Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения

Исследование степеней включения изотопа углерода ^I3C в аминокислотные остатки белка М.

flagellation за счёт биоконверсии ¹³СH₃ОН.

В экспериментах по включению изотопа углерода ^|3С в молекулы белков за счёт биоконверсии ¹³СH₃ОН метилотрофными бактериями М.flagellalum была показана эффективность мечения аминокислот изотопом углерода ¹³С. Так, в Phe детектировалось 80,5 % метки, в Ala - 95 %, в Gly - 90% (см. табл. 6).

Во всех экспериментах степени включения дейтерия и изотопа углерода ¹³С в метаболически связанных аминокислотах обнаружили определённую коррелляцию. Так, степени изотопного обогащения валина и лейцина (семейство пирувата), фснилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот} совпадают (табл. 6). Степени изотопного включения глицина и серина (семейство серина), аспарагиповой кислоте и лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины. Сравнивая данные таблицы 5 и 6, можно заключить, что степени изотопного обогащения экзогенных аминокислот и соответствующих аминокислотных остатков суммарного белка, в целом, также коррелируют.

Как и в случае с экзогенными аминокислотами, низкие степени включения изотопа углерода ¹³С в остатки Leu при росте на 1 об.% ¹³СНзОН обусловлены ауксотрофностью бактерий в этой аминокислоте.

Таким образом, нам удалось достичь максимальных уровней включения стабильных изотопов в суммарные белки биомассы метилотрофных бактерий. Именно поэтому мы посчитали возможным использовать гидролизаты их биомассы для биосинтеза других изотопно - меченных БАС.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГИДРОЛИЗАТОВ БИОМАССЫ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В. methylkum в КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ [1',3',4',2,8-D₅]-ИНОЗИНА.

Получение [1',3',4',2,8-D5]- инозина. В следующих экспериментах было апробировано использование дейтеро-компонентов биомассы метилотрофных бактерий, полученных в условиях многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для синтеза высокодейтерированных нуклеозидов (на примере инозина). [1,3',4',2,8-D5]-инозин был получен биосинтетически за счёт использования штамма-продуцента В. subtilis и выделен из культуральной жидкости по методике, включающей адсорбцию инозина на активированном угле, десорбцию спиртово-аммиачным раствором и перекристаллизацию из метанола. ТСХ инозина, с детекцией при 249 нм показала наличие в анализируемом образце единственного пятна с Rf = 0,55, -соответствующего по подвижности чистому инозину.

Особенности разработанного метода получения [1,3',4',2,8-D5]-инозина заключаются в следующих аспектах:

1. В способности высокоактивного штамма В. subtilis к росту и биосинтезу инозина на средах, содержащих максимальные концентрации тяжёлой воды;

2. Замене глюкозы и аминокислот, необходимых для роста этого штамма-ауксотрофа на гидролизаты дейтеро-биомассы В. methylicutn. При последующих ферментациях в качестве источника ростовых факторов можно использовать ту же дсйтеро-биомассу метилотрофных бактерий, либо биомассу самого штамма-продуцента, содержащую в своем составе соединения, которые могут служить источниками углерода и ростовых факторов;

3. В практически полном отсутствии отходов: согласно схеме, дейтеро-биомасса базового штамма, после гидролиза в 6 н. DC1 возвращается в цикл в качестве ростовых факторов;

4. В высокой степени изотопного обогащения дейтерий-мсченного инозина (62,5% атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий);

5. В высоких выходах (3,9 г/л) меченного продукта.

Исследование уровня дейтерированности инозина. Места локализации дейтерия в молекуле инозина, были исследованы с помощью масс-спектрометрии FAB и спектроскопии ПМР (см. схему).

При анализе степени дейтерированности инозина учитывались следующие аспекты. Во-первых, вследствие того, что протоны в C₁-C's положениях рибозной части молекулы инозина могли происходить из глюкозы, мы предположили,что характер биосинтетического включения дейтерия в рибозную часть молекулы инозина определяется, в основном, функционированием ряда процессов гексозо-моно-фосфатного (ГМФ) шунта, связанных непосредственно с ассимиляцией глюкозы и других сахаров. Во-вторых, многочисленные обменные процессы и внутримолекулярные перегруппировки, происходящие с участием тяжёлой воды могли также привести к специфическому включению метки по определенным позициям в молекуле инозина. Такими доступными позициями в молекуле инозина признаны, прежде всего, гидроксильные протоны -ОН и протоны при гетероатомах -NH (последние могут обмениваться на дейтерий в тяжёлой воде за счет кето-енольной таутомерии). Три атома дейтерия в рибозном остатке молекулы инозина могли происходить за счет функционирования многочисленных реакций ГМФ-шунта, два атома дейтерия а гипоксантинс также могли синтезироваться de novo (схема).

6. РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ БИОСИНТЕТИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙТЕРИЙ-МЕЧЕНHOI О БАКТЕРИОРОДОПСИНА

Получение дейтерии-меченного бактериородопсина.

В качестве другой модельной системы для введения стабильной изотопной метки в белки, использовали бактериородопсин (bR), синтезируемый в клеточной мембране H. halobium ET 1QOL (рис.6). Для включения дейтериевой метки в bR использовали два принципиально отличных подхода: сайт-специфическое введение отдельных аминокислот: L-[2,3,4,5,6-D₅]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D₅]-Trp в bR и униформное мечение бактериородопсина дейтерием путем выращивания П. halobium ET 1001 на среде, содержащей 99,9 ат.% тяжёлую воду и дейтеро-гидролизаты В. methylicum.

Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н. halobium ET 1001 солюбилизацией в 0,5 %-ном растворе додецилсульфата натрия (ДСН) с последующим осаждением белка метанолом. Гомогенность очищенного bR была потверждена электрофорезом в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1% ДСН.

ОФ ВЭЖХ метиловых эфиров Dns-, и Z-производных аминокислот, полученных после гидролиза bR в 4 н. Ва(ОН)2 или 6 н. DCI (3 масс.% фенола, в тяжёлой воде) показала высокие степени хроматографической чистоты выделенных аминокислот и отсутствие примесей небелковой природы в гидролизатах bR. Согласно данным по разделению дериватизованных гидролизатов bR методом ОФ ВЭЖХ, степени хроматографической чистоты выделенных дейтерий-меченных Dns-Phe-OMe, Dns-Tyr-OMe и Dns-Trp-OMe составили 96, 97 и 98% соответственно.

Исследование степени дейтерироваиности бактериородопсина. Оба подхода показали хорошие результаты по введению дейтериевой метки в молекулу bR. Например, в масс-спектре гидролизата электрофоретически чистого bR, полученного с селективной среды, содержащей L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-2,4,5,6,7-D5]-Trp, после прямой обработки реакционной смеси Dns-Cl и CN₂Н₂ фиксируются пики, соответствующие молекулярным ионам обогащённых дейтерием Dns-Phe-OMe с М+. при m/z 417 (вместо m/z 412 в контроле), Dns-Tyr-OMe с М+. при m/z 429 (вместо m/z 428) и Dns-Trp-OMe с М+. при m/z 456 {вместо m/z 451).

В случае с униформным мечением bR, метка включалась равномерно по всем положениям углеродного скелета в аминокислотных остатках белка.

ВЫВОДЫ:

1. Подобраны условия для проведения адаптации штаммов R. melhylicum, H.halobium, В. xubiilis и II. amyloliquefaciens к росту на D₂О-средах. Селекционно отобраны штаммы, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические характеристики на средах с максимальными концентрациями тяжёлой воды.

2. Показана принципиальная возможность использования суммы химических компонентов дейтеро-биомассы факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum в качестве источников ростовых субстратов для синтеза дейтерий-меченных БАС.

3. Изучено влияние меченных субстратов - D₂O, CD₃OD и ^|3СН₃ОН на ростовые и биосинтетические параметры различных штаммов -продуцентов БАС. Показано, что униформные уровни включения дейтерия в молекулы синтезируемых БАС можно получить, используя высокодейтерированные среды
(D₂О и СНзОН), а в случае с ¹³С-мечением того же результата можно достигнуть за счёт использования ^|3СНзОН.

4. Предложена дамсильная модификация препаратов культуральной жидкости для изучения степеней изотопного обогащения аминокислот методом масс-спектрометрии электронного удара. Метод позволяет проводить анализ изотопного состава мультикомпонентных смесей аминокислот, как свободных
аминокислот из культуральной жидкости, так и аминокислот в составе гидролизатов суммарных белков биомассы.

Проведено сравнительное изучение степеней включения дейтерия и изотопа углерода ¹³С в молекулы экзогенных аминокислот, так и в аминокислотные остатки суммарных белков штаммов метилотрофных бактерий в условиях их роста на средах, содержащих ступенчато увеличивающие концентрации тяжёлой воды.

Определена чёткая корреляция между уровнем включения изотопной метки в молекулы аминокислот и концентрации тяжёлой воды в ростовых средах.

Разработана схема получения дейтерий-меченных БАС с высокими степенями изотопного обогащения, основанная на использовании гетеротрофных микроорганизмов - продуцентов соответствующих БАС. Данная схема проверена на примере получения дейтерий-меченных инозина и бактериородопсина.

Исследованы методы сайт-специфического и униформного введения дейтериевой метки в бактериородопсин. Показано, что включение отдельных дейтерий-меченных аминокислот в молекулу бактериородопсина носит селективный характер, а использование адаптированного к D2O Н. halobium ET 1001 на средах с меченными субстратами и 99,9% D2O позволяет получать униформно меченный бактериородопсин.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ.

Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. Биосинтетическое получение дсйтерий-мсченного L-фенилалаиина, секрстируемого метилотрофным мутантом Brevibaclerium methylicum II Биотехнология. 1993. №9. С. 16-20,

Егорова Т. А., Мосин О. В., Еремин С. В-, Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. Препаративное разделение аминокислот белковых гидролизатов в виде бензилоксикарбонильных производных // Биотехнология. 1993. № 8. С. 21-25.

Беккер Г. Д., Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н. Аминокислоты, меченные стабильными изотопами: получение и масс-спектро метрически и контроль. (Тезисы докл. 4-й Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии")- Екатеринбург. 20-22 апрель 1994. С. 127-128.

Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н., Складнев Д. А., Акимова О. Л., Цыганков Д, Ю. Штамм Brevibacterium methylicum - продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ № 93055824 от 15.12.1993.

5. Казаринова Л. А., Королькова Н. В., Миронов А. С., Мосин О. В.. Складнев Д. А., Юркевич А. М. Способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов. Заявка РФ № 95118778 от 14.11.1995.

6. Karnaukhova Е. N. Mosin О. V.. and Reshetova О. S. Biosynthetic production of stable isotope labeled ammo acids using methylotroph Methylobacillus JlageUattan // Ammo Acids. 1993. V. 5. № 1. P. 125.

7. Mogin O. V.. Karnaukhova E. N., Pshenichnikova А. В., Reshetova O. S. Electron impact spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin. 6th International Conference on Retinal Proteins. 19-24 June 1994. Leiden. The
Netherlands. P. 115.

8. Mosin O. V,. Karnaukhova E. N., Skladnev D. A. Application of methylotrophic bacteria for preparation of stable isotope labeled amino acids. 7^th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms. 26 June 1994. Quebec. Canada. P. 163.

9. Matveev A. V., Mosin_O. V.. Skladnev D. A., Yurkevich A. M., and Shvcts V. Melhylolrophic adaptation to highly deuterated substrates. 8th International Symposium on Microbial Growth on Ci-Compounds. 27 August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 49.

10. Mosin O. V.. Karnaukhova E. N., Skladnev D. A., and Shvets V. I. Preparation of D-and ^L'C-amino acids via bioconvertion of Ci-substrates, 8lh International Symposium on Microbial Growth on Сi-Compounds. 27 August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 80.

Shvets V. I., Yurkevich A. M., Mosin_O. V.. Skladnev D. A. Preparation of deuterated inosine suitable for biornedical application // Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V. 8. № 4. P. 231-232.

Мосин О. В.. Складнее Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих тяжелую воду. II Биотехнология. № 3. 1996. С. 32-37.

Мосин О. В.. Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Получение бантериородопсина, меченного по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана // Биотехнология. № 3. 1996. С. 14-20.

Мосин _О.В. Казаринова Л. А., Преображенская Е. С., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высокодейтерированной среде. // Биотехнология. № 4. 1996.