Ферменты ДНК-зависимые ДНК-полимеразы осуществляют комплементарное копирование матрицы. Первый фермент этого типа был открыт в1956 году у E.coli. Эти ферменты последовательно наращивают конец затравки, присоединяя к нему поступающие нуклеотиды [4].

Биосинтез ДНК имеет две основные особенности:

Фосфодиэфирная связь образуется между 3'-гидроксильной группой на конце растущей цепи ДНК, называемой затравкой, и 5'-фосфатной группой очередного дезоксирибонуклеотида. Общее направление роста цепи от 5'-конца к 3'-концу.

Каждый дезоксинуклеотид отбирается с помощью спаривания с основанием цепи ДНК, называемой матрицей.

Очередной нуклеотид поступает в реакцию в активированной высокоэнергетической форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата. В случае синтеза ДНК присоединение очередного нуклеотида к концу затравки сопровождается гидролизом богатой энергией связи и отщеплением пирофосфата, что делает реакцию в целом энергетически выгодной.

Tth-ДНК-полимераза является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, состоит из одного полипептида молекулярной массы 94 кДа. Длина полипептидной цепи 834 аминокислотных остатка. Полимераза обладает 5^/-3^/-экзонуклеазной активностью и не имеет 3^/-5^/-экзонуклеазной (корректирующей) активности [13].

Оптимум рН для ПЦР с Tth-полимеразой находится в пределах от 8,5 до 9,0 [14]. Присутствие 0,01%-ного Твина-20 значительно повышает эффективность ПЦР c участием этой полимеразы, а добавление 0,01%-ного желатина ингибирует ее. Оптимальная концентрация каждого из пары праймеров для данной системы составляет 0,3 мМ. Показана возможность амплифицировать фрагменты ДНК длиной от 500 до 8500 п. н [14].

Одно из замечательных свойств Tth-полимеразы - способность фермента осуществлять синтез ДНК по цепи РНК в качестве матрицы. То есть было обнаружено, что данная полимераза обладает обратно-транскриптазной (ревертазной) активностью. Этот факт послужил стимулом для использования этого фермента в совмещенной реакции обратной транскрипции и ПЦР (ОТ/ПЦР).

Раньше часто проблематично было синтезировать к-ДНК используя мезофильные вирусные обратные транскриптазы из-за встречающихся в РНК стабильных вторичных структур. Различные методы описывают способы дестабилизации комплементарных районов: использование ДМСО, повышение температуры реакции и некоторые другие. Но добавление в реакционную смесь таких соединений и повышение температуры плохо сказывались на мезофильных ферментах.

Многие проблемы, связанные с большим содержанием вторичной структуры, присутствующей в РНК, минимизировались с использованием термостабильной ДНК полимеразы для обратной транскрипции. Стало возможным получать полноразмерные фрагменты ДНК и сразу амплифицировать их с использованием того же фермента. До Tth-полимеразы для этих целей применяли Taq-полимеразу. Но позже выяснили, что Tth-полимераза в 100 раз более активна в сопряженной реакции ОT/ПЦР [13, 15]. Чувствительность реакции, выполненной с использованием Tth-полимеразы позволяет детектировать (обнаруживать) продукт, полученный со 100 копий синтетической к-РНК [13]. В других работах удалось выявить этим же методом 10³ копий РНК интерлейкина 2б (IL-2б) [15] и получить исходя из 400пг суммарной РНК кДНК для мРНКинтерлейкина 1б. Причем слабый сигнал на агарозном гель-электрофорезе наблюдали уже при введении в реакцию 80 пг суммарной мРНК, что эквивалентно 10 клеткам [16].

Эффективность ревертазной стадии ОТ/ПЦР в присутствии различных двухвалентных катионов убывает в ряду: Mn²⁺ > Cu²⁺ > Mg²⁺ > Cd²⁺ >> Co²⁺. Показано, что использование Mn²⁺ вместо Mg²⁺ на стадии ПЦР приводит к снижению эффективности ОТ/ПЦР. В связи с этим авторы статьи после реакции обратной транскрипции (в присутствии 1 мМ MnCl₂) связывали ионы Mn²⁺ EGTA (так как EGTA имеет более низкое сродство к Mg²⁺, чем к Mn²⁺ и другим двухвалентным катионам) и далее проводили ПЦР в присутствии 1,5 мМ Mg²⁺ [15].

Процесс ОT/ПЦР оказался бесценным для выявления экспрессии генов, для амплификации последовательности РНК, последующего субклонирования и анализа, для диагностики инфекционных агентов или генетических заболеваний [13].

Очень интересна работа Игнатова К.Б с соавторами по рассмотрению различий в свойствах Taq- и Tth-полимераз и их возможная связь с аминокислотной последовательностью субдомена "большой палец" [17].Ранее был проведен сравнительный анализ консервативных областей полимеразного домена различных ДНК-полимераз и показано, что консервативный участок субдомена "большой палец" определяет способность ДНК-полимераз связываться с дуплексом матрица-праймер и влияет на процессивность фермента. Авторы сопоставили аминокислотные последовательности "большого пальца" и прилегающего к нему участка этих полимераз и Tth-полимеразы (рис. 2 ). Был заменен фрагмент Pvu I -BamH I гена Tth-полимеразы, кодирующий 492-595 аминокислотные остатки на соответствующий участок гена ДНК-полимеразы I E. coli, кодирующий 103 аминокислоты (586-688). Удалось получить экспресиию гибридного гена, продукт которого, названный Teco-полимеразой, был активен. В другом случае был заменен фрагмент Pvu I-BamH I гена Tth-полимеразы аналогичным фрагментом гена Taq-полимеразы (рис. 2), что привело к замене всех восьми неидентичных аминокислотных остатков в консервативной области "большого пальца". Новый фермент назвали Ttaq-полимеразой.

Ферментативные активности сравнивались при 72^o С для Tth- и Taq-полимераз и при 52^o C для Tth- и Teco-полимераз. Было обнаружено, что внесенные мутации не вызвали существенного изменения их удельной активности. Температурный оптимум Tth-, Taq- и Ttaq-полимераз находится в области 70-72^o С, а Teco-полимеразы- в области 50-52^o С. T_опт Teco-полимеразы на 15^o С выше и на 20^o С ниже Т_опт ДНК-полимеразы I E. coli и Tth-полимеразы соответственно. Более высокую, по сравнению с ДНК-полимеразой I E. coli, температуру функционирования Teco-полимеразы авторы объясняют влиянием термостабильных участков. Teco-полимераза является примером возможности создания функционально активных гибридов термостабильной и мезофильной ДНК-полимераз.

В работе показано, что оптимальной концентрацией Mg²⁺ для Taq-полимеразы является 2 мМ, а для Tth-, Ttaq- и Teco-полимеразы- 5 мМ. Далее была исследована способность полимераз амплифицировать фрагменты ДНК разной длины. ПЦР проводили при 1,5 мМ MgCl₂. При амплификации относительно короткого фрагмента ДНК более эффективной оказалась Taq-полимераза, но при амплификации более протяженных участков (больше 5000 п. о.) выход продукта на единицу активности фермента в случае Tth-полимеразы был значительно выше, чем при использовании Taq- и Ttaq-полимераз. Наличие некомплементарного нуклеотида на 3^/-конце синтезируемой цепи не влияет на эффективность синтеза ДНК Ttaq-полимеразой. Это свидетельствует о том, что Ttaq- так же, как и Tth-полимераза нечувствительна к наличию 3^/-некомплементарного нуклеотида [17].

1.5 Полинуклеотидкиназа фага Т4

Полинуклеотидкиназа фага Т4 (EC2.7.1.78)- продукт раннего гена pseT фага Т4.

Полинуклеотидкиназа катализирует перенос г-фосфата от АТФ на 5^/-OH конец ДНК, РНК или олигонуклеотида . Минимальным субстратом может служить нуклеотид-3^/- фосфат [18,19]. Фосфорилирование 5^/-концов ДНК с помощью АТФ можно детектировать в экстрактах E. coli, инфицированных фагом Т4 уже через пять минут после инфекции. Максимальный уровень активности фиксируется через 20 минут после инфекции [19].

Фермент так же имеет 3^/-фосфатазную активность (удаление 3^/-фосфатной группы), которая предпочитает ДНК в качестве субстрата [18].

Было выявлено, что эти две активности катализируются аминокислотными остатками, локализующимисяся в разных активных сайтах полипептидной цепи [20]. Специфическое расщепление экзопептидазой выявило, что киназная активность находится в N-концевой части, а фосфатазная активность- в С-концевой части полипептидной цепи. С помощью частичного расщепления трипсином был получен фрагмент белка 29 кДа, который не обладал киназной активностью, но имел почти нормальную 3^/-фосфатазную активность [20].

Реакцию, катализируемую полинуклеотидкиназой фага Т4 можно представить следующим образом:

АТФ + 5^/-OH ДНК (РНК) - АДФ + 5^/-Ф ДНК (РНК)

Физико-химические свойства полинуклеотидкиназы.

Фермент является олигомером, состоит из четырех идентичных субъединиц (мономеров), каждая из которых сама по себе не обладает плинуклеотидкиназной активностью. Молекулярная масса мономера 33 кДа, что было определено с помощью аминокислотного анализа и SDS-гель-электрофореза [21]. Гель-фильтрацией была определена молекулярная масса активной полинуклеотидкиназы-140 кДа.

Фенилаланин является N-концевой аминокислотой. Каждый мономер содержит две SH-группы. Высокая ионная сила раствора (0,1М KCl), спермин, АТФ, тимидин-3^/-монофосфат являются компонентами, стабилизирующими олигомерную структуру фермента [21].

Оптимальным рН для реакции фосфорилирования является 7,4-8,0 в Трис-буфере. При рН 7,6 в 0,07 М Na- или К-фосфатном буфере наблюдается лишь 5%-ная активность, по сравнению с активностью в Трис-буфере.

Необходимо присутствие катионов двухвалентных металлов. Оптимальная концентрация Mg²⁺ в реакционной смеси- 10мМ. Mn²⁺ может лишь частично заменять Mg²⁺. При использовании Mn²⁺ в оптимальной концентрации 3,3 мМ сохраняется 50% активности, наблюдаемой в присутствии Mg²⁺. В отсутствии в-меркаптоэтанола наблюдается активность, соответствующая двум процентам от максимальной активности [21].

Оптимальный рН для дефосфорилирования 3^/-концов равен 6,0. Фосфатазная активность не требует присутствия АТФ, более эффективна при взаимодействии фермента с дезоксирибонуклеотидами, чем с рибонуклеотидами. Максимальная фосфатазная активность проявляется при концентрации Mg²⁺ от 3 до 10 мМ. Ионы Mg²⁺ могут быть заменены ионами Co²⁺ без заметных изменений в скорости реакции. Но Mn²⁺, Zn²⁺ илиCa²⁺ не способны заменить Mg²⁺. Не смотря на то, что сравнительно низкая фосфатазная активность наблюдается уже при рН 8,0, перенос 3^/-фосфатов с концов олигорибонуклеотидов зафиксирован даже при рН 10,0 [22].

Было установлено, что реакция фосфорилирования обратима. Это можно определить по появлению [г-³²P]АТФ из [5^/-³²P]-меченного олигонуклеотида в присутствии АДФ. Акцептором фосфата может быть не только АДФ, но и АТФ, в результате чего образуется [д-32P]аденозинтетрафосфат [23]. Отимальный рН для этой реакции 6,0.

Сравнение свойств полинуклеотидкиназы фага Т4 и полинуклеотидкиназы из ядер печени крысы.

Полинуклеотидкиназа из ядер печени крысы значительно отличается по своим физико-химическим свойствам от соответствующего фермента фага Т4. Молекулярная масса фермента 80 кДа. Это односубъединичный белок. Оптимальный рН для функционирования 5,5, хотя заметная активность проявляется до рН 8,0. По результатам проведенных опытов можно сделать вывод, что фермент в основном локализован в ядрах клеток [24]. Киназа из ядер печени крысы неактивна на 5^/-OH-концах молекул РНК или олигодезоксирибонуклеотидах короче 10-12 оснований. Для этого фермента можно более точно написать уравнение катализируемой реакции:

5^/-OH конец ДНК + АТФ - 5^/-фосфат конец ДНК + АДФ

Этот фермент способен фосфорилировать 5^/-OH концы как одноцепочечных молекул ДНК, так и концы или ники в двухцепочечных молекулах [25]. Ионы Mg²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Ca²⁺ поддерживают высокую активность фермента , в то время как ионы Cu²+ являются ингибиторами. Обычным субстратом для измерения активности этой киназы является одноцепочечная ДНК длиной 100-200 п. о.[25].

Функция полинуклеотидкиназы в клетках млекопитающих остается неясной. Возможно, она играет особенную роль в репарации поврежденной ДНК в кооперации с полинуклеотид лигазой [24].

Использование полинуклеотидкиназы фага Т4

1) Киназная и фосфатазная активности фермента при желании могут быть использованы независимо. При инкубации в отсутствии АТФ 3^/-фосфат можно убрать с ДНК или РНК без разрушения 5^/-фосфата. Если олигонуклеотид с 3^/-фосфатом инкубировать в присутствии фермента и АТФ при рН 9,0 (или выше) ограниченное время, то 5^/-фосфат может быть введен не затрагивая основной массы 3^/-фосфатов [22].

2) 5^/-концевой гидроксил полинуклеотида может быть мечен как с помощью прямой реакции, так и с помощью реакции обмена, которую фермент катализирует в присутствии [г-³²P]АТФ и АДФ [26]:

5^/-ОН-конец + АТФ - 5^/-Фосфат-конец + АДФ

Таким образом можно использовать обратную реакцию для прямого мечения 5^/-фосфорилированных концов двухцепочечных нуклеиновых кислот избегая предварительного дефосфорилирования [27].

Киназную реакцию можно ускорить (улучшить) добавлением ПЭГ, что может обеспечить более эффективную реакцию при очень низких концентрациях субстрата [26].

3) Разработан быстрый и количественный метод измерения активности эндонуклеаз рестрикции второго класса. Он позволяет количественно определить число сайтов разрезания эндонуклеазой на молекуле ДНК. Число образуемых фрагментов в молях может быть определено по количеству включенной в нуклеотидную цепь радиоактивности, т. к. величина введенной метки ³²Р пропорциональна числу образующихся концов ДНК и не зависит от количества нуклеотидов в ней [28, 29].

1.6 РНК-лигаза фага Т4

Т4 РНК-лигаза была открыта в 1972 году в лаборатории of Hurwitz. Фермент был обнаружен как активность, катализирующая циклизацию гомополирибонуклеотидов с 3^/-концевым гидроксилом и 5^/-концевым фосфатом с образованием 3^/-5^/ фосфодиэфирной связи [30]. РНК-лигаза (ЕС 6.5.1.3) продуцируется клетками E. coli, зараженными фагом Т4. Фермент катализирует АТФ-зависимое внутри- и межмолекулярное образование фосфодиэфирной связи между 5^/-фосфат и 3^/-гидроксильным концами РНК. Реакция сопровождается гидролизом АТФ до АМФ и пирофосфата. [31,32,33]. Фермент может осуществлять межмолекулярную реакцию как с РНК, так и с ДНК. В 1977 году было показано, что РНК-лигаза является продуктом гена 63 (gp63) фага Т4 и что этот же фермент осуществляет присоединение хвостового отростка к базальной пластине фага [31,34].

Физические свойства РНК-лигазы

Молекулярная масса фермента по данным SDS-электрофореза колеблется от 41 до 45 кДа. В неденатурирующих условиях масса составляет 47 кДа по результатам гель фильтрации и 48,2 кДа по данным седиментационного ультрацентрифугирования.

Изоэлектрическая точка для фермента 6,1. Поглощение раствора белка при концентрации 1 мг/мл и длине волны 280 нм составляет 1,3 [31].

Реакции, осуществляемые РНК-лигазой.

Е + АТФ Е-рА + РРi

Е-рА + рNn Е [A5^/ pp5^/ Nn]

Е [A5^/ pp5^/ Nn] + Mm MmpNn + AMФ + Е

А. Прямая межмолекулярная реакция.

Рисунок 3 Показывает механизм прямой межмолекулярной реакции. Олигорибонкулеотид А₃ с 3^/-ОН концом (называемый акцептором) присоединяется к 5^/-фосфорилированному донору рСр. Изучение субстратной специфичности фермента позволило сделать вывод, что в РНК-лигазе содержится как минимум 3 сайта, связывающих нуклеотиды. Первый сайт связывает АТФ, второй связывает акцептор, содержащий реактивный 3^/-гидроксил и третий связывает донор, несущий 5^/-фосфат для связывания с акцептором.

Cубстрат-связывающие сайты фермента имеют разную специфичность.

Донорный сайт связывает остаток нуклеозида и его две ассоциированных фосфатных группы с наименьшей специфичностью к нуклеозиду.

Акцепторный сайт связывает 3 нуклеозида и 2 фосфата. При этом выявляется сильное предпочтение к рибонуклеозидам, в сравнении с дезоксирибонуклеозидами.

АТФ-связывающий сайт высоко специфичен относительно аденозиновой части молекулы АТФ[31].

Аденилирование фермента с АТФ с освобождением пирофосфата- первое событие, происходящее в процессе образования фосфодиэфирной связи. Эта реакция может происходить в отсутствии донора и акцептора. Аденилированный фермент может освобождаться в присутствии пирофосфата с восстановлением АТФ. Аденилированный фермент можно отделить от свободного с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS [31,34]. Один моль АТФ связывается с одним моль фермента.

2) Образование аденилированного донора. Адениловая-группа переносится с фермента на 5^/-фосфат донора. Образование 5^/>5^/ ангидридной связи активирует 5^/-фосфат донора для последующей реакции. Образование активированного донора стимулируется присутствием акцептора.

Акцептор является не только субстратом в реакции, но и кофактором для аденилирования молекулы донора. В отсутствии 3^/-OH группы активированный промежуточный продукт не образуется [35] Стимулирование акцептором переноса аденила с фермента на донор может служить для согласованной реакции, чтобы убедиться, что акцептор находится на поверхности фермента, когда донор активируется. Но, когда в реакции мало акцепторов, активированный донор может диссоциировать с фермента [36,37,38].

Субстратная специфичность по отношению к молекуле донора в реакции аденилирования может быть определена невпрямую, а по всей реакции соединения. Рибонуклеозид 3^/-5^/-бифосфат может служить субстратом, тогда как 5^/-нуклеозид монофосфат- нет, даже если последний имеет 5^/-фосфат. Таким образом, по крайней мере остаток из одного нуклеотида и 3^/-фосфат необходимы для того, чтобы служить донором. Второй фосфат должен быть на 3^/-гидроксильном конце, т. к. рибонуклеозид 2^/,5^/-бифосфат не участвует в реакции. Сайт связывания донора, возможно, не выходит за пределы начального 5^/-pNp района донора, т. к. скорость реакции с серией гомологичных доноров pA_np c одним и тем же акцептором почти одинакова.

ДНК может присоединяться в качестве донора, но для успешного осуществления реакции необходимо уменьшить температуру инкубации (ниже обычных 37), увеличить количество фермента и увеличить время инкубации [39]. Донор такой же длины, что и ДНК цХ174, может служить субстратом для РНК-лигазы.

Эффект нуклеотидного состава донора на скорость реакции: с пиримидиновыми pNp в 2-10 раз лучше, чем с их пуриновыми парами. Разрешаются модификации в сахаре, в основании и 5^/-фосфате. В общем, оказывается, что чем больше основание в pNp, тем меньше реактивность в качестве субстрата, то есть эффективность донора : пиримидин > пурин > модифицированный пурин.

3) Образование фосфодиэфирной связи. 3^/-гидроксил молекулы акцептора вытесняет АМФ из активированного донора и образует фосфодиэфирную связь. Активированный донор, как выделенный из реакционной смеси с РНК-лигазой, так и синтезированный химически, взаимодействует с акцептором в отсутствии АТФ с образованием фосфодиэфирной связи и освобождением АМФ. Реакция освобождения АМФ координирована с образованием олигонуклеотидов. Один АМФ освобождается при образовании одной фосфодиэфирной связи.

Образование фосфодиэфирной связи продукта требует свободного от АТФ фермента. Добавление АТФ в реакцию изолированного аденилированного донора и акцептора уменьшает образование продукта. Предполагается, что аденилированный фермент неактивен в третьей реакции.

Тринуклеозид дифосфат-является олигонуклеотидом минимального размера, который может служить акцептором. Различные динуклеозид монофосфаты, например, GpG, UpI и pA₂ могут быть присоединены к соответствующим донорам. Акцепторы, имеющие длину более трех остатков, не увеличивают выход реакции. Видимо, акцепторный сайт РНК-лигазы узнает 3 нуклеотида и 2 фосфата. В реакции могут участвовать молекулы, сравнимые по размерам с рибосомальной и вирусной РНК.

Обнаружена зависимость эффективности акцептора в реакции от крайнего основания в молекуле акцептора ("эффект крайнего основания"). "Лучшие" акцепторы- гомополимеры и олигомеры, содержащие адениновые остатки, тогда как акцепторы, содержащие С или U, и только U, являются "худшими". Видимо, из-за того, что тримеры UAG и AUG реже встречаются, чем AAG, фермент проявляет дискриминацию по отношению к уридиновым остаткам в любых трехнуклеотидных акцепторных сайтах. Для иллюстрации величины инактивирующего эффекта для уридиновых остатков приводится тот факт, что для добавления донора к U₃ необходимо в 30 раз больше времени, чем в том же случае по отношению к А₃ [31].

Больший эффект наблюдается при тестировании ДНК в качестве акцептора. С олигонуклеотидами dA₄ реакция протекает в 200 раз медленнее, чем с rA₄, при одинаковых молекулах донора. Для соединения ДНК пока невозможно добиться большей скорости, чем 2 превращения в час. Причина такой низкой активности ДНК неясна. Видимо, 2^/-гидроксил косвенно вовлечен в реакцию. Добавление одного 3^/-концевого рибонуклеотида к дезоксирибонуклеотиду увеличивает реактивность последнего, и наоборот, добавление дезоксирибонуклеотида к 3^/-концу рибонуклеотидного акцептора делает его менее активным.

Двухцепочечные структуры часто ингибируют реакцию, катализируемую РНК-лигазой. В разных случаях получаются различные результаты. В одних случаях дуплексные структуры не могут связываться с донорным или акцепторным сайтом фермента, тогда как в других случаях связывание происходит без особых осложнений. Пока никакой ясной картины этого феномена не наблюдается.

В. Реакция циклизации (внутримолекулярная реакция).

Эту реакцию можно рассматривать как частный случай межмолекулярной реакции, в которой донор и акцептор являются частью одной молекулы. Так как. взаимодействие концов одной молекулы более вероятно, чем взаимодействие концов разных молекул, то внутримолекулярная реакция идет быстрей, с затратой меньшего количества фермента, по ставнению с межмолекулярной реакцией.

"Эффект крайнего основания" такой же, как и при межмолекулярной реакции.

Эффект длины. Кольцевые молекулы не могут образовываться, если они слишком коротки, или слишком длинны (низка вероятность взаимодействия концов олигорибонуклеотидов). Изучение этой проблемы позволило сделать вывод, что самым коротким олигомером в реакции может быть молекула из 8 нуклеотидов [31,36]. Скорость реакции увеличивается до максимальной при длине полимеров в 10-16 нуклеотидов, но при дальнейшем увеличении длины скорость реакции уменьшается. Аналогично для цепи ДНК: самым коротким олигомером может служить цепь из 6 остатков. Скорость наиболее высокая при 8-20 членном олигомере и низкая уже при длине в 30 оснований. Как и межмолекулярная реакция, циклизация требует присутствия АТФ (именно dATФ!) [31].

Реакция циклизации является основой для определения активности фермента. Циклизация [5^/-³²P]олигоаденилата детектируется по устойчивости концевого фосфата с последующей обработкой щелочной фосфатазой.

Единица активности РНК-лигазы определяется как включение 1 нмоль олиго(А) в фосфатаз- устойчивую форму за 30 мин при 37° С [33].

С. Обратная реакция (Reversal of T4 RNA ligase)

Обратная реакция была обнаружена по появлению несоответствующих ожидаемым продуктам реакции. В работе [40] показали, что возможен обратный ход второй и третьей реакции. В итоге обратная реакция включает перенос 3^/-концевого (например, pCp) остатка с одного олигомера на другой:

A₃Cp + ACG A₃ + ACGCp

Эта реакция стимулируется добавлением АМФ , но никаким другим 5^/-нуклеозид дифосфатом. АТФ ингибирует обратную реакцию, т. к. образуется аденилированный фермент [31].

Не смотря на то, что не было сделано прямого сравнения, очевидно, что обратимость последних реакций синтеза олигомеров может происходить со скоростями, сравнимыми со скоростью прямой реакции. Это отличительная реакция РНК-лигазы фага Т4, в сравнении с Т4 ДНК лигазой, которая катализирует обратную реакцию с гораздо меньшей скоростью, чем прямую.

Обратная реакция может привести к трудностям при использовании РНК-лигазы в синтезе олигонуклеотидов.

Сравнение свойствТ4 РНК-лигазы с ДНК-лигазой фага Т4

Механизм реакции с РНК-лигазой аналогичен реакции, катализируемой Т4 ДНК лигазой [31]:

В обоих случаях комплекс фермент-АМФ удерживается фосфоамидной связью.

Оба фермента активируют 5^/-фосфат донора с помощью переноса на него АМФ и образуя ангидридную связь.

Третий шаг в реакции включает вытеснение АМФ и образование фосфодиэфирной связи в продукте реакции.

РНК-лигаза предпочитает РНК-субстрат, тогда как ДНК-лигаза предпочитает соединять молекулы ДНК.

Биологическая роль продукта гена 63 фага Т4

РНК-лигазная активность детектируется через 3 минуты после инфекции клеток фагом, что позволяет рассматривать этот белок как ранний. В мутантах, дефектных по репликации ДНК, РНК-лигаза накапливается с различными другими ранними белками. Это указывает на то, что РНК-лигаза находится под контролем гена regA, который является посттранскрипционным репрессором ранних функций. Таким образом, можно предположить, что РНК-лигаза может быть необходима на ранних стадиях инфекции, возможно, в ДНК-репликации или в выключении клеток хозяина.

Продукт гена 63 является одним из белков, обеспечивающих сборку фага, но не входящих в состав фаговых частиц. Присоединение хвостовых нитей (TFA, tail fibre attachment) к базальной пластинке нековалентно, не требует АТФ и ионов Mg²⁺ , может происходить в отсутствии РНК-лигазы с низкой скоростью. Было показано, что продукт гена 63 появляется как на ранних, так и на поздних стадиях инфекции. Это подтверждает участие фермента в сборке вируcных частиц [31].

Установлено, что две активности РНК-лигазы не связаны между собой. Было показано, что несколько мутантов по гену 63, названных rli не имели РНК-лигазной активности, но нормально присоединяли хвостовые отростки [30,33,41]. В частности, один из амбер-мутантов (в С-концевой части белка) не имел РНК-лигазной активности, но обладал TFA-активностью [33].

Функция РНК-лигазы in vivo все еще остается неясной. Но можно сделать несколько предположений о биологической роли этого фермента:

Возможно, что in vivo она участвует в репарации РНК или в предотвращении экзонуклеазного расщепления РНК (образованием кольцевого полирибонуклеотида) [30].

Способность фермента соединять молекулы РНК указывает на возможность его участия в рекомбинации молекул РНК [30].

Образование сополимеров РНК-ДНК может происходить in vivo

РНК-лигаза- является продуктом гена 63, который может катализировать присоединение базальных пластинок фага Т4 при его сборке.

Есть предположение, что РНК-лигаза больше участвует в метаболизме ДНК, нежели в РНК-процессинге [41].

Есть версия, что РНК-лигаза участвует в процессинге т-РНК.

Видимо, РНК-лигаза является многофункциональным ферментом.

Применение РНК-лигазы фага Т4

РНК-лигаза широко используется для синтеза олигорибонуклеотидов заданной последовательности оснований [31, 42]. При этом в качестве доноров используются олигонуклеотиды с блокированными 3^/-концами, т. к. олигомеры с длиной больше, чем 8 оснований, могут участвовать во внутримолекулярной реакции, образуя циклические соединения . Разрешение проблемы -использование 3^/-фосфорилированного донора или химическая модификация 2^/- или 3^/-гидроксильной группы концевого нуклеотида донора [42].

Способность РНК-лигазы соединять одноцепочечные молекулы ДНК может использоваться для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов [43].

С помощью РНК-лигазы можно производить радиоактивное мечение 3^/-концов молекул РНК. В реакции используется [5^/-³²P]pNp в качестве донора и РНК как акцептор. Эта реакция получается аналогичной мечению 5^/-конца цепи РНК in vitro с помощью полинуклеотидкиназы и [г³²P]ATФ, и может быть использована в ситуации, когда 5^/-концевое мечение невозможно [44].

Получение модифицированных нуклеиновых кислот при использовании модифицированных pNp [31,44].

Разработан метод амплификации фрагментов ДНК, содержащих последовательность определенного гена и примыкающую к нему 5^/-некодирующую область (так называемый "заякоренный ПЦР"- anchored PCR). В данном случае делают ПЦР с геномной ДНК или кДНК с использованием одного специфического праймера (А) к 3^/-концу определенного гена. К 3^/-концу одноцепочечного продукта реакции (последовательность этого конца неизвестна) "пришивается" лигируется олигонуклеотид В (с любой выбранной последовательностью нуклеотидов) с помощью Т4 РНК-лигазы (рис. 4). Затем для получения двухцепочечного фрагмента проводится ПЦР с использованием праймеров А и С ( С комплементарен праймеру В) . Далее можно лигировать полученный фрагмент с вектором [45].

2. Экспериментальная часть

Для очистки амплифицированных фрагментов ДНК от белков и продуктов неспецифического синтеза ДНК использовали методику выделения ДНК из геля . Проводили электрофорез в легкоплавкой агарозе, затем вырезали участок геля, в котором содержался нужный фрагмент ДНК. Помещали его в прбирку Eppendorf на 2 мл, заливали полностью 4М гуанидинтиоционатом (растворение агарозы), добавляли раствор silica (Merk, Германия) и инкубировали 20 мин при 56 С. Затем центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Осадок стекла ресуспендировали в 200 мкл гуанидинтиоционата, опять центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Точно так же осадок промывали 60% этанолом 3 раза (М Трис-HCl, ). Осадок высушивали, добавляли необходимое количество воды, инкубировали 20 мин при 56 С (элюирование ДНК со стекла). Центрифугировали 3 мин при 3000 об/мин, отбирали супернатант (раствор ДНК).

2.2.3 Подготовка вектора

Использовали плазмиды pET-21d и pET-28b, в полилинкере которых есть сайты для рестриктаз NcoI, XhoI и EcoRI. Для клонирования генов ДНК-полимеразы и РНК-лигазы фага Т4 использовали вектор pET-21d, обработанный эндонуклеазами NcoI и XhoI. Ген Т4 полинуклеотидкиназы клонировали в pET-28b, обработанную теми же эндонуклеазами. Для клонирования гена Tth-полимеразы использовали плазмиду pET-21d, обработанную рестриктазами NcoI и EcoRI. Расщепление проводили одновременно в двух пробах с разными рестриктазами для того, чтобы можно было проследить за полнотой гидролиза ДНК каждым ферментом. Для расщепления вектора внесли 12 мкл (7мкг) ДНК pET-21d (pET-28b), 12 мкл десятикратного буфера для рестрикции (МRB), добавили воды до объема смеси 120 мкл. Из этой смеси отобрали 20 мкл (как контроль), оставшееся количество поделили пополам (по 50 мкл). В одну пробу добавили рестриктазу XhoI (EcoRI), в другую- NcoI. Инкубировали при 37^o C 3 часа. Проводили инактивацию ферментов прогреванием при 65^o C 20 мин. Полноту гидролиза оценивали по электрофорезу. После полного расщепления вектора первыми рестриктазами, к смеси добавляли вторые рестриктазы (к образцу с плазмидой, расщепленной по сайту XhoI (EcoRI), добавляли NcoI, и наоборот), инкубировали образцы при 37^oC 3 часа. Инактивировали ферменты добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 mM. Очистку ДНК вектора проводили с помощью выделения из геля (легкоплавкая агароза) по методике, описанной выше.