Главная
База знаний "Allbest"
Биология и естествознание
Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Разработка универсального метода клонирования фрагментов ДНК с использованием II-S типа эндонуклеаз рестрикции. Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4. Выделение РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4. Анализ методов и результатов исследования.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | дипломная работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 23.08.2011 |
| Размер файла | 66,5 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
2.2.4 Подготовка фрагментов ДНК
Фрагмент ДНК, содержащий ген Т4 ДНК-полимеразы, полученный с помощью ПЦР, обрабатывали рестриктазами XhoI и BspIS4I [15], сайты для которых были заложены в синтезированных олигонуклеотидах. Сначала проводили рестрикцию с XhoI (при 37o C), т.к. эта рестриктаза инактивируется прогреванием при 65o C 20 минут. Для рестриктазы XhoI есть сайт в олигонуклеотиде 2F2 (к 3'-области гена) и внутри последовательности гена Т4 ДНК полимеразы , по этому делали полный гидролиз. В результате было получено два фрагмента : 2500 (3'-конец гена 43) и 196 пар оснований (5'-конец гена 43). После инактивации XhoI в ту же смесь добавили рестриктазу BspIS4I, для которой был заложен сайт в праймере к 5'-области гена. Инкубировали 30 мин при 48o C, инактивировали фермент добавлением ЭДТА (до конечной концентрации 10mM). Экстрагировали фенолом и смесью фенол:хлороформ (1:1) [46].
Перед экстрацкией к образцу добавляли раствор т-РНК (в качестве соосадителя) до конечной концентрации 20мкг/мл. ДНК осадили этанолом и растворили в 50 мкл ТЕ. Таким образом в растворе присутствовали фрагменты гена Т4 ДНК-полимеразы длиной 2500 и 196 п. о.
Фрагменты ДНК, содержащие гены РНК-лигазы и Tth-полимеразы обрабатывались эндонуклеазой Bli736I, сайты для которой находятся в праймерах к 5/-концу гена, и XhoI, EcoRI (сайты для которых заложены в праймерах к 3/-концу генов), соответственно. Фрагмент, содержащий ген полинуклеотидкиназы, обрабатывался эндонуклеазами PaqI (5/-конец) и XhoI.
2.2.5 Лигирование
Реакционная смесь (для случая с Т4 ДНК-полимеразой): ДНК-вставка 10 мкл (400 нг), ДНК-вектор 20 мкл (200 нг), 10х лигазный буфер 4 мкл, АТФ 10 mM- 4 мкл, ДТТ 200mM 1 мкл, Т4 ДНК-лигаза 1 мкл. Инкубация 16 часов при комнатной температуре.
В качестве контроля проводили лигазную реакцию с плазмидной ДНК (pMTL: XbaI ) без вставки. Инактивировали ДНК-лигазу прогревом при 65 15 мин. Эффективность лигирования оценивали по электрофорезу (переход линейной формы плазмидной ДНК в кольцевую).
Лигирование молекул вектора и фрагмента (с геном полинуклеотидкиназы фага Т4) проводилось в 20 мкл реакционной смеси, содержащей: 2 мкл lig- буфера, 2 мкл 10 мМ АТФ, 2мкл 50мМ ДТТ, 6 мкл (190 нг) pET-28b:NcoI:XhoI , 8 мкл (40нг) ДНК-вставки, 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Пробу инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре. Затем лигазу инактивировали прогреванием 20 мин при 75 С.
2.2.6 Трансформация клеток E. Сoli
Трансформацию проводили кальциевым методом и методом электропорации.
Подготовка компетентных клеток для электротрансформации. Петлей с косяка засевали "ночную культуру" E.coli BL21(DE3)pLysS в пробирку с 5 мл LB-среды и инкубировали ночь на качалке при 37С. В колбу со 100 мл LB-среды вносили 1 мл ночной культуры и растили при 37 с хорошей аэрацией до плотности 0.5-1 ОЕ при 590 нм. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 15 мин в предварительно охлажденных стаканах. Следующие операции проводили в ледяной бане. Осажденные клетки дважды промывали холодным раствором для промывки клеток (1 mM HEPES pH 7.0) и два раза 10%-ным глицерином. Ресуспендировали клетки в 200-300 мкл 10%-ного глицерина. Полученные компетентные клетки хранили при -70С, расфасованными аликвотами по 70 мкл.
Электротрансформация. Электрокомпетентные клетки размораживали при комнатной температуре и помещали на лед. К суспензии клеток добавляли 1 мкл раствора ДНК (из лигазной реакции) , смесь выдерживали во льду более 1 мин. В предварительно охлажденные ячейки помещали 70 мкл суспензии и обрабатывали одиночным высоковольтным импульсом (1700 В). Сразу после обработки в ячейку добавляли 1 мл SOC-среды, клетки переносили в пробирки и инкубировали 1 час при 37С для экспрессии генов антибиотик резистентности. После этого производили высев на чашки с LB-агаром, содержащим соответствующие антибиотиками. Клетки инкубировали ночь при 37С.
Приготовление клеток кальциевым методом и трансформация
Подращивали культуру клеток до оптической плотности 0,3. Поместили клетки в большие пробирки "Эппендорф", центрифугировали 2 мин при 3000 об/мин. LB-среду слили, добавили 500 мкл 100 mM CaCl2. Центрифугировали в течение 2 мин при 3000 об/мин. К осадку добавили 100 мкл буфера К, клетки ресуспендировали, оставили на 30 мин при 0С. Затем добавили ДНК ( 30 нг вектора из лигазной реакции). Оставили еще на 30 мин при 0С, после чего перенесли клетки на 2 мин в баню на 42С . Затем образцы опять перенесли в ледяную баню, инкубировали 5-7 мин. Добавили 500 мкл LB-среды, инкубировали 1 час при 37 С и хорошей аэрации.
На чашки с LB агаром, содержащим соответствующий антибиотик, высевали 300 мкл клеток. Инкубировали ночь при 37С.
2.2.7 Анализ клонов
Анализ клонов проводили рестрикцией плазмидной ДНК или с помощью метода ПЦР с колоний.
Мини-препаративное получение плазмидной ДНК.
Клетки, содержащие плазмидную ДНК, выращивали в 2 мл LB-среды до поздней логарифмической фазы роста. Клетки центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин в центрифуге Eppendorf (Eppendorf, США). Клетки ресуспендировали в 100 мкл раствора 1 () содержащем РНКазуI (10 мкг/мл) и лизоцим (7мг/мл), инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Добавили 200 мкл раствора 2 (0,2 н NaOH, 1% SDS). Инкубировали 15 мин. Пробирки переносили в лед и добавляли 150 мкл 3 М ацетат Na. Оставили на льду на 15 мин, затем центрифугировали при 12000 об/мин. Супернатант переносили в пробирку и переосаждали этанолом. ДНК промывали 70% этанолом, сушили и растворяли в буфере ТЕ.
ПЦР с колоний.
Отдельные колонии ресуспендируются в 30 мкл ТЕ-буфера, образцы кипятятся 5 минут и центрифугируются 3 мин при 3000 об/мин. В супернатанте находится плазмидная ДНК. В отдельные пробы с15 мкл реакционной смеси для ПЦР добавляется по 5 мкл раствора плазмидной ДНК. Проводится ПЦР с использованием одного универсального праймера, комплементарного, например, Т7 терминатору вектора pET-21d (или pET-28b), и праймера, комплементарного 5/-концу фрагмента. Такой подход используется для избежания фальшивого позитивного результата при выполнении данной процедуры и заодно сразу подтверждается правильная ориентация фрагмента в векторе [47].
2.2.8 Клонирование ДНК-полимеразы фага Т4
Клонирование гена Т4 ДНК-полимеразы проводили в два этапа, так как сайт для эндонуклеазы XhoI находится внутри последовательности гена и в праймере к 3/-концу гена. Клонирование 5/-концевого фрагмента описано выше.
Анализ клонов проводился обработкой плазмидной ДНК рестриктазами XhoI и SphI. Отщепленный фрагмент свидетельствовал о присутствии клонированного N-конца гена Т4 ДНК-полимеразы (рис 5) в плазмидах четырех клонов.
Клонирование 3'-концевого фрагмента гена 43. Расщепляли полученную плазмиду, содержащую 5'-концевую последовательность гена рестриктазой XhoI. Проводили лигирование со вставкой аналогично предыдущей реакции лигирования.
Трансформировали клетки BL21(DE3), приготовленные кальциевым методом[13].
Анализ клонов проводили обработкой плазмидной ДНК рестриктазой XhoI. В качестве контроля служила ДНК рЕТ21-d с клонированным 5'-концом гена 43 (плазмида pET43N). Было отобрано 2 клона (2 и 9), в которых видна была вставка большого фрагмента. Для определения ориентации большего фрагмента гена 43 (3'-конца) производили гидролиз рестриктазами NsiI и BspLu11II (изошизомер эндонуклеазы XbaI). О результате расщепления судили по электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Полоса, соответствующая 2072 парам оснований, свидетельствовала о правильной ориентации лигированного фрагмента в обоих клонах (рис. 5).
2.2.9 Индукция экспрессии генов
Штрихом засеяли поверхность агара, клетки инкубировали 12 часов при 37 С. Затем засеяли культуру в 50 мл LB-среды и выращивали до плотности 0,5 ОЕ при 590 нм. Отобрали по 5 мл исходной культуры и к основной массе добавили индуктор - ИПТГ (водный раствор) до конечной концентрации 40мкг/мл. После этого клетки оставили расти при 37С. Через 3 часа отобрали по 5 мл индуцированной культуры. По 1 мл всех образцов (исходные и индуцированные) центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Супернатант убрали, образцы заморозили при -200С. К размороженному осадку добавляли лизирующий буфер, объем которого рассчитывался по пропорции:
плотности 0,32 - соответствует 50мкл буфера
измеренной плотности - соответствует Х мкл буфера
Гомогенизировали клетки в соответствующем количестве лизирующего буфера, образцы кипятили в течение 4 минут, после чего наносили на электрофорез (по 10 мкл каждого образца). Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле, буфер "Laemmly". После окончания электрофореза окрашивали гель красителем Кумасси. Затем несколько раз отмывали гель при 100С. Индукция экспрессии генов ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы представлена на рисунках 6, 7, 9, 10, соответственно.
2.2.10 Распределение белка по растворенной и нерастворенной фракциям
50 мл индуцированных клеток центрифугировали на центрифуге Janetzki K23 5 мин при 5000 об/мин. Убрали супернатант и ресуспендировали клетки в 1/10 начального объема (в 5 мл) буфера (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM ЭДТА). Добавили лизоцим до конечной концентрации 100 мкг/мл (использовали свежеприготовленный раствор лизоцима 10 мг/мл). Затем добавили 1/10 объема (0.5 мл) 1% Triton X-100. Инкубировали 15 мин при 30 С. Поместили образцы в ледяную баню и обработали ультразвуком для разрушения ДНК. Раствор потерял вязкость после обработки ультразвуком два раза по 30 секунд с интервалом 2 мин. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 мин при 40С. Супернатант содержал растворенную фракцию. Часть супернатанта, предназаначенную для электрофоретического анализа, развели в два раза двухкратным лизирующим буфером. Осадок ресуспендировали в 5 мл однократного лизирующего буфера для электрофореза. Нанесли на электрофорез (в 10%-ный ПААГ) по 10 мкл каждого образца [14]. Результат представлен на рисунке. 11. Т4 ДНК-полимераза и полинуклеотидкиназа находились в растворенной фракции (рис. 6, 7, соответственно).
2.2.11 Выделение Т4 ДНК-полимеразы
Культуру колеток E. coli с рекомбинантной плазмидой (содержащей ген 43 фага Т4) выращивали в 4-ех колбах по 350 мл среды LB при 37 С с постоянной аэрацией до плотности А590=0,7 О.Е.. Проводили индукцию экспресии гена ДНК-полимеразы фага Т4 добавлением водного раствора ИПТГ (до концентрации 40 мкг/мл). Клетки выращивали еще 3 часа в тех же условиях. Плотность индуцированной культуры составила А590=1.1 О.Е. Клетки осаждали центрифугированием. Масса осадка составила 4г. Для разрушения клеточной биомассы осадок ресуспендировали в 80 мл буфера (50 мМ Трис-НСl, pH 8,0., 2мМЭДТА). Добавили лизоцим до концентрации 100 мкг/мл (8 мг на 80 мл) и 1/100 объема суспензии 10% ТритонаХ-100 (800мкл). Инкубировали 15 мин при 30 С . Клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А при 10 С (30 с- "озвучивание", 2 мин - пауза, 3 раза) до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в 7 раз. Раствор центрифугировали 40 мин при 16000 об/мин. Экстракт развели в 2 раза 2-х кратным Binding-буфером (10мМ имидазол, 1М NaCl, 40мМ Трис-HCl, pH 7,9), фильтровали через стеклянный фильтр и наносили на колонку с Ni2+-NTA-агарозой. Скорость протекания буфера через колонку 60 мл/час, объем образца 120 мл. Колонку промывали 10 объемами (100 мл) Binding-буфера (5мМ имидазол, 0,5 М NaCl, 20 mMТрис-HCl, pH 7,9), затем 6 объемами (60 мл) Wash- буфера (60мМ имидазол, 0,5М NaCl, 20 mM Трис-HCl, pH 7,9) и 4 объемами (40 мл) Elute-буфера (1M имидазол, 0,5 M NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,9).
2.2.12 Выделение полинуклеотидкиназы фага Т4
Культуру клеток E. coli BL21(DE3) выращивали в жидкой среде LB при 37 C с постоянной аэрацией до плотности А590=0,68. Добавляли ИПТГ (40мг/мл) до конечной концентрации 40 мкг/мл.
Клетки выращивали еще 7 часов при тех же условиях и затем осаждали центрифугированием 6000 об/мин 30 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мл ТЕ-буфера (10мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1mM ЭДТА) , центрифугировали 10 мин при 6000 об/ мин. Полученную биомассу хранили при -200С.
Для разрушения клеток 6г биомассы (полученной из 2 литров культуры) ресуспендировали в 80 мл Binding-буфера (5мМ имидазол, 0,5М NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,9 ). Далее клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (40 сек "озвучивание", 2 мин. перерыв) в ледяной бане до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в десять раз. Суспензию разрушенных клеток цен.трифугировали 40 мин при 16000 об/мин. Супернатант пропустили через крупнопористый стеклянный фильтр (для устранения грубых загрязнений), нанесли на колонку с Ni2+-NTA-агарозой, промытую водой (3 объема колонки), 50mM NiSO4 (5 объемов), Binding-буфером (3 объема). После нанесения образца колонку промыли 10 объемами Binding-буфера, а затем 6 объемами Wash-буфера (60мМ имидазол, 0,5 М NaCl, 20мМ Трис-HCl, pH 7,9) и 6 объемами Elute-буфера (1М имидазол, 0,5 М NaCl, 20мМ Трис-HCl, pH 7,9). Фракции, содержащие фермент, объединили, измерили концентрацию полинуклеотидкиназы (по поглощению при длине волны 280 нм). Рассчет коэффициента экстинции проводили по формуле е280= (NTrp*5,500 + NTyr*1,490 + NCys*0,125)/Mr, согласно [48]. В рассчет брались только Cys свободные, не участвующие в образовании дисульфидных связей.
2.2.13 Выделение РНК-лигазы фага Т4
Выделение РНК-лигазы фага Т4 проводили в две стадии.
Выделение фермента на Ni-NTA-агарозе, проводили так же, как и в случае выделения полинуклеотидкиназы. Не удалось очистить фермент от других белков (рис. ), по этому было принято решение провести еще одну стадию выделения.
Фракции, содержащие Т4 РНК-лигазу, объединили и нанесли на колонку с голубой агарозой объемом 10 мл, уравновешенную буфером Е(50 мМ Трис HCl, pH 7,5., 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ). Элюцию проводили 100 мл градиента 0-2М KCl в буфере Е со скоростью 20 мл/час (рис. ). Фракции, содержащие Т4 РНК-лигазу, объединили и диализовали против буфера для хранения (10 мМ Трис HCl, pH 7,5., 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин). Препарат хранили при -20 С. Количество выделенного фермента составило 5,2 мг.
2.2.14 Выделение Tth ДНК-полимеразы
Выделение Tth-полимеразы проводилось согласно методике выделения Taq-полимеразы [9].
Культуру клеток E. coli BL21(DE3) с рекомбинантной плазмидой, несущей ген Tth ДНК-полимеразы, выращивали в жидкой среде LB при 37 C с постоянной аэрацией до плотности А590=0,57. Добавляли ИПТГ до конечной концентрации 40 мкг/мл. Клетки выращивали еще 7 часов при тех же условиях и затем осаждали центрифугированием 6000 об/мин 30 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мл ТЕ-буфера (10мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1mM ЭДТА) , центрифугировали 10 мин при 6000 об/ мин. Полученную биомассу хранили при -20 С.
Для разрушения клеток 3г клеточной биомассы ресуспендировали в 30 мл буфера для выделения (50 мМ Трис НCl рН 7,5, 1мМ ЭДТА, 1,25 мМ PMSF, 2 мг/мл лизоцима). После инкубации в течение 15 минут при 20 С клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (2 мин. "озвучивание", 1 мин. перерыв) в ледяной бане до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в десять раз. Для денатурации белков с нуклеиновых кислот к лизату при постоянном помешивании и 4 С добавляли по каплям сульфат аммония до концентрации 0,2М.
Суспензию разрушенных клеток центрифугировали 30 мин при 20000 об/мин на центрифуге Beckman LS-75 (ротор T35, Beckman, США). Для денатурации белков E. coli супернатант прогревали при 75 С в течение 30 минут. Затем к раствору при постоянном помешивании добавили полиимин Р до концентрации 0,6% при 4 С. Раствор инкубировали 2 часа на льду, а затем центрифугировали 30 мин при 20000 об/мин. Супернатант был нанесен на колонку с фенил-сефарозой объемом 6 мл, уравновешенную буфером А(50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА), содержащим 0,2 М сульфат аммония. Промыли колонку буфером А, содержащим 20% глицерин (wt/vol). Элюцию связавшихся белков проводили 100 мл линейного градиента концентрации мочевины (0-4М) на буфере А со скоростью 10мл/час. Собирали фракции по 5 мл. Оптический профиль элюции определяли по поглощению при 280 нм в проточном спектрофотометре UV-1 ("Pharmacia", Швеция). Фракции, содержащие Tth-полимеразу, объединяли и диализовали в течение ночи против буфера Б (100мМ KCl, 50мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,1мМ ЭДТА, 0,2% Tween20). Диализованный препарат наносили на колонку с гепарин-сефарозой, уравновешенную буфером Б. Элюцию вели 60 мл градиента 100-700 мМ KCl в буфере Б со скоростью 10 мл/час. Фракции собирали по 3 мл. Фракции, содержащие Tth-полимеразу, объединили и диализовали против буфера для хранения (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 100мМ KCl, 0,1мМ ЭДТА, 1мМ дитиотрейтол, 0,2% Tween20, 50% глицерин). Диализованный препарат хранили при -20 С.
2.2.15 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4
Определение активности фермента проводили согласно методике, предложенной Корнбергом [49].
Определение единицы активности: Одна единица фермента катализирует включение 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимую форму за 30 мин при 37 С. Удельная активность ДНК-полимеразы выражается в единицах на миллиграмм фермента.
Реакционная смесь содержала: 67мМ Трис-HCl, pH 8,8., 6,7 мM MgCl2, 1мМ ДТТ, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,2 мг/мл БСА, 0,033мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP), 10 мСi [б -P32] dTTP или dATP денатурированную ДНК спермы лосося или активированную ДНК тимуса теленка.
Буфер для разведения фермента: 67мМ Трис-HCl, pH 8,8., 6,7 мM MgCl2, 1мМ ДТТ, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,2 мг/мл БСА.
В пробы для измерения активности (объем 50 мкл) вносится 1мкл фермента из различных разведений. В качестве контроля берется проба без добавления фермента (фоновое включение dNTP в отсутствии ДНК-полимеразы). Инкубация 30 мин при 37 С. Далее следует 2 варианта:
Вариант 1: Пробы наносятся на ДЕАЕ-бумагу, которая затем промывается 3 раза в 0,5 М Na2HPO4 (pH 7,0) [50]. Бумагу можно оставить влажной до измерения количества импульсов.
Вариант 2: Образцы наносятся на фильтр GFC (Whatman). Фильтры высушиваются и промываются 3 раза по 2 мин в 200 мл раствора 200 мМ Na4P2O7, 5% ТХУ(охлажденной на льду), после чего промываются 70% этанолом и высушиваются [50].
Измеряется радиоактивный фон среды (количество импульсов), затем измеряется количество импульсов, которое дает каждая проба. В качестве контроля - проба не инкубированная и не содержащая фермент (измеряется количество импульсов, которое дает сама метка). Вычисляется процент включения dNTP от суммарной метки в реакции. Отсюда можно выяснить количество dNTP, включившихся за время инкубации (нам известно количество dNTP в реакционной смеси) и активность полимеразы.
3. Результаты и их обсуждение
3.1 Клонирование гена полинуклеотидкиназы фага Т4
Клонирование гена полинуклеотидкиназы фага Т4 в вектор для экспрессии pET28-b проводили по общепринятой схеме. Полученный ПЦР-продукт обрабатывался эндонуклеазами Paq I и Xho I. Paq I (изошизомер BspH I) узнает сайт 5/-TCATGA-3/, внутри которого содержится АTG-кодон. Второй кодон гена начинается с аденина и в последовательности гена отсутствуют сайты для Paq I. Таким образом, удалось без каких-либо сложностей клонировать ген pseT в удобном положении относительно последовательности Шайн-Дальгарно. Индукция экспрессии гена Т4 полинуклеотидкиназы представлена на рисунке 7.
3.2 Клонирование генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы
- Клонирование генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции II-S типа.
- Для достижения того же результата, что и в случае гена pseT (клонирование под ATG-кодон вектора pET21-d) по идее можно использовать еще 3 эндонуклеазы: Nco I, Nde I и BspLu11 I, в сайтах узнавания которых тоже содержится старт-кодон. Но в этом случае мы столкнулись с несколькими проблемами:
- 1) В последовательности генов встречался сайт для рестриктазы (Nco I в последовательности гена Tth-полимеразы, Nde I в последовательности гена Т4 ДНК-полимеразы).
- 2) Налагалось условие на второй кодон, если использовать Nco I для клонирования генов ДНК-полимеразы и РНК-лигазы фага Т4, или Paq I для клонирования Tth-полимеразы. Изменение аминокислоты на N-конце белка может приводить к более быстрой его деградации . Данные относительно этой проблемы приводятся в работах Варшавского, который сформулировал правило N-конца (N-rule) [51].
- 3) Эндонуклеаза Nde I плохо гидролизует ДНК на концах фрагментов (0% расщепления , если сайт находится в пределах 18 п.о. с конца молекулы) [52].
- Решением этих проблем явилось использование уникального свойства эндонуклеаз II-S типа, заключающееся в том, что эти рестриктазы узнают точный сайт, но расщепляют ДНК в стороне нескольких нуклеотидов от него. Например, использованная нами для клонирования гена Т4 ДНК-полимеразы эндонуклеаза BspIS4 I узнает сайт 5/-GAAGAC-3/, а расщепляет ДНК на расстоянии 2/6 нуклеотидов от него [53] (рис. 8).
- Т.к. лучше клонировать ген под старт-кодон вектора, то мы заложили в праймере к 5/-концу клонируемого гена сайт для эндонуклеазы BspIS4I таким образом, чтобы в результате расщепления образовывался такой же липкий конец, что и после действия NcoI (для последующего лигирования с вектором, расщепленным по NcoI-сайту), что показано на рисунке 8.
- Возможность использования этого метода была подтверждена на примере клонирования гена РНК-лигазы фага Т4 и гена Tth-ДНК полимеразы из Thermus thermophilus HB8 с использованием другой II-S рестриктазы- Bli736I. На рисунке 8 изображен сайт узнавания для этой эндонуклеазы и структура праймеров, использованных для амплификации соответствующих фрагментов ДНК.
Индукция экспрессии генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы показана на рисунках 6, 9, 10 соответственно.
3.3 Выделение ДНК-полимеразы и полинуклеотидкиназы фага Т4
Гены этих ферментов были клонированы в pET-вектор таким образом, что на С-конец синтезируемых в последствии белков "навешивался хвост" из 6-ти гистидинов (так называемый His-taq). Такой гистидиновый "хвост" позволяет проводить - афинную хроматографию на Ni2+ -NTA-агарозе. Таким образом белки можно очистить за одну стадию [54]. Осветленный лизат бактериальной массы наносили на колонку с Ni2+-NTA-агарозой. После этого проводили промывку Wash и Elute буферами (концентрация имидазола 60мМ и 1М, соответственно). Т4 ДНК-полимераза элюировалась в Wash-буфере (рис.11), а полинуклеотидкиназа - как в Wash, так и в Elute-буфере (рис. 12). Таким образом было получено 30 мг Т4 ДНК-полимеразы и около 80 мг Т4 полинуклеотидкиназы.
3.4 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4
Определение единицы активности ДНК-полимеразы: Одна единица фермента катализирует включение 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимую форму за 30 мин при 37 С. Удельная активность выражается в единицах активности на миллиграмм фермента.
Реакцию проводили в присутствии меченного [г-32P]АТФ. Активность фермента определяли по эффективности включения меченного дезоксинуклеотида. Были получены различные данные, в зависимости от ДНК, используемой в качестве субстрата. Наибольшее значение активности было получено при использовании в качестве субстрата денатурированной ДНК спермы лосося ( 300000 ед/мг). Более низкое значение получено при использовании кольцевой молекулы М13 с универсальным праймером в качестве затравки ( 151345 ед/мг).
3.5 Выделение РНК-лигазы фага Т4
Очистку РНК-лигазы проводили в две стадии:
Выделение на колонке с Ni2+-NTA-агарозой проводили аналогично вышеописанному случаю. Элюировали белки градиентом концентрации имидазола ( 5мМ- 1М). Но в этом случае не удалось избежать примесей других белков, в связи с чем пришлось проводить дополнительную стадию очистки. Результат хроматографии представлен на рис.13.
Очистка на колонке с голубой агарозой (рис. 13). Этот носитель служит для выделения АТФ-связывающих белков, одним из которых является РНК-лигаза. Элюирование проводили градиентом концентрации 0-2 M KCl. Фермент элюировался в диапазоне концентраций KCl от 200 до 800 мМ.
В итоге получили 5,2 мг фермента с одного грамма клеточной биомассы.
3.6 Выделение Tth ДНК-полимеразы
Выделение Tth-полимеразы проводили согласно методике очистки Taq-полимеразы [9], предполагая, что ферменты при очистке должны вести себя сходным образом, т.к. имеют много общих свойств (высокий процент гомологии).
Очистка Tth-полимеразы включала две стадии (рис. 14):
Хроматография на колонке с фенил-сефарозой. Фермент элюировался в диапазоне концентраций мочевины от 1 до 2,8 М. Фракции, содержащие полимеразу, объединили для следующей стадии очистки (рис. 15).
Хроматография на колонке с гепарин-сефарозой (рис. 15). Фермент с колонки элюировался в диапазоне концентраций от 166 до 266 мМ КCl.
Всего было получено 2,4 мг фермента с 3 граммов клеточной биомассы (из 2л культуры).
3.7 Активности РНК-лигазы и полинуклеотидкиназы фага Т4
Из литературных источников найдены значения удельных активностей для РНК-лигазы (2180 единиц/мг белка) и полинуклеотидкиназы (62000 единицы/ мг белуа). Зная количество выделенных ферментов мы предполагаем, что суммарная активность РНК-лигазы равна 11336 единицам, а активность полинуклеотидкиназы равна 4960000 единиц.
Выводы
Разработан новый универсальный метод клонирования фрагментов ДНК с использованием II-S типа эндонуклеаз рестрикции.
Получены суперпродуценты ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth ДНК-полимеразы из штамма T. thermophilus HB8.
Выделены две ДНК-полимеразы: фага Т4 и T. thermophilus HB8. Оба фермента очищены до функционально чистого состояния. Выход Т4 ДНК-полимеразы составил 7,5 мг с одного грамма клеточной биомассы. Получено 2,4 мг Tth ДНК-полимеразы. Выход белка составил 0,8 мг с грамма биомассы.
Активность ДНК-полимеразы фага Т4 составляет примерно единиц на мг белка.
Выделено 5,2 мг РНК-лигазы фага Т4. Выход белка составил 0,4 мг с грамма клеточной биомассы.
Выделена полинуклеотидкиназа фага Т4. Выход белка составил 13 мг с грамма клеточной биомассы.
Ожидаемая суммарная активность Т4 РНК-лигазы 11336 единиц , Т4 полинуклеотидкиназы - 4960000 единиц активности.
Cписок использованной литературы
1) Корнберг А. // Синтез ДНК - 1977.
2) Kenneth J.M. // Enzymology of DNA in replication in procaryotes - Reprinted from the CRC Critical reviews in biochemistry, 1984, V. 17, Issue2, p.153.
3) Lin T.C., Rush J, SpacerE.K, Konigsberg W. H // Cloning and expression of T4 DNA polymerase - Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1987, v. 84, p.7000.
4) Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот - под ред. Спирина А.С., 1990.
5) Стент Г., Келиндар Р. // Молекулярная генетика - 1981.
6) Kong, Kurcea K.B, Jack W.E. // Characterization of a DNA polymerase from the hyperthermophile Archaea Thermococcus litoralis - JBC, 1993, v. 268, p. 1965.
7) Tabor S, Huber H.E, Richardson C.C // Escherihia coli Thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the Gene 5 protein of bacteriophage T7 - JBC, 1987, v.262, p. 33.
8) Longley M.J., Bennet S.E., Mosbaugh D.W. // Characterization of the 5/ to 3/ exonuclease associated with Thermus aquaticus DNA polymerase - Nucl. Acids Res., 1990, v. 18, No. 24, p. 7317-7322.
9) Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.K., Chang S.Y., Landre P.A., Abramson R.D., Gelfand D.H. //High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5/ to 3/ exonuclease activity - Cold spring harbor laboratory press, 1993, v. 2, p. 275-287.
10) Lu C., Erickson H.P. // Expression in Escherichia coli of the thermostable DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. - Protein expression and purification, 1997, v. 11, p. 179-184.
11) Pfu DNA polymerase. // Instruction manual, Stratagene, 1998.
12) AmpliTaq DNA Polymerase, Stoffel Fragment.
13) Myers, T.W., Gelfand D.H. // Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. - Biochemistry, 1991, v. 30, No. 31, p. 7661.
14) Глухов А.И., Трофимова М.Е., Гордеев С.А., Гребенникова Т.В., Виноградов С.В., Киселев В.И., Крамаров В.М. // Амплификация последовательностей ДНК фага л методом полимеразной цепной реакции с использованием термостабильной ДНК-полимеразы. - Молекулярная биология, 1991, том 25, вып. 6, с.1602-1609.
15) Гребенникова Т.В., Глухов А.И., Чистякова Л.Г., Киселев В.И., Северин Е.С. //Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus КТП в совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции РНК интерлейкина 2б и определение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1). - Молекулярная биология, 1995, том 29, вып. 4, с. 930-941.
16) Смирнов Ю.В., Чахмахчева О.Г., Ефимов В.А. // Рекомбинантная His6-ДНК-полимераза Thermus thermophilus с активностью обратной транскриптазы.- Биоорганическая химия, 1997, том 23, N 4, с. 257-261.
Игнатов К.Б, Крамаров В.М., Чистякова Л.Г., Мирошников А.И.// Факторы, определяющие различную процессивность ДНК-полимераз Thermus thermophilus и Thermus aquaticus при амплификации ДНК фага л. - Молекулярная биология, 1997, том 31, N 6, с. 956-961.
Midgley, C.A., Murray, N.E.// T4 polynucleotide kinase; cloning of the gene (pseT) and amplification of its product. - The EMBO Journal, 1985, v.4, p. 2695-2703.
Richardson, C.C. // Phosphorilation of nucleic acid by an anzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1965, v. 54, p. 158.
Soltis, D.A., Uhlenbeck, O.C. // Independent locations of kinase and 3/-phosphatase activities on T4 polynucleotide kinase. - J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 11340-11345.
Lillehaug, J.R.// Physicochemical properties of T4 polynucleotide kinase. - Eur. J. Biochem., 1977, v. 73, p. 499-506.
Cameron, V., Uhlenbeck, O.C. // 3/-phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. - Biochemistry, 1977, v. 16, p. 5120.
Van de Sande, J.H., Kleppe, K., Khorana, H.J. //Reversal of bacteriophage T4 induced polinucleotide kinase action. - Biochemistry,1973, v. 12, p. 5050.
Teraoka, H., Mizuta, K., Sato, F., Shimoyachi, M., Tsukada, K. // Polynucleotide kinase from rat-liver nuclei - Eur. J. Biochem., 1975, v. 58, p. 297-302.
Levin, C.J., Zimmerman, S.B. // A deoxyribonucleic acid kinase from nuclei of rat liver. - J. Biol. Chem., 1976, v. 251, no. 6, p. 1767-1774.
Harrison, B., Zimmerman, S.B. // T4 polynucleotide kinase: macromolecular crowding increases the efficiency of reaction at DNA termini. - Analytical biochemistry, 1986, v. 158, p. 307-315.
Chaconas, G., Van de Sande, J.H., Church, R.B. // End group labelling of RNA and double stranded DNA by phosphate exchange catalyzed by bacteriophage T4 induced polynucleotide kinase. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, v. 66, p.962-969.
Berkner, K.L., Folk, W.R. // Polynucleotide kinase exchange reaction (Quantitative assay for restriction endonuclease-generated 5/-phosphoryl termini in DNAs). - J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 3176-3184.
Kroeker, W.D., Laskowski, M. // Polynucleotide kinase: functional purification and use in the direct kinetic measurement of single- and double-strand cleavages of DNA by restriction and other endonucleases of limited action. - Analytical biochemistry, 1977, v. 79, pp. 63-72.
Silber, R., Malathi, V,G., Hurwitz, //J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, v. 69, p. 3009-3013.
The Enzymes, 1982, v.XV. T4 RNA ligase.
Lubben, T.H., Gumport, R.I. //The purification of nuclease-free T4-RNA ligase - Biochimica et Biophisica Acta, 1979, v. 562, p. 149-161.
Uhlenbeck, O.C. // T4 RNA ligase - TIBS- March 1983.
Rand, K.N., Gait, M.J. // Sequence and cloning of bacteriophage T4 gene 63 encoding RNA ligase and tail fibre attachment activities - The EMBO Journal, 1984, v.3, p. 397-402.
Sugino, A., Snopek, T.J., Cozzarelli, N.R. //Bacteriophage T4 RNA ligase. - J. Biol. Chem.,1977, v. 252, p. 1732-1738.
Sninsky, J.J., Last, J.A., Gilham, P.T. // The use of terminal blocking groups for the specific joining of oligonucleotids in RNA ligase reactions containing equimolar concentrations of acceptor and donor molecules. - Nucl. Acids Res., 1976, v. 3, p 3157-3166.
Ohtsuka, E., Nishikawa, S., Sugiura, M., Ikehara, M. //Joining of ribooligonucleotides with T4 RNA ligase and identification of the oligonucleotide-adenilate intermediate. - Nucl. Acids Res.,1976, v. 3, p 1613-1623.
Uhlenbeck, O.C., Cameron, V. //Equimolar addition of oligoribonucleotides witn T4 RNA ligase. - Nucl. Acids Res., 1977, v. 4, p 85-98.
Moseman McCoy, M.I., Gumport, R.I. // T4 ribonucleic acid ligase joins single-strand oligo(deoxiribonucleotides). - Biochemistry, 1980, v. 19, p. 635-642.
Krug, M., Uhlenbeck, O.C. // Reversal of T4 RNA ligase - Biochemistry, 1982, v. 21, p. 1858-1864.
Runnels, J.M., Soltis, D., Hey, T., Snyder, L. // Genetic and phisiological studies of the role of the RNA ligase of bacteriophage T4. - J. Mol. Biol., 1982, v. 154, p. 273-286.
Ohtsuka, E., Nishikawa, S., Fukumoto, R., Tanaka, S., Markham, A. F., Ikehara, M., Sugiura, M. //Joining of syntetic ribonucleotides with defined sequences catalyzed by T4 RNA ligase. - Eur. J. Biochem, 1977, v. 81, p.285-291.
Snopek, T.J., Sugino, A., Agarwal, K.L., Cozzarelli, N.R. /./Catalysis of DNA joining by bacteriophage T4 RNA ligase. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, v. 68, p. 417-424.
England, T.E., Uhlenbeck, O.C. // 3/-terminal labelling of RNA witn T4 RNA ligase. - Nature, 1978, v. 275, p 560-561.
Zhang, X.H., Chiang, V.L. // Single-stranded DNA ligation by RNA ligase for PCR cloning of 5/-noncoding fragments and coding sequence of a specific gene. - Nucleic Acids Res., 1996, Mar 1;24(5):990-991.
Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж // Молекулярное клонирование. - 1984.
Avoiding False in coloni PCR // BioTechniques, 1998, v.24, p. 580-582.
Кантор, Ч., Шиммел, П. // "Биофизическая химия", т. 2., Москва, Мир, 1984.
Goulian, M., Lucas, Z.J., Kornberg, A. // Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. - J. Biol. Chem.,1968, v. 243, p. 627-638.
Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. // Molecular cloning: a laboratory manual.- CSHL Press, 1989, Measurement of radioactivity in nucleic acids. p.E 18-E19.
Varshavsky, A. // The N-end rule. - Cell, 1992, v. 69, p. 725-735.
New England Biolabs. 2000/01 Catalog, p.210.
53) Зелинская Н.В., Ковалевская Н.П., Матвиенко Н. Н., Железная Л.А., Матвиенко Н.И // Сайт-специфические эндонуклеаза и метилаза из термофильной бактерии Bacillus species IS4 - Биохимия, 1995, т.60, вып 9, стр. 1435-1449.
54) pET System manual - Novagen. 1995, 6th edition, p. 22.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Транскрипция и основные ферменты, которые осуществляют транскрипцию, ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Структурные и функциональные домены больших субъединиц эукариотической РНК-полимеразы. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот.
реферат [373,5 K], добавлен 29.09.2009Влияние ферментов на возможность и скорость проведения различных манипуляций с ДНК. Общие свойства нуклеаз, их классификация и отличительные черты. Эндонуклеазы рестрикции, их роль в различении собственной ДНК от чужеродной. РНК-зависимые ДНК-полимеразы.
контрольная работа [24,2 K], добавлен 27.07.2009Расщепление цепей ДНК эндонуклеазами рестрикции. Осуществление молекулярного клонирования ферментами ДНК-лигазы. Встраивание фрагмента ДНК в плазмидный вектор. Метод получения рекомбинантных плазмид. Основные этапы клонирования фрагментов чужеродной ДНК.
презентация [242,3 K], добавлен 24.01.2016Размножение РНК-содержащего фага в бактериальной клетке как простой гиперциклический процесс. Общий механизм ферментативного катализа по Михаэлису—Меитен. Однонаправленность циклического воспроизведения интермедиатов. Реалистическая модель гиперцикла.
реферат [678,3 K], добавлен 30.08.2009Протеасомо-опосредованный гидролиз белков. Функции и синтез липоевой кислоты в Escherichia coli. Использование LplA-лигазы в биохимических исследованиях. Методы работы с бактериями Escherichia coli. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле.
курсовая работа [1,1 M], добавлен 23.01.2018История открытия и практического применения бактериофагов. Научные подходы к проблеме природы фагов. Морфологические типы фагов, их химический состав, строение и антигенные свойства. Адсорбция фага на клетке. Лизогения и её биологическое значение.
реферат [2,1 M], добавлен 02.11.2009Сущность химерных ДНК, их назначение. Особенности методов конструирования рекомбинантных ДНК. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Методы его клонирования, контроль над исследованиями и использованием полученных результатов.
реферат [44,8 K], добавлен 04.12.2010Основные группы ферментов генетической инженерии: рестриктазы и лигазы. Регуляция экспрессии гена у прокариот. Способы прямого введения гена в клетку. Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих. Получение трансгенных животных.
курсовая работа [337,4 K], добавлен 24.11.2010Определение ферментов как специфических белков, присутствующих во всех живых клетках биологических катализаторов. Пространственность структурной молекулы ферментов, процесс биосинтеза оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы.
контрольная работа [13,5 K], добавлен 27.01.2011Объекты, полученные в результате клонирования. Метод "переноса ядра" как наиболее успешный из методов клонирования высших животных. Получение стволовых клеток, генетически совместимых с донорским организмом. Репродуктивное клонирование человека.
презентация [657,4 K], добавлен 21.04.2013
