукції. При мікроскопії в УФ виявляють синьо-зелену флуоресценсію.

Група 33. Галорбактерії. Грамнегативні чи грампозитивні бактерії. Клітини паличковидні, форма від правильної до вираженої неправильної.

Група 34. Архебактерії, що позбавлені клітинної стінки. Мають коковидні клітини, позбавлені клітинної стінки.

Група 35. Екстремальні термофіли і гіпертермофіли, метаболізуючі [15].

ДОДАТОК Б

Розміри клітин мікроорганізмів

Розміри як і форма мікроорганізмів мають визначене таксономічне значення і є важливим критерієм при їх ідентифікації, оскільки це відносно стабільні ознаки у суворо визначених умовах культивування на штучних поживних середовищах [2].

Розміри бактеріальних клітин сильно варіюють (табл. Б.1.). Зазвичай вони занадто малі для того, щоб їх можна було виявити неозброєним оком. Але є виключення -- бактерія Epulopiscium fishelsoni, розмір якої в мільйон раз перевищують об'єм, порівняно з рештою бактерій [22].

Діаметр сферичних бактерій становить від 0,2 до 0,25 мкм. Найменшими є мікоплазми (0,15 мкм). Цей розмір є теоретичною межею клітинного рівня організації життя, у якому в клітині ще може бути мінімум молекул білка (1200) і мінімум ферментативних реакцій, необхідних для підтримання клітинної структури. До того ж, розміри клітин мікроорганізмів суттєво можуть суттєво змінюватись під впливом чинників зовнішнього середовища. Під дією кислот і лугів, зміні температур, через накопичення продуктів обміну у середовищі існування та інших факторів, клітини зазнають змін [14].

Таблиця Б.1

Розміри деяких бактерій

Найменування бактерій	Довжина клітини, мкм	Діаметр клітини, мкм
Молочнокислий стрептокок	0,8-1,2	0,5-0,8
Вершковий стрептокок	0,6-0,7	0,6-0,7
Паличка болгарська	4,0-0,5	0,6-1,0
Ацидофільна паличка	1,5-6,0	0,6-0,9
Паличка протея	0,6-4,0	0,4-0,5
Кишкова паличка	1,2-0,3	0,5-0,8
Паличка бруцельозу	0,5-2,0	0,2-0,5

З наведених даних випливає, що розміри бактерій коливаються від 0,2 до 10 мкм (більшість з них має розміри від о,5-0,8 мкм до 2-3 мкм) [12]. Так, паличкоподібні бактерії мають товщину 0,5-1,0 мкм, довжину від 1-2 до 10 мкм. Нитчасті форми можуть досягати макроскопічних розмірів (1 мм) їх можна побачити неозброєним оком. Довжина спірохет коливається від 1-3 до 100-500 мкм. Більшість патогенних мають розміри 0,2 -- 10 мкм [13]. Серед сапрофітів трапляються, велетенські бактерії, що досягають 55-125 мкм. Нижній розмір одноклітинних бактерій визначається простором, необхідних для упаковки апарату, який забезпечує незалежне існування клітини, верхній -- оптимальним співвідношенням між поверхнею клітини та об'ємом [13].

ДОДАТОК В

Здатність до утворення спор та розташування спор в бактеріальній клітині

Кон вперше спостерігав спори сінної палички (1877), названої пізніше Bacillus subtilis. Описані Р. Кохом Bacillus antrhracis підтвердило значення ендоспор як диференціальної ознаки для класифікації бацил [22].

На думку Борисова (2005), спори бактерій можна розглядати як форму збереження спадкової інформації клітини бактерій в несприятливих умовах зовнішнього середовища [2]. Здатністю до утворення ендоспор володіє порівняно невелике число як патогенних, так і непатогенних бактерій. Ця властивість виявлена у представників 15 родів, які відрізняються морфологічною і фізико-хімічною різноманітністю. Серед них є паличкоподібні, сферичні, спіральні, нитчасті форми. Усі вони мають клітинну стінку, характерну для грампозитивних бактерій, хоча деякі з них не фарбуються за Грамом [9]. До першої групи відносять бактерії родів Bacillus, Clostridium, а до непатогенних -- сапрофітні представники згаданих родів і деякі коки. В цілому, до спороутворюючих відносять такі види бактерій: Amphibacillus, Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Oscillospira, Sporohalobacter, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Syntrophospora, Sulfobacillus [13].

При мікроскопічному дослідженні спори можна побачити завдяки високому заломленню світла. Спори містять усю суху речовину материнської клітини, хоча займають у 10 разів менший об'єм.

Спори являють собою округлі, овальні чи еліпсовидні утворення. Бакеріальні ендоспори -- це особливий тип спочиваючих клітин грампозитивних бактерій, які мають специфічні структури: багатошарові білкові покриви, зовнішню та внутрішню мембрани, кортекс, іноді екзоспоріум.

Спори різних видів мають різну форму, розміри, характер поверхні та локалізацію у клітині (рис. А.7.). Якщо діаметр спори не перевищує діаметр клітини, в якій утворюється спора, то клітина належить до бацилярного типу. У тілі бацил і клостридій спори можуть розташовуватись: центрально (збудник сибірки), субтермінально (збудники ботулізму, анаеробної інфекції та ін.), термінально (збудник правця). Якщо ж діаметр перевищує, то в залежності від розташування спори (в центрі чи на кінці клітини) -- клостридіальний чи плектридіальний. В бацилярній клітині спора може розташовуватись як в центрі клітини (центральне розташування) і на кінці клітини (термінальне), ближче до одного з кінців (субтермінальне), і при цьому клітина не змінює своєї форми. Такі клітини називають бацилами (Baccilus). Спори можуть займати клостридіальне положення в клітині. В даному випадку при формуванні спори клітина змінює форму, набуваючи вигляду човника чи веретена. Такі клітини називають клостридіями (Clostridium, від грец. Closter - веретено) [9]. В клостридій діаметр спор перевищує діаметр бактеріальної клітини. Плектридіальне розташування характеризується тим, що спора локалізуються термінально, у місці її розміщення клітина розширюється і набуває форми ракетки. Клостридіальний і плектридіальний типи розміщення спор властиві в основному видам роду Clostridium і нерідко одночасно зустрічаються в культурі одного виду При субтермінальній локалізації спор такі особини стають веретеноподібними. До них належать клостридії молочнокислого бродіння (C. Butyricum) [13]. У клостридій правця діаметр спори перевищує її ширину, але розміщується спора на кінці клітини, в результаті чого мікроорганізм за формою нагадує барабанну паличку. До того ж, в анаеробних бактерій на спорах утворюються різноманітні за формою відростки: фібрилярні, стрічкоподібні, булавовидні тощо. Вони формуються перед закладанням кортексу з білків або полісахаридів. Їхня функція остаточно не з'ясована [16].

Рис. А.7 Схематичне зображення типових форм спор та їхня локалізація у клітинах бактерій: 1- термінально розміщена спора з білковим включеннями; 3 -- термінальна спора булавоподібна; 4 -- центральна спора клостридієподібна; 5 -- кругла термінальна спора; 6 -- латеральна спора.

Спороутворення -- один із найскладніших процесів диференціації бактеріальної клітини. Вважається, що цей процес принципово однотиповий у всіх видів, які мають ендоспори. У кожній бактеріальній клітині формується тільки одна ендоспора. Найкраще процес спороутворення досліджений у представників родів Bacillus та Clostridium, зокрема Bacilus subtilis, Streptomyces та Myxococcus xanthus.

Виділяють сім етапів спороутворення (рис. А.8.). Споруляція починається після завершення логарифмічної фази росту, відрахунок стадій спороутворення -- після останнього клітинного поділу.



Рис. А.8Схематичне зображення формування ендоспори спороутворюючими бактеріями: 1- нуклеоїд; 2 - цитоплазма; 3 - ЦПМ; 4 - клітинна стінка; 5 - спорова перегородка; 6 -зовнішня мембрана спори; 7 - внутрішня мембрана спори; 8 - кортекс; 9 - покриви спори; I -вегетативна клітина; II - на одному з полюсів клітини відбувається ущільнення цитоплазми; III - формування септи; IV -мембрана більшої клітини та її цитоплазма оточує меншу клітину; V- утворюється проспора; VI - утворюється кортекс; VII - завершується дозрівання спор; VIII -лізис материнської клітини та звільнення спори; IX -вільна зріла спора; X -проростання спори

На початковій стадії клітина містить один або декілька нуклеоїдів.

На першій стадії у клітині з'являється поздовжнє хроматинове тіло (осьовий тяж), з'єднане через мезосому з цитоплазматичною мембраною. Ця стадія спороутворення є оборотною, і в разі перенесення клітин у повноцінне поживне середовище відновлюється поділ нуклеоїда і клітини.

На другій стадії осьовий тяж ділиться на дві частини: велику -- нуклеоїд спорангія (спороутворююча клітина) та малу -- нуклеоїд майбутньої спори. Малий нуклеоїд локалізується на полюсі клітини. Цей поділ супроводжується появою перегородки, що утворюється за рахунок інвагінації цитоплазматичної мембрани. Проте після появи перегородки не утворюється поперечна стінка, як це простежується в разі клітинного поділу. Замість цього мембрана більшої частини клітини (спорангія) та її цитоплазма оточують меншу частину клітини. Отже, утворюється проспора, оточена двома частинами мембрани - зовнішньою та внутрішньою. На цьому завершується третя стадія, після якої процес спороутворення стає необоротним. Наступна стадія характеризується утворенням специфічної оболонки спори -- кортексу. Він формується між мембранами проспори з пептидоглікану певної структури.

На п'ятій стадії спору оточують білкові оболонки, що становлять від 30 до 60% її ваги. Спори на цій стадії є оптично активними та стійкими до дії різних факторів середовища.

У багатьох бактерій ззовні білкових оболонок формується екзоспоріум, який складається з ліпідів та білків і виконує захисну функцію.

На шостій стадії завершується дозрівання спор. Воно супроводжується певними хімічними перебудовами, а саме: синтезом дипіколінової кислоти. Спори на цій стадії стають термостійкими.

На завершальній стадії відбувається лізис спорангія та звільнення спори. Утворені спори містять незначну кількість води ( до 15% від маси спори) і перебувають у стані анабіозу.

Спори не є обов'язковою стадією життєвого циклу бактерій. Утворення спор простежується лише тоді, коли не вистачає поживних речовин, або ж в разі надмірного нагромадження окремих продуктів метаболізму [16].

За спритливих умов спори проростають. Спочатку вони поглинають зі середовища значну кількість води, набрякають. Потім відбуваються глибокі фізіологічні зміни, активуються ферментні системи, інтенсифікується дихання. Ці процеси супроводжуються виділенням зі спори амінокислот, дипіколінової кислоти, іонів кальцію, мономерів пептидоглікану (до 30 % маси спори). У цей час спори втрачають термостійкість. У проростаючій спорі починається синтез РНК та білків, а через одну-дві години після початку цього процесу -- синтез ДНК. Руйнуються кортекс, оболонки спори, і ростова трубка виходить назовні на кінці або збоку спори (полярне та екватооріальне проростання) [9].

Здатність організмів до спороутворення використовується в їх систематиці [19].

ДОДАТОК Д

Здатність до руху і характер розташуванням джгутиків

Джгутики вперше описав Кон в 1872 році, а Р. Кох (1877) та Ф. Лефлер (1877) розробили методики їх фарбування [22].

Кількість та розташування джгутиків у різних бактерій неоднакова, окрім того вони притаманні не всім бактеріям. Проте розташування джгутиків у певних видів є стабільним і часто використовується як диференційна ознака [2]. Особливо важливим даний критерій для виявлення паличкоподібних грамнегативних бактерій [9]. До того ж, кількість джгутиків, їхня локалізації, діаметр, амплітуда спіралі генетично детерміновані і є таксономічною ознакою для певних груп бактерій [18].

За кількістю та розміщенням джгутиків мікроорганізми (рис. Г.1.) поділяють на:

монотрихи: Клітина має один джгутик, локалізований на одному з полюсів клітини (холерний вібріон).

Розташування декількох (пучка) джгутиків на одному з полюсів клітини отримало назву лофотрихального (паличка синьо-зеленого молока, Alcalignes faecalis). Пирог Т.П. (2004), під лофотрихами тлумачить бактерії з монополярно-політрихальним розміщенням джгутиків (Pseudomonas, Chromatium).

Бактерії, які містять один або декілька джгутиків на обох полюсах клітини, називають амфітрихами (Spirillum volutants). Дані види бактерій мають біполярно -- політрихальне розміщення джгутиків.

Якщо ж джгутики розташовані по всій поверхні бактеріальної клітини, то такий тип джгутикування називають перитрихальним (сальмонели черевного тифу, паратифів А і В, ешерихії).

Рис. Г.1. Типи розташування джгутиків у бактерій: 1- монотрихальне;

2 -- лофотрихальне; 3 -- латеральне; 4 -- амфітрихальне;

5 -- перетрихальне; 6 -- “зміщене” полярно-перетрихальне

Наведена класифікація є умовною. За допомогою електронної мікроскопії виявлено, що в деяких монотрихів джгутик міститься не на кінці тіла, а в місці переходу бокової поверхні до полюса, а амфітрихи -- це дві клітини монотрихів, що не повністю поділилися, клітини із джгутиками на дистальних кінцях [12]. Доведено, що бактерії, які раніше вважалися монотрихами мають по кілька джгутиків. Самостійне існування амфітрихів заперечується [13].

Найбільш поширеними є два типи розташування джгутиків: полярний та перетрихальний; полярні джгутики слугують для руху в рідких середовищах, а латеральні характерні для видів, середовищем існування яких є волога тверда поверхня [22].

Рух бактерій вперше спостерігав Левенгук в 1863 році. А Дж. Будер (1915) і П. Метцнер (1920) виявили властивість джгутиків обертатись [13]. Саме розміщення джгутиків визначає характер руху бактерій. Моно- і лофотрихи рухаються прямолінійно, перетрихи під час прямолінійного руху безладно пересуватися [22]. В цілому, тип руху залежить від кількості джгутиків, віку і властивостей культури, температури і наявності хімічних речовин та інших факторів. Найбільшу рухливість мають монотрихи (60 мкм/с) [9].

Джгутики являють собою спірально закручені нитки. У різних видів бактерій вони різняться за товщиною (12-18 нм), довжиною до 20 мкм, а також за довжиною та амплітудою витка.

Хоч наявність джгутиків і є видовою ознакою, однак вони не завжди життєво необхідні, є безджгутикові варіанти рухливих видів бактерій [19].

У різних видів бактерій є ворсинки (рис), які набагато коротші і тонші від джгутиків [19].

Поверхня деяких бактерій вкрита великою кількістю (від 10 до кількох тисяч) довгих таких прямих ниток завтовшки 3-25 нм та завдовжки до 12 нм, які називаються фімбріями. Фімбрії зустрічаються у бактерій, які мають і не мають джгутиків [16].

Пілі є поверхневими структурами переважно грамнегативних бактерій. У E. coli вони мають форму порожнистих циліндрів. Розрізняють загальні (ворсинки першого типу) та статеві пілі (ворсинки другого типу). Загальні пілі розміщені по всій поверхні клітини, їхня кількість становить від 50 до 400, а довжина до 1,5 мкм. Ці пілі зумовлюють адгезивні властивості бактерій.[13] Статеві пілі, або пілі типу F, були виявлені у клітин-донорів E. coli К 12, у штамів, що містять статевий фактор F (F, Hfr) F пілі можуть бути тільки по одній або по дві на клітину. Також, ворсинки другого типу характерні для нейсерій, гемофільних видів, стрептококів групи А, коринебактерій та ін. [9].

У деяких паличкоподібних форм поверхня клітин покрита виростами, шипами [13].

ДОДАТОК Е

Фарбування за Грамом

Фарбування мікроорганізмів -- складний фізико-хімічний процес, у механізмі якого значну роль відіграють явища адсорбції, капілярності, хімічної спорідненості між барвником і об'єктом фарбування [20].

Данський вчений Х. Грам у 1884 р. Запропонував специфічний метод фарбування бактерій, згідно з яким фіксовані клітини бактерій обробляють розчином барвника кристалічного фіолетового та йодом. Фарбування за Грамом є важливою діагностичною ознакою бактерій..Слід зауважити, що характер забарвлення прокаріот за Грамом залежить від віку культури, факторів зовнішнього середовища тощо [9].

Донедавна розглядалися різні теорії, що пояснюють диференційне забарвлення бактерій за Грамом (наприклад, хімічна, мембранна, ізоелектрична). Згідно сучасних уявлень, після проникнення у клітини розчинна хлорна форма генціан-віолету переходить у нерозчинну йодну форму і випадає у осад, при цьому забарвлюється цитоплазма клітини. При обробці препарату розчинником (етиловий спирт, ацетон) із цитоплазматичної мембрани екстрагуються ліпіди, це призводить до підвищення її пористості. Таким чином, мембрана не є перешкодою для вимивання комплексу генціан-віолет-йод. Але зазвичай клітина має муреїновий шар (різної товщини та пористості у різних бактерій), який характеризується високою стійкістю до органічних розчинників. Багатошаровий малопористий муреїновий шар перешкоджає вимиванню барвника - клітини забарвлюються у синьо-фіолетовий колір (грампозитивно), а при наявності моношару муреїну із крупними порами, клітини забарвлюються за Грамом - негативно [18].

Отже, фарбування мікроорганізмів має велике диференціальне значення оскільки дає змогу встановити морфологічні і тинкторіальні властивості мікроорганізмів, тобто їхнє відношення до барвників.

Результати фарбування за Грамом

Рис. Е.2.1. Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2.2. Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2.3. Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2.4 Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2.5 Мікрофлора повітря аудиторії № 2

Рис. Е.2.6 Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2. Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2.8 Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2.9 Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2.10. Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2.11 Мікрофлора повітря аудиторії № 21

Рис. Е.2.12. Мікрофлора повітря туалету

Рис. Е.2.13 Мікрофлора повітря туалету



Мал. Е.2.14 Мікрофлора повітря туалету

ДОДАТОК Ж

Механізм визначення розмірів клітин мікроорганізмів

Клітини мікроорганізмів виміряють під мікроскопом за допомогою окулярної лінійки -- мікрометра чи окулярного гвинтового мікрометра. Для вимірювання краще використовувати живі, а не фіксовані клітини, так як фіксація і забарвлення клітин призводить до деяких змін справжніх розмірів. Якщо клітини здатні до руху, препарат необхідно трохи підігріти або ж до краплини досліджуваної суспензії додають 1 мл 0,1 % - ного водного розчину агару. Розміри клітин визначають у мікрометрах (мкм) [18].

Механізм визначення форми клітини

Форму клітин виявляють, як правило, на препаратах “роздавлена крапля” в світловому чи фазово-контрастному мікроскопі. Для визначення форми клітини дрібних паличкоподібних бактерій таких, як Serratia marcescens, готують препарат фіксованих клітин і фарбують їх простим способом. Клітини бактерій, які мають малі розміри і мають вирости (роди Stella, Caulobacter, Prosthecomicrobium) необхідно досліджувати в темному полі. Розташування клітин в колонії актиноміцетів і міцеліальних грибів вивчають методом відбитків [18].

Механізм виявлення спор мікроорганізмів

Спори характеризуються значною заломлюваністю світла. Вони мають такий самий показник заломлювання світла як і зневоднений білок. Це вказує на те, що в спорах велика кількість багатого білком матеріалу зосереджена в малому об'ємі [16]. Спора містить майже всю суху речовину материнської клітини, але займає в 10 разів менший об'єм. При бактеріологічному дослідження у незабарвленому стані мають вигляд блискучих зерен; вони погано забарвлюються [19].

У сумнівних випадках виявити в клітинах істинні ендоспори можна за допомогою спеціального фарбування.

Оболонка мікроорганізмів стійка до дії більшості хімічних речовин, тому погано фарбується [16]. Спори важко взаємодіють з барвниками, тому за простих методів фарбування вони залишаються безбарвними на тлі забарвлених вегетативних тіл бактерій [23] .

Для зафарбовування спор важливою умовою є спеціальне оброблення мазка, що забезпечує розм'якшення оболонки. Його протравлюють кислотою, потім фарбують концентрованим розчином барвника при високій температурі. Наприклад, карболовим розчином фуксину. При цьому, як правило, оболонка спори міцно зв'язують барвник і не знебарвлюються, навіть при обробці етанолом чи 1М оцтовою кислотою (в умовах, коли решта клітини стає безбарвною) [21, 23].

Механізм виявлення джгутиків

Виявлення джгутиків є однією з найважчих процедур у бактеріологічній техніці. Це пов'язано з тим, що джгутики можна дуже легко пошкодити при виготовленні мікропрепарату. Розглянути джгутик (пучок джгутиків) у світловому мікроскопі чи в умовах фазового контрасту вдається тільки у небагатьох представників родів Bdellovibrio, Thiospirrilum, Chromatium. Легко виявити джгутики шляхом нанесення на них барвників або металу, а також за допомогою електронного мікроскопа [9].

Наявність джгутиків виявляють визначенням рухливості бактерій, мікроскопіюванням у темному полі, застосуванням особливих методів обробки їх протравами, адбсорбції на поверхні клітин бактерій різних барвників, а також за допомогою електронної мікроскопії. Останній дав змогу виявити спіралеподібну форму і гвинтоподібну будову джгутиків [19].

Скло для мікропрепаратів повинно бути абсолютно чистим і знежиреним. Зазвичай, використовують нові покривні скельця. Дуже важливо, щоб вік досліджуваної культури був не старшим від 12-18 год. Якщо скло абсолютно чисте, то краплина з мікроорганізмами набуде правильної округлої форми, легко пошириться і швидко висохне на повітрі без підігріву. Препарати перед фарбуванням обов'язково фіксують протравою, яка посилить інтенсивність забарвлення.

Прикладом методик виявлення джгутиків є метод Леффлера. В даному випадку джгутики фарбуються у рожево-червоний колір. При використанні метода Шнека джгутики набувають синього забарвлення [21].

Особливості механізму виявлення спороутворення, способу руху клітин мікроорганізмів

Процеси спороутворення, вивчення характеру руху клітини проводять на живих клітинах мікроорганізмів, використовуючи “роздавлену” та “висячу краплю”, також спори виявляють шляхом диференційного фарбування цитоплазми і спор. Висяча крапля широко використовується для визначення проростання спор у вегетативних форм [21]. Слід зазначити, що у практичних лабораторіях вивчення мікроорганізмів у живому стані використовують для дослідження їхньої рухливості як непрямого підтвердження наявності в них джгутиків [ 23].

Рухливість бактерій вивчають методами висячої чи роздавленої краплі. Визначення рухливості використовують у лабораторній практиці для ідентифікації холерних вібріонів, бактерій черевного тифу, паратифів та ін.

Досить часто рухливість мікроорганізмів можна виявити неозброєним оком. Для цього досліджувану культуру сіють уколом у стовпчик напіврідкого живильного середовища. Посів інкубують у термостаті протягом 18-20 годин. Якщо бактерії не мають джгутиків, їх ріст (інтенсивне помутніння) буде тільки впродовж лінії уколу. Рухливі бактерії дають дифузний ріст по всій товщині живильного середовища.

Якщо для встановлення характеру руху клітини використовують “висячу краплю”, то в імерсійному об'єктиві можна спостерігати наступне: рухливі бактерії проходять з однаковою швидкістю значну відстань, часом через усе поле зору, роблячи кругові і ґвинтові рухи. Найбільш швидкі і прямолінійні рухи роблять монотрихи і лофотрихи. Перитрихам і амфітрихам властива менш енергійна і безладна рухливість.

Варто зазначити, що початківець може помилково прийняти молекулярний рух за справжній. При цьому нерухливі бактерії коливаються між двома близькими точками, ніби “танцюють” на місці.

Для збільшення контрастності досліджуваних об'єктів використовують малотоксичні й майже нешкідливі барвники: метиленовий і толуоїдний синій, конго і нейтральний червоний, акридиновий оранжевий, янус зелений [17].

Однак ці методи мають свої недоліки. У живих бактерій, що активно рухаються, важко виявити деталі структури. При такому дослідженні можна мати лише загальне уявлення про їх морфологію.

Отже, у випадку виявлення у мікроорганізмів здатності до утворення спор необхідно звернути увагу, тип спороутворення, на розташування спор в клітині, форму вільних спор та визначити їхні розміри [18].

Слід зауважити, що вік культури, склад середовища і умови культивування суттєво впливають на морфологію мікроорганізмів.

ДОДАТОК З

Обрахунки кількісного складу мікрофлори повітря

1. Результати посівів мікроорганізмів взятих з повітря аудиторії № 21:

До початку занять ( температура складала)

На площі чашки Петрі (78,5 ) за 48 год утворилося 3 колонії. Відповідно на площі 100 колоній буде більше:

78,5 - 3 колонії,

100 - х колоній,

Перерахунок кількості колоній на площу 100 доцільно проводити тому, що за приблизними даними В. Л. Омелянського на цю площу за площу за 5 хв осідають усі мікроби та їхні спори, які містяться в 10 л повітря. Цей показник дає можливість перерахувати кількість мікроорганізмів у повітря досліджуваного приміщення:

колонії -- 10 л

х -- 1000 л,

Отже, в повітря аудиторії № 21 міститься 382 мікробних тілець та їхніх спор.

Після завершення занять ( температура складала)

На площі чашки Петрі (78,5 ) за 48 год. утворилося 10 колоній. Відповідно на площі 100 колоній буде більше:

78,5 - 10 колоній,

100 - х колоній,



Перерахунок кількості колоній на площу 100 :

12, 73 -- 10 л

х -- 1000 л,

Отже, в повітря аудиторії № 21 міститься 1273 мікробних тілець та їхніх спор.

2 Результати посівів мікроорганізмів взяті з аудиторії № 18:

До початку занять ( температура складала)

На площі чашки Петрі (78,5 ) за 48 год. утворилося 4 колонії. Відповідно на площі 100 колоній буде більше:

78,5 - 4 колонії,

100 - х колоній,

Перерахунок кількості колоній на площу 100 :

5,1 -- 10 л

х -- 1000 л,

Отже, в повітря аудиторії № 18 міститься 510 мікробних тілець та їхніх спор.

3 Результати посівів мікроорганізмів взяті з коридору на другому поверсі :

До початку занять ( температура складала)

На площі чашки Петрі (78,5 ) за 48 год. утворилося 6 колоній. Відповідно на площі 100 колоній буде більше:

78,5 - 6 колоній,

100 - х колоній,

Перерахунок кількості колоній на площу 100 :

7, 64 -- 10 л

х -- 1000 л,

Отже, в повітря коридору на першому поверсі міститься 510 мікробних тілець та їхніх спор.

Після завершення занять ( температура складала)

На площі чашки Петрі (7,065 ) за 48 год. утворилося _ колоній. Відповідно на площі 100 колоній буде більше:

7,065 - 2 колоній,

100 - х колоній,

Перерахунок кількості колоній на площу 100 :

42, 26 -- 10 л

х -- 1000 л,

Отже, в повітря туалету міститься 4246 мікробних тілець та їхніх спор.

5 Результати посівів мікроорганізмів взяті з коридору на першому поверсі:

До початку занять ( температура складала)

На площі чашки Петрі (78,5 ) за 48 год. утворилося 5колоній. Відповідно на площі 100 колоній буде більше:

78,5 - 5 колоній,

100 - х колоній,

Перерахунок кількості колоній на площу 100 :

6, 37 -- 10 л

х -- 1000 л,

Отже, в повітря коридору на першому поверсі міститься 637 мікробних тілець та їхніх спор.

Після завершення занять ( температура складала)

На площі чашки Петрі (7, 65 ) за 48 год. утворилося 1 колонія. Відповідно на площі 100 колоній буде більше:

7,065 - 1 колонія,

100 - х колоній,

Перерахунок кількості колоній на площу 100 :

14, 15 -- 10 л

х -- 1000 л,

Отже, в повітря коридору першого поверху після занять міститься 1415 мікробних тілець та їхніх спор.

6 Результати посівів мікроорганізмів взяті з повітря живого куточку:

Після завершення занять температура складала).

На площі чашки Петрі (7,065 ) за 48 год. утворилося 2 колонії. Відповідно на площі 100 колоній буде більше:

7,065 - 2 колоній,

100 - х колоній,

Перерахунок кількості колоній на площу 100 :

28, 3 -- 10 л

х -- 1000 л,

Отже, в повітря живого куточку 2830 мікробних тілець та їхніх спор.

ДОДАТОК И

Рис. И.1. Виготовлення поживного середовища

Рис. И.2. Виготовлення поживного середовища

Рис. И.3. Виготовлення поживного середовища



Рис. И.4. Виготовлення поживного середовища

Рис. И.5. Виготовлення поживного середовища

Рис. И.6. Виготовлення поживного середовища



Рис. И.7Виготовлення тимчасових мікропрепаратів

Рис. И.8 Виготовлення тимчасових мікропрепаратів

Рис. И.9. Результати культивування мікроорганізмів



Рис. И.10 Результати культивування мікроорганізмів аудиторії № 21 (до занять)

Рис. И.11 Результати культивування мікроорганізмів аудиторії №21 (після занять)

Рис. И. 12 Результати культивування мікроорганізмів кор. другого поверху (до занять).

Размещено на Allbest.ru