10

10

Оглавление

• Введение
• 1 Обзор литературных данных
• 2 Материал и методика исследования
• 3 Результаты и обсуждение
• 3.1 Цитогенетические исследования
• 3.1.1 Спонтанный мутагенез
• 3.1.2 Влияние неравномерного фракционированного облучения на прозанник пятнистый (Achyrophorus maculatus L.)
• 3.1.2.1 Влияние на индуцированный мутагенез г-лучей 60Со в дозе 5 Гр
• 3.1.2.2 Влияние на индуцированный мутагенез г-лучей 60Со в дозе 30 Гр
• 3.1.2.3 Значение временной организации фракционированного облучения в формировании радиологического эффекта
• 3.2 Биохимические исследования
• Заключение
• Список использованной литературы
• Приложения

29 сентября 1957 года вследствие теплового взрыва емкости с радиоактивными отходами на Южном Урале (химкомбинат «Маяк») произошла одна из наиболее крупных ядерных аварий. Суммарный выброс радионуклидов был равен 7,4?1016 Бк Беккерель (Бк) - единица активности нуклида в радиоактивном источнике (в системе СИ). Один беккерель соответствует одному распаду в секунду любого радионуклида.. Исключительно важное радиологическое значение имело присутствие в составе смеси долгоживущего радионуклида - 90Sr с периодом полураспада 28,5 лет, что и предопределило длительную опасность этого радиоактивного загрязнения [5]. В результате указанного выброса образовался ВУРС Восточно-Уральский радиоактивный след - уникальный полигон для изучения эффектов хронического облучения малыми дозами [7].

Изучение механизмов радиорезистентности природных популяций региона Кыштымской аварии вносит вклад в разработку проблемы накопления патологического груза, механизмов адаптации к радиационной среде, прогнозирования отдаленных последствий и поиску средств их коррекции [16]. Актуальность этой проблемы определяется тем, что на ясном понимании закономерностей формирования биологических эффектов малых доз ионизирующего излучения должна основываться разработка новой концепции радиационной защиты человека и биоты [8].

В плане выяснения природы явлений, наблюдающихся при фракционировании дозы, значительный интерес представляют работы с описанием защиты от радиации под действием предварительного облучения малой дозой. Радиация обладает многосторонним действием на клетку и организм и наложение двух доз отражается неодинаково на отдельных составляющих радиационного эффекта, влияя на выход цитогенетических нарушений [12].

Целями настоящей работы на высших растениях с территории ВУРСа являются:

> изучение влияния малых доз ионизирующих излучений на спонтанный мутагенез;

> межвидовые сравнения хромосомной нестабильности;

> исследование эффекта неравномерного фракционированного облучения;

> определение роли антиоксидантных систем в формировании радиопротекторного эффекта.

Для достижения целей необходимо выполнение следующих задач:

а) ознакомление с объектами исследования и условиями их обитания;

б) анализ состояния проблем на сегодняшний день;

в) освоение методик исследований и применение их на практике;

г) применение методов вариационной статистики для обработки и анализа эмпирических данных.

1 Обзор литературных данных

Изучение мутационного процесса в природных популяциях, подвергающихся хроническому действию ионизирующих излучений, важно в связи c задачами, возникающими в теории эволюции, с разработкой проблем охраны окружающей среды, для прогнозирования отдаленных генетических последствий загрязнения биосферы радионуклидами [4].

Среди классических методов радиобиологии и радиационной генетики наибольший интерес представляет прием повторного действия мутагенов. При взаимодействии эффектов двух доз возможно модифицирующее влияние предыдущего облучения на результат последующего. Фракционирование дозы облучения является методом анализа процессов восстановления [12, 25], кроме того, оно неодинаково отражается на отдельных составляющих радиационного эффекта. При повторном облучении в определенных условиях возникает эффект защиты, который наиболее легко обнаружить при использовании первого облучения в небольшой дозе [12]. Считается, что хроническое облучение является частным случаем фракционирования дозы [25].

Решающим фактором в ответной реакции клетки является доза. Клетка обладает способностью устранить нанесенное ей повреждение. Помимо суммарной дозы на ход реакции восстановления влияет и мощность доз. Как правило, при уменьшении мощности доз, т.е. при растягивании времени облучения, процесс восстановления выражен сильнее, а лучевое поражение меньше [11].

Многие авторы указывают на повреждающее действие повышенного фона радиоактивности, однако положительное действие малых доз радиации также широко известно: стимуляция биологических процессов: роста, развития, выживаемости, плодовитости, исцеления и др. [12, 21]. В популяциях дикорастущих растений, произрастающих на загрязненных радионуклидами территориях, произошли адаптационные изменения, выражающиеся в повышенной радиоустойчивости по сравнению с популяциями тех же видов, произрастающими на чистых незагрязненных почвах [3, 4, 17, 24]. Одним из механизмов повышения радиоустойчивости облучаемых организмов является увеличенное содержание в их тканях антиоксидантов [17]. Однако мутационный процесс в облучаемых популяциях растений протекает более интенсивно по сравнению с контрольными [4, 24].

Сравнение биохимических показателей у двух видов мелких млекопитающих, обитающих на контрольных и радиационно-загрязненных территориях ВУРСа позволило отнести характеристики окислительно-восстановительного метаболизма к основным физиологическим детерминантами (определителями) их радиорезистентности к длительному низкоинтенсивному воздействию [16].

Приступая к экспериментам с предварительным облучением малой дозой, авторы [13] предполагали, что данное воздействие может вызвать скрытые лучевые повреждения, снижающие выживаемость объекта после дополнительного облучения массивной дозой, однако их предположения не подтвердились. Снижение частоты хромосомных аберраций при фракционировании дозы связано с обратимыми физиологическими изменениями в клетке, которые делают хромосомы менее чувствительными ко второй экспозиции [1]. Авторами [13] высказывается предположение, что радиобиологические эффекты радиостимуляции и повышения радиорезистентности под влиянием предварительного облучения малыми дозами регулируются единым механизмом.

В основе радиационно-химических изменений молекул могут лежать два механизма. 1. Прямое действие, при котором данная молекула испытывает изменение непосредственно при прохождении через нее кванта энергии. 2. Косвенное действие - изменяемая молекула непосредственно не поглощает энергию падающего излучения, а получает ее путем передачи от другой молекулы [9, 25].

Ионизирующие излучения характеризуются незадержанным эффектом индуцирования аберраций хромосом [12], что позволяет использовать в качестве количественного показателя радиочувствительности подсчет клеток с хромосомными перестройками. Оценка поражения может проводиться путем мета- или анафазного анализа, но первый из них весьма трудоемок. При анализе анафаз легко различимы «летальные» для клетки аберрации - дицентрики и фрагменты; достоинством этого метода является относительная простота, делающая его доступным и в то же время достаточно корректным для оценки радиочувствительности [25]. Часть аберраций, как, например, дицентрики, механически препятствует делению клетки; появление ацентрических фрагментов приводит к неравномерному разделению и утрате генетического материала, вызывающего гибель клетки из-за нехватки метаболитов, синтез которых кодировался ДНК утраченной части хромосомы [11, 25]. Учет частоты фрагментов, однако, не является достаточно надежным показателем вследствие того, что фрагменты могут вовлекаться расходящимися хромосомами в анафазные шапки, где они не обнаруживаются, после чего элиминируются, объединяясь в микроядра; к тому же, фрагменты могут теряться в процессе приготовления препаратов [12, 25].

Структурно-метаболическая теория (СМТ) в радиобиологии является современным обобщением огромного фактического материала и ранее существовавших теорий в радиобиологии в свете представлений о неразрывном единстве и взаимовлиянии структуры и метаболизма. СМТ исходит из положения, что при действии радиации на клетку первичные процессы возникают во всех ее структурах и затрагивают многие метаболические процессы, неразрывно связанные с этими структурами. Любой радиобиологический эффект возникает во времени в результате взаимодействия многих процессов, как развившихся после облучения, так и нормально протекающих в клетке. СМТ подчеркивает значение фактора времени в проявлении любых радиобиологических эффектов. Скорость протекания процессов, происходящих в клетке после облучения, будет зависеть не только от места и величины поглощенной энергии, наличия веществ, обрывающих цепные процессы. Структурно-метаболическая теория рассматривает механизмы поражающего действия сублетальных и летальных доз радиации, так и стимулирующего действия малых доз радиации. СМТ является общей теорией действия радиации на биологические объекты, начиная с клеточного уровня и заканчивая высокоорганизованными многоклеточными организмами [9].

2 Материал и методика исследования

Объектами исследования являются многолетние травянистые растения Семена исследуемых растений были предоставлены сотрудниками лаборатории радиационной генетики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.: Прозанник пятнистый - Achyrophorus maculatus L. (семейство Сложноцветные; 2n = 10, рис. 1А; стр. I) и два вида подорожника: Подорожник ланцетолистный - Plantago lanceolata L. (2n = 12, рис. 1Б) и Подорожник средний - Plantago media L. (2n = 24, рис. 1В, оба из семейства Подорожниковые) [13]. Семена всех видов растений были собраны на территории Восточно-Уральского радиоактивного следа как с контрольных участков, так и с загрязнённых радионуклидами 90Sr-90Y и 137Cs. В местах сбора материала первоначальное загрязнение составляло 1500-2000 Ки Кюри (Ки) - внесистемная единица активности изотопа: 1 Ки = 3,7?10¹⁰ Бк./км2; 90% дозы формируется за счёт распада 90Sr и 10% - за счёт 137Cs. В настоящее время прошло 1,7 периодов полураспада радиостронция и остаточное загрязнение составляет 525 Ки/км2 (интенсивность г-излучения 0,8 рад/сутки) (рис. 2; стр. II) [15].

Реагенты: раствор гидроперита (0,0025 М), раствор крахмала (0,125% по массе), раствор йода (0,0125% по массе).

Оценка уровня спонтанного мутагенеза проводилась на всех указанных видах, эффекты фракционированного облучения - на A. maculatus, биохимические исследования - на двух видах подорожника.

Семена A. maculatus провокационно облучались г-лучами 60Co при мощности дозы 219 рад/мин г-Терапевтический аппарат «Алтай», «Российский научный центр рентгенорадиологии» МЗ РФ. Применялось неравномерное фракционированное облучение (начальная доза 5 Гр Грей (Гр) - единица поглощенной дозы в системе СИ. Представляет собой количество энергии ионизирующего излучения, поглощенный единицей массы какого-либо физического тела. 1 Гр = 1 Дж/кг; 1 рад = 0,01 Гр; разрешающая доза 30 Гр) с интервалами между фракциями 1 час или 1 сутки. Изучались варианты: без облучения, с облучением в малой дозе (5 Гр), с облучением в массивной дозе (30 Гр), а также варианты с различной временной организацией облучения (сочетание 5 Гр + 30 Гр).

Исследуемые семена проращивались, и фиксировались проростки по достижении длины корешка в 4-5 мм для прозанника и 2-3 мм для подорожников в смеси этанола и «ледяной» уксусной кислоты в компонентном отношении 3:1. Учитывались частоты хромосомных аберраций в ана-телофазе митоза в клетках корешков, для чего растения окрашивали ацетокармином в течение 5-15 минут на водяной бане. Давленые временные микропрепараты изготовлялись из кончика корешка длиной около 2 мм. Наблюдения производили при 600-кратном увеличении с водной иммерсией, используя зеленый фильтр. В каждом варианте просчитывалось в среднем по 500 ана-телофаз.

Микропрепараты фотографировались по авторской методике без применения аналогового цифрового преобразователя при 900-кратном увеличении с масляной иммерсией с помощью цифрового фотоаппарата мобильного телефона LG B2100 (рис. 3; стр. III, IV).

Биохимические исследования проводились на P. lanceolata и P. media методом йодометрии (титрование), в основе которого лежит реакция [6, 22]: 5H2O2 + I2 = 4H2O + 2HIO3.

Отобранные для анализа растения, тщательно очищенные от земли и обсушенные фильтровальной бумагой до постоянного веса, взвешивались и растирались со стеклянным порошком в фарфоровой ступке. Полученная смесь разводилась дистиллированной водой в расчете 9 мл воды на каждые 100 мг растения и центрифугировалась на ручной центрифуге в течение 5 минут при скорости вращения 1200 об/мин.

В раствор гидроперита, объёмом 5 мл, добавлялись 0,2 мл надосадочной жидкости, и смесь выдерживалась в течение 30 секунд, после чего приливались 3 мл раствора крахмала в качестве индикатора. Смесь титровалась йодом до получения эталонной голубой окраски, сохраняющейся в течение 3 секунд, после чего регистрировался объём затраченного йода.

Для статистической обработки данных использовались следующие методы: дисперсионный анализ двухфакторных неравномерных комплексов для качественных признаков; дисперсионный анализ однофакторных комплексов для качественных признаков; критерий чІ; точный критерий Фишера (F); критерий Стьюдента (td); критерий «ФИ» (Fц). Для данной обработки в таблицах Excel автором работы были созданы алгоритмы вычисления необходимых показателей с использованием литературы [14, 23].

3 Результаты и обсуждение

Результаты данных исследований позволяют выявить зависимость изменения радиочувствительности высших растений как минимум от трех факторов: хронического в-, г-облучения; числа хромосом в кариотипе (плоидности); предварительного г-облучения при неравномерном фракционировании дозы. Результаты математической обработки данных представлены в таблицах 1, 2 и на рисунках 5-10.

3.1.1 Спонтанный мутагенез

Хроническое облучение вызывает достоверное увеличение частоты аберрантных анафаз в опытных популяциях A. maculatus (p << 0,001) и P. media (p < 0,01), в то же время, в популяциях P. lanceolata отмеченного феномена не наблюдается (p > 0,05), что не противоречит литературным данным [22]. Возрастание частоты аберрантных анафаз связано с ускоренным накоплением мутационного груза [2, 3, 4], так как фон от радионуклидов более чем в 100 раз превышает естественный радиационный фон.

В хронически облучаемых популяциях прозанника по сравнению с контрольными происходит достоверное увеличение частоты дицентриков (чІ = 26,96, н = ?, р < 0,001; рис. 6; стр. VI). В эксперименте облучали покоящиеся семена, поэтому двойные разрывы хромосом, приводящие к образованию дицентриков, оставались нереализованными до начала прорастания, когда, вследствие увеличения теплового движения, обломки хромосом смещаются, образуя разнообразные транслокации (рис. 3-4; стр. III-IV), то есть из потенциальных повреждения переходят в летальные [12]. Однако в популяциях обоих видов подорожника изменения частоты дицентриков не происходит (р >> 0,05; рис. 6; стр. VI).

Не обнаружены отличия в частоте ацентрических фрагментов в опытных и контрольных популяциях A. maculatus (F = 0,98, н = 27, р >> 0,05; рис. 7; стр. VI), в тоже время, в опытных популяциях P. lanceolata наблюдается достоверное увеличение частоты этого вида аберраций по сравнению с контрольными (p < 0,01; рис. 7; стр. V). Однако в хронически облучаемых популяциях P. media отмечено достоверное (р < 0,001) снижение частоты ацентрических фрагментов по сравнению с незагрязненными радионуклидами популяциями.

Как известно, растения с большей плоидностью обладают повышенной неспецифической устойчивостью к действию экстремальных абиотических факторов среды обитания, например, в более высоких широтах преобладают полиплоидные формы, имеющие селективные преимущества по сравнению с диплоидными [18]. Дисперсионный анализ показал достоверное (F = 15,0; н = 1500; р < 0,001) влияние фактора плоидности на радиоадаптивный ответ исследованных растений: у P. media отмечена меньшая частота аберрантных анафаз как в контрольных (р < 0,001), так и в опытных (р < 0,01) популяциях по сравнению с популяциями P. lanceolata, произрастающими в таких же экологических условиях.

3.1.2 Влияние неравномерного фракционированного облучения на прозанник пятнистый (Achyrophorus maculatus L.)

Из результатов двухфакторного дисперсионного анализа следует, что как хроническое облучение (p < 0,01), так и различным образом организованное дополнительное радиационное воздействие (p << 0,001), а также сочетания этих факторов достоверно (p << 0,001) изменяют радиобиологический ответ исследованных растений.

3.1.2.1 Влияние на индуцированный мутагенез г-лучей 60Со в дозе 5 Гр