Кинетика гидролиза панкреатической липазой жиров молока, подвергнутых радиационной обработке

Размещено на http://www.allbest.ru/

[Введите текст]

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»

Химико - технологический институт

Кафедра иммунохимии

Зав.каф. академик РАН и РАМН, проф., д.м.н.

В.А. Черешнев ____________

Дисциплина: Теоретическая и практическая энзимология

Контрольная работа

на тему: «Кинетика гидролиза панкреатической липазой жиров молока, подвергнутых радиационной обработке»

Екатеринбург, 2013



Введение

Радиационная обработка в пищевой промышленности используется для уничтожения ряда патогенных бактерий (таких как Salmonella, Campylobacter и E.coli), а также оно применяется с целью стерилизации продуктов, пастеризации и удлинения сроков хранения.

Радиационная обработка пищевых продуктов осуществляется в более 60 странах мира. По сведениям Международной радиационной ассоциации, только Европа ежегодно выпускает на рынок более 200 тысяч тонн обработанных продуктов.

Радиационная технология обработки пищевых продуктов обладает существенными преимуществами по сравнению с другими способами обработки:

снижение потерь из-за биологической, химической и бактериальной порчи,

продление срока годности продукции,

снижение капитальных и эксплуатационных затрат,

возможность обработки любых пищевых продуктов,

сохранность вкусовых и питательных свойств пищевых продуктов.

Несмотря на явные преимущества радиационной технологии обработки пищевых продуктов, при ее внедрении в пищевую промышленность возникает ряд проблем, среди которых наиболее важными являются: выбор источников ионизирующего излучения и подбор соответствующих условий процесса обработки; идентификация и характеристики продуктов радиационно-химических превращений белков, липидов, углеводов; радиологическая, микробиологическая, токсикологическая безопасность и пищевая адекватность.



1. Кинетика гидролиза панкреатической липазой жиров молока, подвергнутых радиационной обработке

При радиационной обработке пищевых продуктов на первый план должно выходить выяснение особенностей радиационно-химических превращений компонентов продуктов питания, что позволит более обоснованно подходить к определению доз и режимов облучения. Недостаточный учет этих факторов вызывает помимо основного антисептического действия изменения органолептических показателей, некоторых потребительских качеств и, возможно, появление токсических веществ в результате радиационно-химико-биологических превращений белков, углеводов, липидов, витаминов и др.

Что происходит при радиоактивном облучении? Пучок гамма-излучения направленный на продукт питания, в зависимости от дозы, оказывает эффект аналогичный пастеризации, варке или другой термической обработке. Энергия, выделяемая излучением, поглощается продуктом в определенном количестве, так называемой поглощенной дозе. Измеряется поглощенная доза в Греях(Гр) или килогреях (кГр), 1 кГр = 1000 Гр. Под действием радиации в любой биологической субстанции, в том числе и в организме человека, образуются короткоживущие поляризованные молекулы- свободные радикалы, которые способны связываться между собой, с другими обычными биологическими молекулами, с ДНК. Свободные радикалы, вновь образованные молекулы и соединения с ДНК способны изменить свойства биологических субстанций, в частности уничтожить болезнетворные бактерии. Надежный стерилизующий эффект дают высокие дозы ионизирующего облучения, но они вызывают изменения в липидах, причем образуются «радиотоксины» (эпоксиды, перекиси, лактоны, хиноны).

Эффект облучения проявляется при применении на продуктах питания в цельном, измельченном или измененном другими способами обработки виде. Как и при любом другом виде приготовления пищи при облучении возможна потеря некоторых пищевых полезных свойств продукта - витаминов, соединений, ценных белков.

Долгосрочные исследования Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), комитета ООН по продовольствию и сельскому хозяйству, Научного комитета по продовольствию ЕС, комитетов США и Великобритании по продуктам питания и лекарственным препаратам не выявили неблагоприятного воздействия на организм человека облучения продуктов для уничтожения бактерий и продления срока годности. В некоторых странах производитель продуктов прежде чем использовать радиацию в производстве обязан доказать её преимущество и необходимость использования перед другими видами обработки и что риски от радиации превосходят опасность заболевания потребителя от, например, пищевой инфекции.

Список продуктов питания, которые могут быть подвергнуты радиационной обработке, на деле может оказаться достаточно большим.

Известно, что с пищей в организм ежедневно поступает от 80 до 150 г липидов. Основную массу составляют жиры, наряду с глюкозой служащие главными источниками энергии. Хотя калорийность жиров значительно выше, чем углеводов (9 по сравнению с 4,7 ккал/моль), при рациональном питании жиры обеспечивают не более 30% от общего количества калорий, поступающих с пищей. Жидкие жиры (масла) содержат в своём составе полиеновые жирные кислоты, которые не синтезируются в организме; поэтому жидкие жиры должны составлять не менее одной трети жиров пищи.

Жирам принадлежит многообразная физиологическая роль в организме человека. Они входят в состав клеточных структур и принимают участие в обеспечении нормальной жизнедеятельности клеток. Частично жиры откладываются в виде резерва в жировые депо: подкожную основу, сальник, рыхлую соединительную ткань, окружающую внутренние органы (почки и др.). Подкожный жировой слой предохраняет тело человека от механических воздействий и переохлаждения, а жир, находящийся вокруг внутренних органов, способствует их устойчивому положению и защищает от ушибов и сотрясений.

Источниками для образования жира в организме человека являются жиры пищевых продуктов животного и растительного происхождения.

Коровье молоко, является ярким примером продукта, содержащего жиры животного происхождения. Коровье молоко производится в больших количествах и является наиболее продаваемым видом молока животных.

Молоко содержит жиры, в состав которых входят в основном жирные кислоты с короткой и средней длиной алифатических цепей (4-12 атомов углерода). Гидролиз жиров играет важную роль в процессе липидного обмена в организме человека. Именно биодоступность жиров позволяет гидролизовать их до глицерина и высших жирных кислот, которые в свою очередь чрезвычайно важны для нормальной жизнедеятельности организма.

Дефицит незаменимых жирных кислот в пище приводит к замедлению роста и развития организма, снижению репродуктивной функции и различным поражениям кожи.

Гидролиз жиров, протекающий в организме человека является ферментативным.

Жиры в составе молока находятся уже в эмульгированном, смешанном с водой виде, поэтому они сразу же доступны для гидролиза ферментами.

Переваривание жиров - гидролиз жиров панкреатической липазой.

Панкреатическая липаза - пищеварительный фермент, относящийся к классу липаз. Эта липаза является важнейшим ферментом в процессе переваривания жиров. Панкреатическая липаза синтезируется в поджелудочной железе и выделяется в просвет двенадцатиперстной кишки и в тонкий кишечник, где расщепляет жиры пищи - триацилглицериды -- на глицерин и высшие жирные кислоты.

Панкреатическая липаза гидролизует жиры преимущественно в положениях 1 и 3, поэтому основными продуктами гидролиза являются свободные жирные кислоты и 2-моноацилглицериды (в-моноацилглицеролы).

В результате радиационно-химических превращений жиров молока, последние могут оказаться менее доступными гидролизу липолитическими ферментами. А это, в свою очередь, снизит биодоступность жиров такого молока для человека. Работ, оценивающих доступность таких жиров, в литературе мы не встретили.

Цель данной курсовой работы оценить кинетику гидролиза панкреатической липазой жиров молока, подвергнутого радиационной обработке.

Материалы и методы исследования

В качестве источника жира в данной курсовой работе используется коровье молоко (2,5 % жирности), содержащее природные жиры в виде смеси триацилглицеридов (ТАГ).

Действие фермента - панкреатической липазы - оценивают по скорости образования кислых продуктов расщепления (свободных высших жирных кислот). Для этого от общего объема смеси жира с липазой через определенные промежутки времени отбирают для титрования равные части. Титрование кислых продуктов гидролиза осуществляют раствором гидроксида натрия (индикатор фенолфталеин):

R-COOH + NaOH > R-COONa + H2O.



Рассмотрим подробнее сам эксперимент.

В качестве источника панкреатической липазы используются капсулы Креон 10 000, содержащего липазу с активностью 10 000 ЕД ЕФ.

В 6 стаканчиков наливают по 10 мл разбавленного водой (1:1) молока. Из каждой пробы отбирают в колбу для титрования по 2 мл образовавшейся смеси и титруют 0,01н раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до появления розового окрашивания (определяя тем самым начальную кислотность молока). Затем в каждую пробу добавляют по 1 мл раствора липазы. Быстро перемешивают струей из пипетки и отмечают время начала реакции. Повторные титрования проводят через каждые 5 минут.

Результаты исследований и их обсуждение

В таблице 1 представлены данные о количестве щелочи, пошедшей на титрование молока.

Таблица 1 - Объем NaOH (0,01н), пошедший на титрование молока разной степени облучения

	Объем NaOH, мл
Время, мин	Контроль	1,5 кГр	3 кГр	4,5 кГр	6 кГр	9 кГр
0	1,1	1,2	1,5	1,6	2,0	2,1
5	1,6	1,7	2,0	1,9	2,4	2,2
10	1,9	1,9	2,3	2,3	2,7	2,3
15	2,0	2,1	2,3	2,3	2,8	2,4
20	2,3	2,2	3,1	2,9	3,0	2,6

Значение титрования без липазы (время реакции «0») вычитают из величины последующих титрований. В этом случае полученные графики пройдут через начало координат, так как вычитается исходное количество органических кислот, присутствующих в молоке (исходная кислотность молока).



Таблица 2 - Объем NaOH(0,01н) за вычетом объема щелочи, пошедшей на определение исходной кислотности молока

	Объем NaOH, V-V0,мл
Время, мин	Контроль	1,5 кГр	3 кГр	4,5 кГр	6 кГр	9 кГр
5	0,5	0,5	0,5	0,3	0,4	0,1
10	0,8	0,7	0,8	0,7	0,7	0,2
15	0,9	0,9	0,8	0,7	0,8	0,3
20	1,2	1,0	1,6	1,3	1,0	0,5

Полученные данные оформляют в виде графика, показывающего динамику отщепления свободных высших жирных кислот во времени под действием панкреатической липазы.

Рис. 1 - Кинетика гидролиза жиров молока под действием панкреатической липазы

Анализируя данный график, можно сказать следующее: облучение молока в дозах от 1,5 до 6 кГр не сопровождается снижением гидролиза жиров молока панкреатической липазой; напротив, облучение молока в дозе 9 кГр вызывает снижение скорости гидролиза.

В основе данного метода лежит реакция гидролиза жиров (триацилглицеридов). Панкреатическая липаза гидролизует жиры преимущественно в положениях 1 и 3, поэтому основными продуктами гидролиза являются свободные жирные кислоты и 2-моноацилглицериды (в-моноацилглицеролы).

Рассчитаем активность липазы (Алип) для каждой дозы облучения.

Для эксперимента, как указывалось выше использовали капсулы лекарственного препарата Креон 10 000, содержащего липазу с активностью 10 000 ЕД ЕФ.

За единицу активности панкреатической липазы принимают 2 мкмоля ВЖК, высвобожденных из молока за 1 минуту.

Тогда:

mВЖК=СNaOH • VNaOH • MВЖК•10-3 г

н ВЖК=

н ВЖК= СNaOH • VNaOH •10-3

Проведем расчет при t=20 мин.

Для дозы облучения в 1,5 кГр:

н ВЖК= СNaOH • VNaOH •10-3=0,01•1,0•10-3=10 мкмоль

Алип1,5= 2?н ВЖК/t=2•10/20=1 мкмоль/мин

Для дозы облучения в 3,0 кГр:

н ВЖК= СNaOH • VNaOH •10-3=0,01•1,6•10-3=16 мкмоль

Алип3,0= 2?н ВЖК/t=2•16/20=1,6 мкмоль/мин

Для дозы облучения в 4,5 кГр:

н ВЖК= СNaOH • VNaOH •10-3=0,01•1,5•10-3=15 мкмоль

Алип4,5= 2?н ВЖК/t=2•15/20=1,5 мкмоль/мин

Для дозы облучения в 6,0 кГр:

н ВЖК= СNaOH • VNaOH •10-3=0,01•1,0•10-3=10 мкмоль

Алип6,0= 2?н ВЖК/t=2•10/20=1 мкмоль/мин

Для дозы облучения в 9,0 кГр:

н ВЖК= СNaOH • VNaOH •10-3=0,01•0,5•10-3=5 мкмоль

Алип9,0= 2?н ВЖК/t=2•5/20=0,5 мкмоль/мин.

Таблица 3 - Активность панкреатической липазы при t=20 мин

Доза облучения	Активность липазы, мкмоль/мин
1,5 кГр	1,0
3 кГр	1,6
4,5 кГр	1,5
6 кГр	1,0
9 кГр	0,5

Анализируя полученные результаты, мы можем сделать вывод, что увеличение дозы облучения от 3,0 до 9,0 кГр ухудшает гидролиз жиров - снижается активность панкреатической липазы.

По окончании эксперимента и анализу полученных результатов необходимо отметить, что радиационная обработка оказывает влияние на гидролиз жиров панкреатической липазой. Подобный механизм еще досконально не изучен, но можно предположить, что продукты радиационных превращений ингибируют действие липазы.

Также полученные результаты можно объяснить и с точки зрения некоторых других факторов:

Липаза плохо гидролизует жиры при снижающемся значении рН (рНоптим?8);

В подтверждение этому может быть использованы данные о замере титруемой кислотности в молоке с разной дозой облучения.

Опыт был проведен в 2 параллелях.

Таблица 4 - Титруемая кислотность, ? Т

Доза облучения	VNaOH, пошедший на титрование, мл	Титруемая кислотность с коррекцией, ? Т
Контроль	1,7	14,0
	1,7	14,0
1,5 кГр	2,6	21,5
	2,7	22,3
3 кГр	3,1	25,6
	3,0	24,8
4,5 кГр	2,6	21,5
	2,7	22,3
6 кГр	4,1	33,8
	4,4	36,3
9 кГр	3,5	28,9
	3,4	28,1

жир гидролиз кислотность молоко

Как можно заметить, титруемая кислотность, выражаемая в градусах Тёрнера, увеличивается, что подтверждает наше предположение о закислении среды.

Изменяются сами жиры. В результате пероксидного окисления триацилглицериды изменили свои свойства и стали менее доступны действию липазы (стерически).



МДА сшивает аминогруппы белков, тем самым ухудшая стерическую доступность.

В подтверждение этому может быть использованы данные о замере содержания малонового диальдегида в молоке с разной дозой облучения.

Опыт был проведен в 2 параллелях.

Таблица 5 - Содержание малонового диальдегида в молоке разной степени облучения

Доза облучения	Е532	Е580	МДА, мкмоль/л
Контроль	0,051	0,048	0,20
	0,03	0,022	0,54
1,5 кГр	0,038	0,03	0,54
3 кГр	0,031	0,022	0,61
	0,024	0,021	0,20
4,5 кГр	0,029	0,019	0,67
	0,031	0,023	0,54
6 кГр	0,029	0,02	0,61
	0,026	0,021	0,34
9 кГр	0,03	0,02	0,67
	0,031	0,023	0,54

Анализируя данные по МДА, мы можем увидеть возрастание концентрации МДА в зависимости от дозы облучения.

Подводя итог, можно отметить, что цель курсовой работы, а именно изучение кинетики гидролиза жиров молока панкреатической липазой, была достигнута.



Выводы

1) Облучение в дозе 9 кГр снижает доступность гидролиза жиров молока панкреатической липазой;

2) Облучение сопровождается дозозависимым увеличением концентрации малонового диальдегида и титруемой кислотности;

3) С целью разработки метода радиационного воздействия на молоко, не снижая его питательной ценности, рекомендуется исследование доз до 6 кГр.



Список литературы

1. Горбатова К.К. Химия и физика молока: Учебник для вузов - СПб.: ГИОРД, 2004 - 288с.

2. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). / Под ред. Мазурика В.К., Ломанова М.Ф. М.: Физматлит, 2004. 448с.

3. Шарпатый В.А. Радиационная химия биополимеров. М.: ГЕОС, 2008. 208 с.

4. Химический состав пищевых продуктов. Кн.2: Справочные таблицы содержания аминокислот, жирных кислот, макро- и микроэлементов, органических кислот и углеводов / Под ред. проф., д-ра техн. наук И.М. Скурихина и проф., д-ра мед. наук М.Н. Волгарева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1987. - 360с.

5. Биохимия: Учебник для вузов, под ред. Е.С. Северина, 2003, 779с.

6. http://raen.info/files/3698/44-49.pdf - статья в Вестнике Российской академии естественных наук, Т.В. Чиж «Радиационная обработка, как технологический прием в целях повышения уровня продовольственной безопасности».

7. http://biofiz.tu/processy-pischevareniya/pereverivanie-pischevih-lipidov/109-pankreaticheskaya-lipaza - Биология и физиология живых организмов.

8. http://docs.cntd.ru - Электронный фонд правовой и нормативной документации

Размещено на Allbest.ru