Размещено на http://www.allbest.ru/

Определение гормональных препаратов в продуктах питания

Оглавление

• 1. Гормональные препараты в продуктах питания
• 2. Инструкция по определению остаточных количеств гормонов в продуктах животноводства методом ГЖХ
• 3. Химические методы обнаружения и идентификации гормонов на тонкослойных и бумажных хроматограммах и электрофореграммах
• 4. Список основных белковых и пептидных гормонов
• 5. Тривиальные названия стероидов

Список литературы

гормональный препарат питание стероид

1. Гормональные препараты в продуктах питания

Гормоны - органические соединения, вырабатываемые определенными клетками и предназначенные для управления функциями организма, их регуляции и координации. У высших животных есть две регуляторных системы, с помощью которых организм приспосабливается к постоянным внутренним и внешним изменениям. Одна из них - нервная система, быстро передающая сигналы (в виде импульсов) через сеть нервов и нервных клеток; другая - эндокринная, осуществляющая химическую регуляцию с помощью гормонов, которые переносятся кровью и оказывают эффект на отдаленные от места их выделения ткани и органы. Химическая система связи взаимодействует с нервной системой; так, некоторые гормоны функционируют в качестве медиаторов (посредников) между нервной системой и органами, отвечающими на воздействие. Так гормоны регулируют активность всех клеток организма. Они влияют на остроту мышления и физическую подвижность, телосложение и рост, определяют рост волос, тональность голоса, половое влечение и поведение. Благодаря эндокринной системе человек может приспосабливаться к сильным температурным колебаниям, излишку или недостатку пищи, к физическим и эмоциональным стрессам. Повышение или снижение гормонального уровня, наряду с уменьшением или увеличением чувствительности гормональных рецепторов может привести к эндокринным заболеваниям.

Стероидные гормоны -- группа физиологически активных веществ (половые гормоны, кортикостероиды и др.), регулирующих процессы жизнедеятельности у животных и человека. У позвоночных стероидные гормоны синтезируются из холестерина в коре надпочечников, клетках Лейдига семенников, в фолликулах и желтом теле яичников, а также в плаценте. В связи с высокой липофильностью стероидные гормоны относительно легко диффундируют через плазматические мембраны в кровь, а затем проникают в клетки-мишени.

Гормональные нарушения связаны с хроническим дисбиозом, гормональными или гормоно-ингибирующиим добавками в продуктах питания, а также постоянным дефицитом ортомолекул.

Большинство зарубежных производителей используют корма генной модификации, а также вводят гормональные препараты в организм животного за несколько месяцев до убоя для стимулирования роста мышечной ткани.

Многие ветеринарные препараты несут серьёзную опасность для здоровья человека при их хроническом поступлении. Так, например, гормональные препараты, особенно опасные для здоровья детей и подростков, обладают генотоксичными, иммунотоксичными, эмбриотоксичными и канцерогенными свойствами (рак груди, рак предстательной железы), вызывают нарушения гормонального баланса, провоцируют аутоиммунные и аллергические заболевания, приводят к деградации репродуктивной функции человека, вызывают нарушения в развитии плода и ребенка.

Стимуляторы роста с/х животных гормонального действия, особенно синтетические нестероидные соединения типа диэтилстильбэстрола, не разрушаются в организме животных, и их остаточное количество длительно сохраняется в мясных продуктах. При использовании диэтилстильбэстрола для откорма животных в мясе увеличивается содержание влаги и жира. В большинстве стран мира диэтилстильбэстрол не применяется в животноводстве из-за его канцерогенных свойств.

Диэтилстильбэстрол (DES или стильбэстрол), мощный синтетический половой гормон, добавлением в комбикорм или путём прямых инъекций которого можно добиться существенного наращивания массы животного при уменьшении объёма потребляемых кормов, был запрещён к применению в США в 1979 году, когда были обнародованы данные исследований, связывающие это вещество с развитием рака и бесплодия у человека. Но даже спустя год после его официального запрета, в ходе детального расследования, проведённого Управлением по контролю за продуктами и медикаментами (FDA) совместно с Департаментом сельского хозяйства США было обнаружено, что более 200 000 голов крупного рогатого скота по всей стране нелегально подвергались инъекциям DES. Препарат этот по сей день легально применяется при разведении мясных пород скота в Мексике, откуда животные затем экспортируются в США.

Даже с запретом DES, мясная промышленность не испытывает недостатка в разрешённых к применению гормональных препаратах - стимуляторах роста. Так, по состоянию на сегодняшний день, широко применяются меленгестрол ацетат (MGA, обеспечивающий прибавку в весе на 6 процентов эффективнее нежели запрещённый DES), зеранол, прогестерон, тестостерон пропионат, фуразолидон, тринитро-4-гидроксифенил мышьяковой кислоты, арсанилат натрия и тилозин фосфат. Мышьяк, ещё один печально известный канцероген, добавляется в корма животных в составе разнообразных мышьяк-содержащих соединений, также используемых в качестве стимуляторов роста. Помимо этого мышьяк входит в состав дезинфекционных растворов, в которые "окунают" животных чтобы избавиться от клещей и прочих паразитов.

Многие препараты запрещены в Российской Федерации и в странах Европейского союза, т.к. их использование в животноводстве и птицеводстве приводит к накоплению в продуктах животного происхождения этих веществ. Среди них:

Стильбены, к группе которых относятся диэтилстильбестрол, диеноэстрол и гексоэстрол являются высокоэффективными синтетическими анаболическими стероидами, обладающими сильной эстрогенной активностью. Было доказано, что стильбены обладают выраженными канцерогенными свойствами.

Этинилэстрадиол является синтетическим гормоноподобным веществом, обладающим эстрогенной активностью.

Тестостерон является эндогенным мужским (андрогенным) половым гормоном, обладающим анаболическим действием. Тестостерон вырабатывается в половых железах самцов и необходим для нормального функционирования репродуктивной системы, формирования вторичных половых признаков. Постоянная выработка тестостерона начинается в период полового созревания и продолжается до периода угасания половой функции. Тестостерон стимулирует синтез белка в организме, а это, в свою очередь, приводит к увеличению массы тела, особенно мышечной. Систематическое использование тестостерона с целью стимуляции роста мышечной массы животного запрещено как в Российской Федерации, так и в странах Европейского. Показано, что экзогенный тестостерон может причинить риск здоровью человека, в том числе вызывать рак предстательной железы

Метилтестостерон является синтетическим анаболическим стероидом, обладающим, подобно тестостерону, андрогенной активностью. Метилтестостерон назначают самцам при половом недоразвитии, при сосудистых и нервных расстройствах. Применение препарата при соответствующих показаниях и в соответствующих дозах приводит к усилению половой функции, стимулированию роста недоразвитых половых органов, развитию вторичных половых признаков. Препарат рекомендуют также самцам при импотенции вследствие переутомления, а женским особям при метритах и вагинитах. Использование метилтестостерона в животноводстве и птицеводстве приводит к его накоплению в продуктах животного происхождения и запрещено в Российской Федерации и в странах Европейского союза.

19-нортестостерон является синтетическим анаболическим стероидом, обладающим андрогенной активностью. Некоторые эфиры 19-нортестостерона применяются в ветеринарной практике по показаниям в лечебных целях, однако систематическое использование 19-нортестостерона с целью стимуляции роста мышечной массы животного запрещено в Российской Федерации и в странах Европейского союза.

Кленбутерол принадлежит к группе веществ, называемых b-агонистами. Известно, что b-агонисты стимулируют рост мышечной массы и регулируют соотношение жировой и мышечной ткани при выращивании сельскохозяйственных животных и птицы. Доказано, что кленбутерол и другие b-агонисты при их потреблении с пищей могут спровоцировать тахикардию и резкий подъем кровяного давления. При хроническом поступлении кленбутерола и других b-агонистов в организм человека могут наблюдаться нарушения обмена веществ.

Зеранол - высокоэффективный синтетический анаболик, обладающий эстрогенными свойствами. Микотоксин зераленон, который называют иногда «растительным гормоном», обладает втрое меньшей эстрогенной активностью, чем синтетический зеранол. В силу своих анаболических свойств зеранол нелегально используется в животноводстве для стимуляции роста мышечной массы и повышения усвояемости кормов. Зеранол может причинить существенный риск здоровью человека. Поступая с продуктами животного происхождения в организм человека, зеранол может вызывать клинические признаки гиперэстрогенизма, бесплодие, нарушения в развитии детей и подростков. Использование зеранола в животноводстве запрещено.

Тренболон является высокоэффективным синтетическим анаболическим стероидом, обладающим также сильной андрогенной активностью. Тренболон вызывает трансформацию клеток, и может причинить риск здоровью человека. Использование тренболона в животноводстве и птицеводстве приводит к его накоплению в продуктах животного происхождения и запрещено как в Российской Федерации так и в странах Европейского союза.

Для определения остатков ветеринарных препаратов используются инструментальные физико-химические методы анализа, такие как жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы, однако, предусматривают использование дорогостоящего оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании. В последнее время для скрининга остатков ветеринарных препаратов применяется удобный и быстрый иммуноферментный метод анализа (ИФА, ELISA), являющийся официальным методом контроля продуктов животного происхождения, принятым в странах Евросоюза (Директива 93/257/ЕЕС). В феврале 2000 года Департамент ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской федерации утвердил методические указания по количественному определению семи основных синтетических гормональных препаратов в продовольственном сырье животного происхождения с помощью тест-систем серии RIDASCREEN®.

Продовольственное сырье и пищевые продукты животного происхождения, реализуемые в странах Евросоюза и в Российской Федерации должны быть полностью свободны от остатков гормональных препаратов, бета-агонистов и некоторых антибиотиков (например, левомицетина и нитрофуранов). Ветеринарные препараты, использующиеся в терапевтических целях должны применяться при условии обязательной выдержки животных перед забоем до полного вывода остатков ветеринарных препаратов из организма животного.

2. Инструкция по определению остаточных количеств гормонов в продуктах животноводства методом ГЖХ

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Введение

Пищевые продукты могут контаминировоться различными гормональными препаратами (ГП), использующимися в качестве лекарственных средств, а также для интенсификации воспроизводства и продуктивности животных и птицы.

Многие гормоны обладают выраженной анаболической активностью -способностью стимулировать ускоренный рост тканей и синтез белка в организме. Следствием применения гормональных препаратов (ГП), их аналогов и производных в сельском хозяйстве явилось обнаружение остаточных количеств этих веществ в мясе, мясных продуктах, молоке, молочных продуктах и яйцах. К ГП относятся некоторые полипептидные и белковые гормоны (инсулин, соматотропин и др.), производные аминокислот - тироидные гормоны, а также стероидные гормоны и их аналоги.

Систематическое употребление продуктов питания, загрязненных ГП является причиной различного рода аллергических реакций, дисбактериозов и других нарушений. Поэтому необходим постоянный контроль остаточных количеств ГП в продуктах питания.

Данному вопросу уделяется должное внимание во многих странах, он неоднократно рассматривался на конференциях, в правительственные программах многих стран, а тагске экспертами ФАО/ВОЗ. Однако и бывшем пост-Советском пространстве и в Республике Беларусь контроль ГП в продуктах питания практически не осуществляется. Это объясняется прежде всего отсутствием доступных методов исследования и соответствующего оборудования. В связи с этим была разработана инструкция по определению остаточных количеств нормируемых гормонов (диотилстильбтетрола. тестостерона, эстраднола-17в в продуктах животноводства из одной пробы методом газожнлкостной хроматографии для контроля остаточных количеств (ОК) ГП в продуктах питания.

Стероиды включают исключительно важные классыприродных физиологически активных соединений - половые гормоны и гормоны коры надпочечников, стерины, желчные кислоты, сапогенины, сердечные агликоны, многочисленные алкалоиды и т.д.

К половым гормонам относятся:

- натуральные эстрогены, женскле половые гормоны, содержащие 18 атомов углерода (С18 - стероиды) и их замешенные, например, эстралнол-17в и синтетические нестероидные эстрогены, например, диэтилстильбэстрол;

- натуральные андрогены - мужские половые гормоны, содержащие 19 атомов углерода (С19 - стероиды) и их производные, например, тестостерон;

- и натуральные прогестогены, содержащие 21 атом углерода (С21 - стероиды) и их производные, например прогестерон.

Все половые гормоны можно рассматривать в качестве аналогов холестерина, в их молекуле имеется «стероидная» группа: одно пятичленное и 3 шестичленных углеродных кольца.

Эстрадиол -17в (1,3,5-эстратриен-3,17в-диол) - главный женский половой гормон. Представляет собой химическое соединение с температурой плавления 178°С; не растворимое в воде. Растворяется в водном щелочном растворе, спиртах, ацетоне.

Дютилстильбэстрол (транс-4,4'-дигидроксн-б,в-диэтилстильбен) - ДЭС, синтетический гормональный препарат с температурой плавления 169-172°С, растворяется в разбавленных водных растворах щелочей, ацетоне, эфире, хлороформе, спиртах, растительном масле, не растворяется в воде.

Тестостерон (4-андростен-17в-ол-3-он) - главный мужской половой стерокдльга гормон, представляет собой химическое соединение с температурой плавления 155°С. Нерастворим в воде, растворим в спиртах, эфире, многих органических растворителях, растительных маслах.

1.2. Принцип амализа

Предлагаемый анализ рассчитан на определение свободных и конъюгированных диэтилстильбзетрола. тестостерона и эстраднола-17в в мясе, субпродуктах и молоке. Он основан на экстракции гормонов из пробы мяса, субпродуктов или молока полярными растворителями, разрушении конъюгатов гормонов соляной кислотой, отмывании соляной кислоты, очистке пробы перераспределением между двумя несмешивающимися жидкостями, затем на адсорбционной хроматографической колонке с силикагелем и картридже С18polarplus с последующим модифицированием ангидридом гептафтормасляной кислоты для газохроматографического определения с помощью детектора по захвату электронов и полуполярной капиллярной колонки с силиконовой жидкой фазой НР-50. Нижний предел измерения при использовании газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов составляет 0,3 нг для ДЭС; 0,5 нг для тестостерона и 0,6 нг для эстрадиола-17в в 2 мкл вводимой пробы. Относительная суммарная погрешность измерений при принятой доверительной вероятности Р=0.95 не превышает ±18-20%.

2. ОТБОР ПРОБ, ИХ ПРИЕМ II ХРАНЕНИЕ В ЛАБОРАТОРИИ. ВЫДЕЛЕНИЕПРОБ ДЛЯ АНАЛИЗА

Пробы для количественного определения отбирают из поверхностных слоев продовольствия из 5-10 мест хранения. В каждом месте хранения из поверхностных слоев берут 100-200 г продукта с помощью пробоотборника, ножа или ложки. Однородные продукты смешивают в общую пробу весом 1,0-1,5 кг. Пробы можно помещать в банки с крышками или полиэтиленовые пакеты, последние герметично обвязывают.

Проба, принятая в лаборатории, хранится по возможности при той же температуре, при которой находилось продовольствие при отборе проб. Общую пробу тщательно измельчают, перемешивают и из нее отбирают нужную навеску.

3.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНЭТПЛСТИЛЬБЭСТРОЛА, ТЕСТОСТЕРОНА II ЭСТГЛДИОЛА-17в В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОВОДСТВА МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТДЮЙ ХРОМАТОГРАФИИ

3.1. Приготовление реактивов для проведения анализа

Приготовление растворов

Основные стандартные растворы гормонов готовят с концентрацией 1000 мкг/мл, для чего взвешивают 0,0500 г каждого гормона, количественно переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки метанолом. Основные стандартные растворы гормонов хранят в холодильнике 2-3 месяца.

Затем из основных стандартных растворов гормонов готовят рабочие растворы с концентрацией 1 мкг/мл, для чего микрошприцом отбирают по 50 мкл из каждого основного стандартного раствора, переносят количественно в мерные колбы на 50 см3 и доводят до метки метанолом. Рабочие растворы гормонов хранят в холодильнике 3-4 недели.

Приготовление фосфатного буфепа

17,79 г Na2НРО4 растворяют в воде в мерной колбе на 100 см3; 13,61 г КН2РО4 растворяют в воде в мерной колбе на 100 см3. Далее 12 см3 раствора Na2НРО4 переносят в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки раствором КН2РО4.

3.2. Xод проведения анализа

Извлечение остатков гормонов из мясных продуктов

10 г тщательно измельченного мясного фарша помещают в скоростной смеситель и гомогенизируют в 25 мл дистиллированной воды в течение 2 мин. Гомогенат переносят в плоскодонную колбу, добавляют 50 мл диэтилового эфира и рабочие растворы внутренних стандартов с концентрацией 1 мкг/см3 (20 мкл 4.4'-дигидроксидифенила - ДДФ и 50 мкл 17б-метилтестостерона). Гормоны экстрагируют в аппарате для встряхивания в течение 30 минут. После отстаивания эфирный слой собирают во взвешенную круглодонную колбу через фильтр с безводным сульфатом натрия. Экстракцию диэтиловым эфиром повторяют еще раз. Растворитель отгоняют, и колбу взвешивают. Определяют массу остатков, выделяемых при экстракции.

Разрушение конъюгатов гормонов

К сухому остатку добавляют 5-10 мл диэтилового эфира и около 1 мл концентрированной соляной кислоты до рН 1-2. Растворитель отгоняют при подогревании на ротационном испарителе. Остаток из круглодонной колбы переносят в делительную воронку, в которую добавляют 100 мл дистиллированной воды и 15 г сульфата аммония. Гормоны экстрагируют хлороформом порциями по 25 мл 3 раза. Хлороформ через фильтр с безводным сульфатом натрия собирают во взвешенную круглодонную колбу, растворитель отгоняют на ротационном испарителе. Колбу с остатком взвешивают, определяют массу остатков.

Очистка экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися жидкостями

Готовят гексан, насыщенный ацетонитрилом и ацетонитрил, насыщенный гексаном. Для этого равные объемы гексана и ацетонитрила помещают в делительную воронку, встряхивают 2-3 минуты, дают отстояться и затем разделяют слои. Жирный остаток из круглодонной колбы переносят в делительную воронку, используя 15 мл гексана, насыщенного ацетонитрилом, добавляют 25 мл ацетонитрила, насыщенного гексаном. Встряхивают, отстаивают слои до прозрачности. Слой ацетонитрила отделяют в другую делительную воронку, добавляют еще раз 15 мл гексана, насыщенного ацетонитрилом, встряхивают. Слой ацетонитрила собирают во взвешенную круглодонную колбу, растворитель отгоняют, колбу взвешивают.

Очистка экстракта на хроматографической колонке с силикагелем

Размеры хроматографической колонки составляют: диаметр -1 см, длина - 20 см.

На дно колонки помешают вату, смоченную бензолом и безводный сульфат натрия. 5г силикагеля взвешивают в стаканчике, смешивают с 25 мл бензола и этой смесью

заполняют колонку. Колонку отстаивают 5 минут, сверху помешают немного безводного сульфата натрия. Для работы с экстрактом берут 25 мл бензола. Пробурастворяют в 1 мл бензола и, когда в колонке остается слой бензола над силикагелемоколо 5 мм, наносят пробу. Далее колбу ополаскивают еще дважды по 1 мл бензола и снова наносят на колонку. Остальное количество бензола, ополаскивая крутлодонную колбу с пробой, наносят на колонку порциями большего объема. Скорость вытекания растворителя составляет 1 капля в секунду. Гормоны элюируют сколонки 50 мл смеси бензол-ацетон 9:1. Элюат собирают в круглодонкую колбу и удаляют растворители на ротационном испарителе. Остатки взвешивают. Если масса остатка составляет более 50-100 мг, то делают очистку пробы с помощью твердофазной экстракции.

Параллельно с первой готовят вторую пробу из 10 г мясного фарша. Перед упариванием экстрактов после очистки на хроматографической колонке две пробы объединяют. Таким образом, масса навески будет составлять 20 г.

Очистка пробы методом твердофазной экстракции

Берут картриджи С18polarplus. Для активирования картриджа его два раза промывают 6 мл метанола, два раза 6 мл бидистиллированной воды. Пробу на картридж наносят с помощью смеси 0,5 мл метилового спирта с 4 мл воды. Далее картридж промывают 3 мл воды; 3 мл смеси метанол-вода 55:45; 1,5 мл гексана.Гормоны элюируют 3 мл метанола. Пробу переносят в коническую колбочку на 5 мл, растворитель отдувают азотом. Проба готова к проведению ацилирования и последующему газохроматографическому определению остаточных количеств гормонов.

Извлечение остатков гормонов из молока

50 г молока помешают в делительную воронку, вносят 20 мкл ДДФ и 50 мкл 17б-метилтестотерон (концентрация растворов 1 мкг/см3), добавляют по 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия и оксалата калия, встряхивают. Добавляют 200 мл ацетона и встряхивают на протяжении 2 мин. Затем приливают 200 мл хлороформа и снова встряхивают 2 мин. Верхнюю фазу отбрасывают. Нижнюю переносят в круглодонную колбу и упаривают растворитель досуха. К остатку добавляют 5-10 мл диэтилового эфира и около 1 мл концентрированной соляной кислоты до рН 1-2, и проводят разрушение конъюгатов гормонов. Дальнейшие процедуры по очистке экстрактов аналогичны тем, которые описаны для мясных продуктов. Параллельно готовят еще одну пробу с 50 г молока, пробы объединяют, как и в случае мясных продуктов, после очистки на хроматографической колонке с силикагелем. Таким образом, масса навески будет составлять 100 г.

Ацилирование пробы и стандартов

К сухой помещенной в виалы смеси стандартов (ДДФ, диэтилстильбэстрол, 17б-метилтестостерон, тестостерон, эстрадиол-17в) и к пробе добавляют по 50 мкл бензола, 30-40 мг свежепрогретого в сушильном шкафу при 105°С гидрокарбоната натрия и 50 мкл ангидрида гептафтормасляной кислоты. Виалы закрывают тефлоновыми пробками и помещают в термостат на 30 мин при 70°С. После этого виалы вынимают из термостата, охлаждают при комнатной температуре и меняют тефлоновые пробки на стеклянные. В виалы добавляют около 1 мл бензола.

Продукты реакции промывают 1 М фосфатным буфером с рН 6, полученным из смеси солей КН2РО4 и Nа2НРО4, в делительной воронке на 10-15 мл. Вначале в воронку добавляют 3-4 мл буфера, затем ацилированную пробу или смесь стандартов.

Виалы промывают еще 1-2 мл бензола, которые также добавляют в делительную воронку. После разделения слоев нижний отбрасывают, а верхний профильтровывают через слой осушителя --безводного сульфата натрия в конические с оттянутым кончиком виалы на 5мл, бензол упаривают в токе азота, затем добавляют 20 мкл бензола. После этого 2 мкл пробы или смеси стандартов вводят в газовый хроматограф.

3.3. Подготовка прибора, хроматографической колонки, градуировка детектора, выполнение измерений

Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовка проб к анализу.

Подготовка измерительной аппаратуры

Включают хроматограф согласно инструкции по эксплуатации. Проводят стабилизацию работы хроматографа при температуре 130°С до тех пор, пока дрейф нулевой линии не уменьшается до 5% от длины шкалы регистратора за 1 час при чувствительности, соответствующей минимально определяемой концентрации.

Требования безопасности

Анализ по данной методике должен выполняться согласно инструкции «Основные правила безопасной работы в химических лабораториях», - М., Химия, 1979 г и инструкции по эксплуатации газожидкостного хроматографа.

Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений могут быть допущены лица, имеющие высшее или среднее специальное образование или липа со средним образованием, знакомые с основами газовой хроматографии, имеющие опыт работы в аналитической лаборатории не менее года и изучившие требования безопасности и настоящую инструкцию.

Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории согласно ГОСТ 15150-69 должны быть соблюдены следующие условия:

-температура воздуха 20±5°С;

-атмосферное давление 84.0-106,7 кПа (630-800 мм рт.ст.);

-влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С;

-напряжение питающей сети 220±22 В;

-частота переменного тока -50±1 Гц.

Приготовление градуировочных растворов

Для получения градуировочных растворов производных гормонов с ангидридомгептафтормасляной кислоты соответствующие количества гормонов помещают ввиалу на 5 мл, упаривают азотом метиловый спирт. Затем добавляют бензол,бикарбонат, натрия, ангидрид гептафтормасляной кислоты, закрывают виалутефлоновой пробкой и помещают в термостат при 70°С на 30 минут. Затем виалуохлаждают, меняют пробку на стеклянную. К содержимому виалы добавляют около 1мл бензола. Продукты реакции промывают 1 М фосфатным буфером с рН 6,полученным из смеси солей КН2РО4 и Nа2РО4 в делительной воронке на 10-15 мл. Вначале в воронку добавляют 3-4 мл буфера, затем ацилированную смесь стандартов.

Виалу промывают ещё 1 мл бензола, который также добавляют в делительную воронку. После разделения слоёв нижний отбрасывают, а верхний профильтровывают через слой осушителя - безводного сульфата натрия в коническую с оттянутым кончиком виалу на 5 мл, бензол упаривают в токе азота, затем добавляют 20 мкл бензола. После этого 2 мкл смеси стандартов вводят в газовый хроматограф.

Готовят пять градуировочных растворов стандартов. Для получения раствора № 1 в виалу вносят аликвоты рабочих растворов стандартов с концентрацией 1 мкг/см3 ; 4 мкл ДДФ, 2 мкл ДЭС, 12 мкл 17б-метилтестостерона, 15 мкл тестостерона и 5 мкл эстрадиола-17в. После упаривания метанола в виалу добавляют 30 мкл бензола, 10-20 мг бикарбоната натрия и 30 мкл ангидрида гептафтормасляной кислоты.

Для получения раствора № 2 в виалу вносят 8 мкл ДДФ, 4 мкл ДЭС. 24 мкл 17б-метилтестостерона, 30 мкл тестостерона и 10 мкл эстрадиола-17в. После упаривания метанола в виалу добавляют 50 мкл бензола, 10-20 мг бикарбоната натрия и 50 мкл ангидрида гептафтормасляной кислоты.

Для получения раствора №3 в виалу вносят 16 мкл ДДФ, 8 мкл ДЭС, 48 мкл 17б-метилтестостерона, 60 мкл тестостерона и 20 мкл эстрадиола-17в. После упаривания метанола в виалу добавляют 70 мкл бензола, 20-30 мг бикарбоната натрия и 70 мкл ангидрида гептафтормасляной кислоты.

Для получения раствора №4 в виалу вносят 32 мкл ДДФ, 16 мкл ДЭС, 96 мкл 17б-метилтестостерона, 120 мкл тестостерона и 40 мкл эстрадиола-17в. После упаривания метанола в виалу добавляют 80 мкл бензола, 20-30 мг бикарбоната натрия и 80 мкл ангидрида гептафтормасляной кислоты.

Для получения раствора № 5 в виалу вносят 48 мкл ДДФ, 24 мкл ДЭС, 144 мкл 17б-метилтестостерона, 130 мкл тестостерона и 60 мкл эстрадлола-17в. После упаривания метанола в виалу добавляют 100 мкл бензола, 30-40 мг бикарбоната натрия и 100 мкл ангидрида гептафтормасляной кислоты.

Каждый градуировочный раствор хроматографируют 6 раз.

Условия хроматографического анализа

Объем вводимой в хроматограф пробы2 мкл

Температура испарителя260°С

Температура детектора380°С

Давление газа-носителя118 кРа

Программирование температуры

термостата колонок со скоростью 5°/мннот 130 до 300 °С

Колонка хроматографическая капиллярная с силиконовой майкой фазой НР-50, длина 30м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина фазы 25 мм.

Времена удерживания гептафтормасляных производных стандартов (мин):

ДДФ13,62

Цис-ДЭС13,86

Транс-ДЭС15,53

17б-метилтестостерон21,90

Тестостерон23,61

Эстрадиол-17в24,63

Наклон градуировочного графика определяют градуировочным коэффициентом прибора, который вычисляют по формуле (1):

Кi, - градуировочный коэффициент прибора для 1-го компонента смеси производных гормонов с ангидридом гептафтормасляной кислоты;

Si-площадь пиков 1-го компонента смеси производных гормонов с ангидридом гептафтормасляной кислоты, полученная при хроматографировании, мм2 при подсчете площади сигнала на самописце или относительных единиц при использовании компьютерной системы обработки сигналов.

Сiст - количество 1-го стандарта в смеси гормонов в 2 мкл бензола, мкг.

Измеряют площади пиков, соответствующие индивидуальным производным гормонов. Для установления градуировочной характеристики 1-го компонента смеси производных гормонов вычисляют среднее значение результатов шести параллельных измерений смеси производных гормонов.

Выполнение измерений

Анализ пробы проводят следующим образом. Определяют площади пиков, используя компьютерную систему обработки сигналов или проводят расчет площади

пиков общепринятыми методами при регистрации сигнала на самописце. Каждую пробу хроматографируют не менее 6 раз.

Обработка результатов измерении

Массовую концентрацию гормонов в пробе рассчитывают по формуле:

Сi- концентрация индивидуального компонента в смеси гормонов, мг/кг продукта;

Si - площадь пика индивидуального компонента в смеси гормонов, мм2при подсчете плошали сигнала на самописце или относительных единиц при использовании компьютерной системы обработки сигналов.

М - масса пробы, взятой для анализа, г;

V - объем бензольного экстракта, мкл;

Кi - градуировочный коэффициент прибора для индивидуального компонента смеси гормонов;

n - количество экстракта, вводимое в прибор, мкл.

За результат анализа принимают среднее арифметическое из двух параллельных определений концентраций гормонов, найденных по двум параллельным определениям площадей соответствующих пиков.

Допустимое расхождение между двумя параллельными измерениями при доверительной вероятности р=0,95 не должно превышать 20%.

Контроль стабильности градуировочной характеристики заключается в определении параметров градуировочного графика не реже одного раза в месяц, сопоставлении их с первоначальными параметрами и установлении на этой основе возможности продолжения текущих измерений или необходимости корректировки градуировочной характеристики.

Средством контроля являются градуировочные растворы модифицированных гормонов. Результаты измерений не должны отличаться более чем на 10% от полученных по градуировке.

3. Химические методы обнаружения и идентификации гормонов на тонкослойных и бумажных хроматограммах и электрофореграммах

Для белковых гормонов

Реакции с амидовым черным.

1. Готовят 0,02%-ный раствор ами-дового черного 10 В в смеси метанола и уксусной кислоты (9:1). Фильтруют. После электрофореза полосу бумаги помещают на 10 мин в раствор красителя, после чего многократно промывают 10%-ным водным раствором уксусной кислоты или смесью метанола и уксусной кислоты (9:1).

2. 0,3 г амидового черного растворяют в 100 мл 7%-ной уксусной кислоты, содержащей 30 мл метанола. Фильтруют. После электрофореза полиакриламидный гель погружают в раствор красителя на 2-3 ч. Избыток красителя удаляют длительным промыванием в 7%-ной уксусной кислоте, иногда с применением щадящего электрофореза.

Реакция с кумаси ярким бриллиантовым синим. Применяется для окрашивания после электрофореза в полиакримиланом геле. Гель в течение 15-18 ч фиксируют в 20%-ном водном растворе сульфосалициловой кислоты, затем переносят на 2-4 ч (в зависимости от концентрации геля) в 0,25%-ный водный раствор кумаси яркого синего и три -- пять раз промывают 7%-ным раствором уксусной кислоты. Объемы фиксатора и промывной жидкости должны превышать объем геля не менее чем в десять раз.

Для пептидов, производных аминокислот и бпогеиных аминов

Реакции с нингидрином.

1.Хроматограмму смачивают свежим 1%-ным раствором нингидрина в ацетоне. После высушивания ее помещают в темноте на 40 ч в стеклянный сосуд, на дне которого находится стаканчик с концентрированной соляной кислотой.

2. Хроматограмму смачивают смесью 1%-ного раствора нингидрина в ацетоне (100 мл), 1%-ного раствора кадмия ацетата в воде (10 мл) и 5 мл уксусной кислоты. Через 2 ч высушивания на воздухе в темноте развивается максимальная окраска (красная).

3. Готовят растворы:

а) 0,1 г нингидрипа в 50 мл абсолютного этанола, 10мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл коллидина;

б) 0,5 г нитрата меди в 50 мл абсолютного этанола.

Перед употреблением растворы смешивают в соотношении 50:3. Хроматограмму опрыскивают, нагревают 4 мин при 110° С. Окраска нестойкая.

Для стероидов

Поглощение УФ света.

Хроматограмму облучают коротковолновым УФ светом. Источником излучения могут служить приборы типа «хроматоскопа» или ультрахемископа Брумберга с светофильтром УФС-1. Все б, в-ненасыщенные кетостероиды, диены инекоторые другие соединения проявляются как темные пятна на светлом фоне. Наиболее часто данный метод применяют для обнаружения Д4-3-кетостероидов. Продолжительность облучения должна быть минимальной во избежаниеразрушения стероидов.

Проявление парами йода.

Это универсальный метод обнаружения органических веществ. Хроматограмму помещают в закрытый сосуд, на дне которого находятся кристаллы йода, выдерживают на воздухе 5 мин для удаления избытка йода. Пятна стероидов приобретают коричневую окраску. Рекомендуют также опрыскивать хроматограмму 1%-ным водным раствором крахмала до появления синих пятен. Обработка крахмалом непригодна для изучения тонкослойных хроматограмм в тех случаях, когда крахмал применен в качестве связующего вещества.

Реакция с анисовым альдегидом -- кислотой.

Общая реакция для стероидов и других органических веществ. Хроматограмму опрыскивают смесью анисового альдегида, концентрированной серной и ледяной уксусной кислот (0,5:1:50). После нагревания в течение 10 мин при 100°С появляются окрашенные пятна. Метод рекомендуется для замены агрессивного обнаружения серной кислотой при тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol.

Реакция с азотной кислотой.

Рекомендуется для обработки пластин Silufol. Хроматограмму опрыскивают 65%-ной азотной кислотой, нагревают 10 мин при 100° С. Ненасыщенные стероиды дают коричневую окраску.

Реакция с фосфорномолибденовой кислотой.

Применяется для обнаружения оксистероидов. Хроматограмму опрыскивают свежеприготовленным 10%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле, нагревают 5 мин при 80° С.

Реакция с трихлоридом сурьмы -- уксусным ангидридом

Применяется для обнаружения оксистероидов. Альдостерон, кортизон и их ацетаты не окрашиваются. Хроматограмму опрыскивают смесью насыщенного раствора трихлорида сурьмы (яд!) в хлороформе (без примеси этанола) и уксусного ангидрида (8:2), выдерживают в сушильном шкафу 5 мин при 90-100° С. В видимом свете окраска пятен следующая:

прегненолон -- фиолетоваятестостерон -- сине-зеленая

прегненолон-ацетат -- фиоле-дигидротестостерон -- синяя

товаяандростерон -- зелено-коричне-

прогестерон -- синяявая

прогестерон-ацетат -- синяяДЭА -- фиолетовая

F-- красно-коричневаяДЭА-ацетат -- фиолетовая

F-ацетат -- желто-коричневаяандростендиол -- красно-фио-

S-- фиолетоваялетовая

S-ацетат -- фиолетоваяЕ3 -- коричнево-зеленая

В - коричневаяЕ2 -- оранжевая

ДОК -- серо-коричневаяЕ3 -- розовая

ДОК-ацетат -- серо-коричневая

Реакция с трихлоридом сурьмы (реакция Эртеля).

После опрыскивания хроматограммы насыщенным раствором трихлорида сурьмы в хлороформе (без примеси этанола) и нагревания в течение 5 мин при 90--100° С Д5-3в-оксистероиды дают пурпурно-фиолетовую окраску. Реактив проявляет и другие оксистероиды, окраска которых отличается.

Реакция с Н2SО4-этанолом (реакция Эртеля и Эйк-Нес).

Хроматограмму обрабатывают свежеприготовленной смесью концентрированной серной кислоты и абсолютного этанола (2:1). Через 1-2 мин развивается желто-коричневая окраска. Реакция специфична для Д5-3в-окси-стероидов и их ацетатов.

Флюоресцентная реакция с фосфорной кислотой.

После смачивания или опрыскивания хроматограммы 15%-ним водным растворном о-фосфорной кислоты и прогревания в течение 20 мин при 80--90° С кетостероиды в УФ свете дают флюоресценцию -- от голубой до оранжевой.

Щелочная флюоресценция.

Хроматограмму опрыскивают 10%-ным раствором едкого натра в 60%-ном водном метаноле, нагревают 10 мин при 80--100° С. В УФ свете Д4-3-кетостероиды дают желтую флюоресценцию.

Реакции с тетразоловым синим.

Стероиды, имеющие б-кетольную боковую цепь при С-17 (-СО-СН2ОН), восстанавливают тетразоловый синий в формазан, имеющий голубую окраску.

1. Хроматограмму опрыскивают свежеприготовленной смесью 1%-ного водного раствора тетразолового синего и 2 н. едкого натра в метаноле (1:9). Небольшое подогревание (40-60° С) ускоряет появление окраски.

2. Смесь для обработки хроматограммы состоит из 8 мл 1%-ного тетразолового синего в этаноле, 12 мл 4 н. едкого натра и 20 мл дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.

Реакция с азотнокислым серебром.

К 10 мл 0,1 н. раствора азотнокислого серебра последовательно прибавляют десять капель концентрированного аммиака и 5 мл 10%-ного раствора едкого натра (реактив Толленса). Полосу бумаги смачивают свежеприготовленным реактивом и сушат на воздухе 1 мин (не допускать появления окраски фона!). Хроматограмму на несколько секунд опускают в 5%-ный раствор гипосульфита и промывают 1-2 мин в дистиллированной воде. Стероиды, имеющие б-кетольную боковую цепь, окрашиваются в коричневый цвет.

Реакция с м-динитробензолом (реакция Циммермана).

Относительно специфична для 17-кетостероидов. Хроматограмму опрыскивают свежеприготовленной смесью 2%-ного раствора м-динитробензола в этаноле с 50%-ным водным едким кали (4:1). нагревают 3-5 мин при 50-60°С. Пятна стероидов окрашиваются в фиолетовый цвет

Спектроскопия сернокислых хромогенов.

К сухим остаткам элюатов стероидов (20--40 мкг) и контрольного («пустого») участка хроматограммы прибавляют по 2 мл концентрированной серной кислоты. Через 2 ч снимают спектр абсорбции стероида против контроля в диапазоне 220--600 нм.

Ацетилирование.

К сухому остатку элюата стероида (10--15 мкг) прибавляют две капли уксусного ангидрида и четыре капли пиридина, оставляют на ночь. Высушивают струей азота, добавляя несколько раз по 0,5 мл метанола.

Реакция с фенилгидразином (Портера -- Сильбера).

Специфична для стероидов с 17, 21-диокси-20-кетогруппировкой (17-ОКС). К сухому остатку элюата стероида или его раствору в 0,5 мл метанола прибавляют 4 мл свежеприготовленного фенилгидразинового реактива. Нагревают на водяной бане 20 мин при 60°С, охлаждают в водопроводной воде. В результате реакции образуются фенилгидразоны, имеющие максимум абсорбции при 410 нм. Фенилгидразиновый реактив состоит из 4,3 мг перекристаллизованного из спирта солянокислого фенилгидразина, растворенного в 10 мл смеси концентрированной серной кислоты (62 мл), дистиллированной воды (38 мл) и перегнанного этанола (50 мл).

4. Список основных белковых и пептидных гормонов

Гипоталамические факторы

Гонадолиберин

Кортиколиберин

Люлиберин

Меланолиберин

Меланостатин

Пролактолиберин

Пролактостатин

Соматолиберин

Соматостатин

Тиролиберин

Фоллиберин

Гипофизарные и подобные им гормоны

Вазопрессин

Вазотоцин

Гонадотропин

Глюмитоцин

Изотоцин

Кортикотропин

Липотропин

Лютропин

Мезотоцин

Меланотропин

Оцитоцин (окситоцин)

Пролактин

Соматотропин

Тиротропин

Урогонадотропин

Фоллитропин

Хориогонадотропин

Хориомаммотропин

Другие пептидные гормоны

Глюкагон

Инсулин

Кальцитонин

Паратирин

5. Тривиальные названия стероидов

Аллотетрагидросоединение, S

Альдостерон, электрокортин

Андростандион

Андростендиол

Андростендион

Андростерон

Дегидроэпиандростерон, ДЭА

Дезоксикортикостерон, ДОК

Кортикостерон, В

Кортизол, F

Кортизон

в-Кортол

Кортолон

в-Кортолон

Прегнандиол

Прегнандион

Прегнантриол

Прегненолон

Прогестерон

Тестостерон

Эпиандростерон

Эпитестерон, цис-тестостерон

17в-Эстрадио, Е2

Эстрмол, Е3

Эстрон, Е1

Этиохоланолон

Список литературы

1. Резников А. Г. Методы определения гормонов. Справочное пособие/ под ред. В. П. комиссаренко. - Киев: Навукова думка, 1980. - 400 с.: ил.

2. Интернет-ссылки:

http://komprod.com/ru/products/105/

http://www.krugosvet.ru/articles/35/1003530/print.htm

http://www.bestreferat.ru/referat-79676.html

http://www.antibiotic.ru/books/pd/19.shtml

Размещено на Allbest.ru