Определение уроновых кислот и полиуронидов

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОНОВЫХ КИСЛОТ И ПОЛИУРОНИДОВ

Казань, 2009

Введение

В состав кислых полисахаридов и полиуронидов древесины входят звенья двух гексуроновых кислот -- D-глюкуроновой и D-галактуроновой. Звенья D-глюкуроновой кислоты преимущественно содержатся в полисахаридах гемицеллюлоз, а звенья D-галактуроновой кислоты в виде галактуронанов входят в состав пектиновых веществ.

Методы определения общего содержания уроновых кислот в древесине основаны на реакции декарбоксилирования под действием сильных минеральных кислот. Одновременно происходит гидролиз полисахаридов. Обычно используют 12...19%-ную соляную кислоту. Звенья уроновых кислот при этом превращаются в звенья пентоз, из которых в результате реакций гидролиза гликозидных связей и дегидратации образуется фурфурол.

Выход фурфурола составляет только 35...40% от теоретического, что, вероятно, объясняется образованием из глюкуроноксиланов при гидролизе сначала альдобиуроновой кислоты, в которой уроновая кислота связана с молекулой ксилозы. Альдобиуроновые кислоты гидролизуются дальше с образованием составляющих Сахаров уже значительно труднее.

Дальнейший анализ сводится к определению образовавшегося диоксида углерода гравиметрическими или титриметриче-скими методами. Во всех методах диоксид углерода поглощают щелочами и по количеству поглощенного диоксида углерода рассчитывают массовую долю уроновых кислот в древесине.

Для количественного определения CO₂ предложены различные методы: поглощение CO₂ аскаритом или же раствором гидроксида калия в приборах для поглощения газов с последующим гравиметрическим определением -- взвешиванием прибора-поглотителя до и после опыта; поглощение CO₂ растворами гидроксида бария или натрия с последующим титрованием избытка щелочи и др. Для анализа разработан ряд методов, в том числе микро- и полумикрометодов, и конструкций установок. Из сферы реакции CO₂ удаляют с помощью азота или воздуха, очищенного от CO₂.

Обработку древесины соляной кислотой обычно проводят в реакционной колбе, нагреваемой масляной или глицериновой баней, при температуре 140...145°С.

При проведении реакции декарбоксилирования следует учитывать возможное присутствие в исследуемом материале карбонатов. С этой целью рекомендуют проводить предварительное нагревание реакционной смеси при температуре бани 70°С в течение 10...15 мин.

Реакция декарбоксилирования уроновых кислот 12...13%-ным раствором HCI обычно заканчивается через 4 ч. Применение 19%-ного раствора HCI снижает необходимую продолжительность обработки, но одновременно приводит к некоторому увеличению выхода диоксида углерода из других источников, помимо уроновых кислот. Опытным путем установили, что для декарбоксилирования уроновых кислот в этих условиях требуется примерно 200 мин, для компенсации ошибок из-за постороннего CO₂ рекомендуют обработку продолжительностью 140...160 мин.

Все методы определения выхода CO₂ из древесины и другого растительного сырья, основанные на реакции декарбоксилирования, обычно дают завышенные результаты, так как диоксид углерода частично образуется из гексоз при их разложении в кислой среде, причем железо,, переходящее при этом из древесины в гидролизат, служит катализатором этой реакции. Выход диоксида углерода в результате разложения гексоз может достигать 0,2....0,3% от абсолютно сухой древесины. Следовательно, получение при анализе результатов в этих пределах не обязательно служит доказательством присутствия уроновых кислот. Однако установить точную поправку практически невозможно, и при малом содержании уроновых кислот метод становится неточным.

Зная общую массовую долю уроновых кислот в древесине, найденную по реакции декарбоксилирования, и долю уроновых кислот, входящих в виде полигалактуронанов р состав пектиновых кислот, по разности можно рассчитать массовую долю звеньев уроновых кислот, входящих в состав полисахаридов гемицеллюлоз.

Для раздельного определения в растительном сырье глюкуроновой и галактуроновой кислот используют гидролиз растительной ткани с последующим анализом гидролизатов методами бумажной хроматографии, электрофореза на бумаге или газожидкостной хроматографии.

При определении звеньев уроновых кислот в технической и окисленной целлюлозах учитывают поправку на образование диоксида углерода из самой целлюлозы. Кинетика выделения CO₂ из звеньев уроновых кислот и самой целлюлозы различна, что и позволяет отличить одну реакцию от другой. Из уроновых кислот CO₂ образуется с большой первоначальной скоростью, которая постепенно снижается до нуля. Из целлюлозы же CO₂ образуется медленно, сохраняя постоянную скорость реакции на протяжении длительного времени. Таким образом, форма кривой скорости реакции может служить признаком присутствия или отсутствия групп уроновых кислот в целлюлозе. Уистлер и Невел разработали метод и прибор для определения уроновых кислот в целлюлозе с гравиметрическим определением CO₂ после поглощения его аскаритом. Для внесения поправки на образование CO₂ из целлюлозы в аналогичных условиях проводят обработку чистой хлопковой целлюлозы.

1. Определение уроновых кислот полумикрометодом Беркера

Метод основан на обработке древесины 19%-ной соляной кислотой с поглощением CO₂ раствором гидроксида натрия и последующим титрованием его избытка соляной кислотой. Для того чтобы карбонат натрия не мешал установлению точки эквивалентности, добавляют раствор хлорида бария

Анализ проводят в стеклянном аппарате, состоящем из двугорлой остродонной колбы / вместимостью 50 см³, снабженной капилляром 2, доходящим до дна колбы, и обратным шариковым холодильником 3. В верхней части холодильника имеется ловушка 4, заполненная гранулированным цинком. Ловушка соединена с поглотителем 5. Все части аппарата соединены шлифами и стянуты пружинами. Во время работы аппарата через него пропускают из газометра ток азота или воздуха, освобожденного от диоксида углерода. Скорость потока газа через капилляр регулируют краном и дополнительным зажимом, установленным на резиновом шланге, соединяющем капилляр с газометром через систему очистки газа.

Методика анализа. Навеску воздушно-сухих опилок массой 0,2...0,3 г помещают в реакционную колбу и добавляют пипеткой 3 см³ 19%-ного раствора HCI. Через установку в течение 10 мин пропускают ток азота для удаления CO₂ из установки. Затем в поглотитель пипеткой вливают 5 см³ раствора гидроксида натрия концентрацией 0,25 моля/дм³, присоединяют поглотитель и устанавливают ток азота со скоростью один пузырек в 2...3 с.

Под реакционную колбу ставят предварительно нагретую до 145°С баню со сплавом Вуда, причем уровень сплава должен быть примерно на 2,5 мм ниже уровня жидкости в колбе. Нагревание колбы при температуре бани 145°С продолжают 2,5 ч. Затем баню убирают и еще 10 мин пропускают азот со скоростью 2...3 пузырька в секунду. После этого поглотитель отсоединяют, содержимое его выливают в коническую колбу вместимостью 100 см с притертой пробкой, тщательно смывают остатки раствора дистиллированной водой, присоединяя промывную воду к раствору в колбе. Добавляют в колбу 2 см³ 10%-ного раствора BaCb и 2 капли раствора фенолфталеина. Оттитровывают избыток щелочи соляной кислотой с концентрацией 0,1 моль/дм³ до обесцвечивания фенолфталеина. Аналогично проводится контрольный опыт. Массовую долю уроновых кислот,% к абсолютно сухой древесине, рассчитывают по формуле

где а -- расход на титрование раствора HCl концентрацией 0,1 моль/дм³ в контрольном опыте, см³; b -- расход на титрование раствора HCl концентрацией 0,1 моль/дм³ в рабочем'опыте, см³; 0,0097 -- масса уроновых кислот, соответствующая 1 см³ раствора HCI концентрацией 0,1 моль/дм³, г; g -- масса абсолютно сухой навески древесины, г.

Расхождение между результатами двух параллельных определений не должно превышать 0,5%.

2. Пектиновые вещества и методы их определения

В древесине в срединной пластинке пектиновые вещества присутствуют преимущественно в нерастворимой форме, т. е. в виде протопектина. В состав комплекса протопектина входят галактуронаны, арабинаны и галактаны, частично связанные между собой химическими связями. Нерастворимость протопектина в воде обусловлена образованием карбоксильными группами галактуронанов солей кальция и магния, с возникновением поперечных мостиков между цепями. Поэтому для извлечения пектиновых веществ из древесины вместо экстрагирования водой применяют обработку горячими растворами оксалата или цитрата аммония, приводящую к разрушению этих мостиков в результате обменной реакции с образованием нерастворимых солей -- оксалатов или цитратов кальция и магния.

Для количественного определения полиуронидной части пектиновых веществ можно использовать гравиметрический кальций-пектатный метод, основанный на гидролизе сложноэфирных групп пектиновой кислоты под действием гидроксида натрия, в результате чего пектиновая кислота превращается в полигалактуроновую кислоту, называемую пектовой кислотой, с последующим осаждением из раствора пектата кальция.

Кальций-пектатный метод имеет ряд недостатков: неполное осаждение полиуроновых кислот при одновременном осаждении нейтральных полисахаридов; невозможность определения всех составляющих комплекса пектиновых веществ, т. е. не только его полиуронидной, но и нейтральной части; большая длительность анализа.

Для одновременного количественного определения массовой доли в древесине и состава пектиновых веществ предложен спектрофотометрический метод, позволяющий с помощью о-толуидинового реагента определять полиуроновые кислоты, гексозавы и пентозаны непосредственно в растворе без осаждения. Метод основан на извлечении пектиновых веществ раствором цитрата аммония с последующим гидролизом полиуронидов и полисахаридов серной кислотой и определением образовавшихся моносахаридов и галактуроновой кислоты с о-толуидиновым реагентом. Образующиеся окрашенные соединения определяют спектрофотометрический методом.

В работе установлены оптимальные условия анализа, которые и приводятся в изложенной ниже методике. Для нахождения моносахаридного состава нейтральных полисахаридов комплекса пектиновых веществ можно использовать хроматографический анализ.

3. Определение пектиновых веществ спектрофотометрический методом с отолуидиновым реагентом

Методика анализа. Навеску измельченной древесины или другого растительного сырья массой около 1 г помещают в грушевидную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 40 см³ 1%-ного раствора цитрата аммония и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке в течение I ч. Полученный раствор отфильтровывают горячим через конусообразную стеклянную воронку с бумажным фильтром в мерную колбу на 100 см³. Попавшие на фильтр частицы древесины смывают новой порцией 1%-ного раствора цитрата аммония и повторяют обработку. Остаток древесины в колбе и на фильтре промывают небольшим объемом горячей дистиллированной воды и присоединяют промывные воды к раствору в мерной колбе. После охлаждения колбы с раствором до 20°С его объем доводят до метки дистиллированной водой.

Для проведения гидролиза полиуронидов и полисахаридов отбирают пипеткой 5 см³ раствора пектиновых веществ в кругло-донную колбу вместимостью 25 см³, добавляют пипеткой 5 см³ раствора серной кислоты концентрацией 4 моль/дм³, вносят стеклянные «кипятильники» и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке в течение 3 ч.

Гидролизат охлаждают до комнатной температуры и нейтрализуют равным объемом раствора карбоната натрия концентрацией 2 моль/дм³. Нейтрализацию из-за сильного вспенивания проводят в высокой пробирке. Можно нейтрализовать не весь, а только часть гидролизата, достаточную для последующего анализа.

Для проведения анализа углеводных компонентов в пробирку с конусом типа П4 вместимостью 10 см³ пипеткой вносят 0,5 см³ нейтрализованного гидролизата, добавляют пипеткой 4 см³ о-толуидинового реагента и перемешивают содержимое. Параллельно в другой пробирке готовят раствор сравнения. Обе пробирки нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры, переливают растворы в кюветы с толщиной слоя 1 см³ и на спектрофотометре измеряют оптические плотности раствора при аналитических длинах волн 365, 385 и 630 нм, используя в качестве раствора сравнения смесь воды и OTP.

В такой же кювете измеряют оптическую плотность контрольного раствора -- нейтрализованного гидролизата, разбавленного в 9 раз для учета разбавления при анализе с OTP при длинах волн 365 и 385 нм, используя в качестве раствора сравнения дистиллированную воду.

Для расчета коэффициентов поглощения строят градуировочные графики для используемого спектрофотометра по растворам чистых Сахаров

Вывод уравнений и расчет коэффициентов. В применении к анализируемому раствору Сахаров уравнения Фирордта будут иметь вид

где D₃₆S и D₃₈₅ -- оптические плотности анализируемого раствора

при длинах волн 365 и 385 нм за вычетом поглощения гекеоз; с, и 'Ci--концентрации соответственно пентоз и галактуроновой кислоты, мкг/см³;-- коэффициенты поглощения продуктов реакции с OTP пентоз и галактуроновой кислоты при длинах волн 365 и 385 нм; d -- толщина кюветы, см, d= 1 см.

Решая систему двух уравнений, получают уравнения для расчета концентрации, мкг/см³, пентоз

C = ZiD₃₈₅ -SD₃₆₅

и галактуроновой кислоты

2=CD₃₆₅ -- ED_is5,

где соответствующие коэффициенты будут равны

Расчет массовой доли пектиновых веществ. После расчета концентрацией, мкг/см³, галактуроновой кислоты C_i, пентоз C_l и гекеоз рассчитывают массы полисахаридов и полиуронидов с учетом общего объема раствора пектиновых веществ, разбавлений з при гидролизе и нейтрализации и коэффициентов пересчета моносахаридов в полисахариды:

Галактуронан = с_гму · 400 · 0,907 · IO^-Y Пентозаны = с_п<._нтоз · 400 · 0,88 · 10"⁶ г, Гексозаны = с_гексоэ · 400 · 0,90 · IO^-V

Затем рассчитывают общую массу пектиновых веществ как сумму масс всех полисахаридов и полиуронидов т_пв = галактуронан + пентозаны -4- гексозаны.

Массовую долю пектиновых веществ X_nii,% к исходной абсолютно сухой древесине, рассчитывают по формуле

где т_па -- масса пектиновых веществ, г; g -- масса абсолютно сухой навески обессмоленной древесины, г; K₃ -- коэффициент экстрагирования органическим растворителем.

Построение градуировочных графиков. Готовят по пять растворов чистых Сахаров концентрацией 40, 80, 120, 160 и 200 мкг/см³. Каждый раствор обрабатывают OTP в условиях определения пектиновых веществ и измеряют оптические плотности при 365 и 385 нм, а для растворов глюкозы -- дополнительно при 630 нм и строят соответствующие графики, откладывая по оси абсцисс концентрации растворов, мкг/см³, а по оси ординат -- значения оптической плотности D.