Современное состояние и перспективы применения рецепторных методов для определения лекарственных веществ и их метаболитов

Один из популярных современных приборов для проведения рецепторного анализа: Многофункциональный планшетный анализатор VICTOR серии X - продолжение известной серии надежных и простых в работе планшетных анализаторов. VICTOR 3 TM от компании PerkinElmer. Наряду с обновленным дизайном VICTOR X имеет ряд новых конструктивных решений для более удобного использования: прямая оптическая система с более высокой чувствительностью и рабочим диапазоном для всех используемых технологий, более удобный модуль загрузки, использование 1-1536-луночных планшет SBS-формата, а также чашек Петри, слайдов, фильтров, ПЦР и Терасаки планшет. Планшеты могут загружаться в анализатор вручную, или со стэкеров на 20 или 40 планшет. Анализаторы VICTOR X могут работать как самостоятельно, так и в составе многофункциональных роботизированных комплексов [3].

МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ

Флюоресценция (340-850 нм).

Измерение соотношения флюоресценции на двух длинах волн.

Измерение флюоресценции снизу и сверху планшеты.

Поляризационная флюоресценция (400-850 нм) Флюоресценция, отсроченная по времени (TRF).

Двухоконная TRF.

Измерение эмиссии на двух длинах волн.

Люминесценция.

Постоянная люминесценция (Glow).

Импульсная люминесценция (Flash).

Двойная (комбинированная) люминесценция.

Фотометрия в видимой области (340-1000 нм) УФ-фотометрия (260/280 нм).

ПРИМЕНЕНИЕ

Клеточная биология и цитология.

Иммуноферментный и рецепторный анализы.

Токсикология.

Мониторинг продуктов питания.

Кинетика.

Молекулярная биология.

Количественный анализ (белки, ssDNA, dsDNA, клетки, бактерии и др.).

Скрининг лекарственных препаратов и метаболитов.

Сенсоры

1. Общая характеристика.

Рабочей частью аналитической аппаратуры для рецепторного анализа являются биосенсоры. Химические (биологические) сенсоры - это тип аналитических устройств, которые служат для качественного и количественного определения химических (биологических) веществ. Обычно сенсор состоит из следующих частей:

Распознающий элемент (он также может быть назван рецепторным слоем) представляет собой вещество, которое способно селективно взаимодействовать с аналитом.

Трансдьюсер (англ. Transducer - преобразователь, датчик) преобразует химическое или биологическое взаимодействие в электрический сигнал.

Система сбора и обработки данных служит для усиления и анализа сигнала и отображения результатов.

Биологические сенсоры отличаются от химических только тем, что они направлены на детектирование органических молекул, важных для живых организмов: высокомолекулярных, таких как белки, ДНК, и низкомолекулярных, например, глюкозы и мочевины. В данном обзоре обсуждаются основные распознающие элементы биологических сенсоров; как и в химических сенсорах, основное предъявляемое к ним требование - способность улавливать определенный аналит и не реагировать на посторонние вещества, присутствующие в образце [5].

Необходимо отметить, что разработка сенсоров является междисциплинарной задачей, которая требует участия широкого круга специалистов: физиков, инженеров, химиков, биологов, врачей, экологов. Кроме очевидных требований, предъявляемых к новым сенсорам, таких как простота эксплуатации, дешевизна, высокая точность, селективность и скорость анализа, добавляются еще требования миниатюризации (это связано с развитием нанотехнологий), иногда возможность работать в непрерывном режиме, а иногда даже - возможность внедрения в человеческий организм.

Используемые в биосенсорах трансдьюсеры чрезвычайно разнообразны. Возможно, наиболее часто применяются электрохимические преобразователи, в которых трансдьюсером является электрод, помещенный в исследуемый раствор. Оптические биосенсоры используют явления полного внутреннего отражения и поверхностного плазмонного резонанса. Гравиметрические сенсоры используют изменение массы при связывании аналита, они обычно основаны на акустических волнах или пьезокварцевых микровесах. Для ознакомления с типами трансдьюсеров авторы рекомендуют обратиться к обзорам.

2. Характеристики биосенсоров.

В данном разделе описаны параметры и характеристики биосенсоров как аналитических приборов. Все они используются и для описания химических сенсоров, которые чрезвычайно близки к биологическим по принципам действия и технической реализации.

Как и любой научный прибор, каждый сенсор имеет допустимый диапазон температур, давлений и pH. Кроме того, каждый сенсор, который не только констатирует наличие аналита, но и измеряет его концентрацию, очевидно, характеризуется такими параметрами, как точность и воспроизводимость. Также важны такие параметры, как рабочий диапазон (тот диапазон концентраций, в котором работает метод измерений) и линейный диапазон. Для их определения требуется построить калибровочную кривую - зависимость величины сигнала от концентрации аналита, ее линейный участок называется линейным диапазоном. В некоторых типах сенсоров (например, в потенциометрических) величина сигнала пропорциональна логарифму концентрации [5].

Чувствительность сенсора показывает отношение сигнала, выраженного, например, в вольтах, к концентрации аналита, которая вызвала этот сигнал. Более строго чувствительность определяется как максимальное значение производной величины отклика по концентрации. Следует отличать чувствительность от предела обнаружения (detection limit) - той минимальной концентрации аналита (или минимального количества вещества), которая может быть детектирована и измерена. Для современных сенсоров это значение может быть чрезвычайно малым. Так, например, в работе обсуждаются иммунологические сенсоры с пределом обнаружения 10-21 моль. Описана резонансная система нанометровых размеров, способная зарегистрировать 1 аттограмм (10-18 г) вещества, основанная на пьезорезистивном эффекте.

Важнейшей характеристикой сенсора является селективность, она отражает способность детектировать определенный аналит и не реагировать на посторонние вещества. Для количественного определения селективности используются два основных метода. Первый предполагает построение калибровочных кривых не только для аналита, но и для посторонних примесей при одинаковых условиях эксперимента. В этом случае селективность выражается как отношение величины сигнала, вызываемого аналитом к величине сигнала, вызываемой примесью той же концентрации. При другом подходе в ячейку, уже содержащую аналит, вводят примеси в тех концентрациях, которых можно ожидать в реальных образцах, и выражают селективность как изменение сигнала в процентах. Второй метод дает более наглядное и практически удобное значение селективности, но он является более субъективным, т.к. зависит от диапазона концентраций, в котором производятся измерения [5].

К временным характеристикам сенсоров относятся следующие: время отклика, время жизни и время регенерации. Время отклика необходимо для возникновения равновесия между анализируемым образцом и рецепторным слоем. Хотя оно должно быть сведено к минимуму, в некоторых методах, оно составляет порядка нескольких часов. Время жизни - это срок воспроизводимой работы сенсора, он ограничен деградацией рецепторного слоя. Иногда (например, в коммерческих сенсорах для определения глюкозы) используются одноразовые распознающие элементы. Время регенерации это время, которое требуется для восстановления работоспособности распознающего элемента. В заключение скажем, что для непрерывного монитринга часто требуется изготавливать сенсоры с проточными ячейками или зондами, которые вносятся в поток анализируемого вещества. Такие сенсоры особенно важны для контроля на производстве и мониторинга окружающей среды, их проектирование представляет собой сложную инженерно-техническую работу.

3. Распознающие элементы.

Выше было сказано, что одной из основных характеристик биосенсоров является селективность. Обычно (хотя не всегда) селективность определяется свойствами распознающего элемента. Ниже рассматриваются основные типы рецепторных слоев и их особенности.

Наиболее часто распознающими элементами биосенсоров являются ферменты - высокоспецифичные катализаторы биохимических реакций. В состав фермента входит одна или несколько белковых молекул, иногда присутствует небелковая часть. Каталитическая активность ферментов значительно выше, чем у любых искусственных катализаторов, ферменты увеличивают скорость реакции в 103-107 раз. Классический пример биосенсора, использующего ферментативный рецепторный слой это амперометрический сенсор на глюкозу с глюкозоксидазой (GOD). Возможно, это один из самых первых биосенсоров. В нем глюкоза окисляется до глюконовой кислоты с образованием перекиси водорода:

Глюкоза+О2->глюконовая кислота+Н2О2.

В разных модификациях может регистрироваться либо уменьшение концентрации кислорода, либо увеличение концентрации перекиси. Фермент GOD является сравнительно недорогим, при правильной упаковке одноразовый распознающий элемент может храниться около 6 месяцев.

Иногда ферменты используются непосредственно в составе тканей организмов животных или растений. Например, в обсуждается сенсор на дофамин (нейрогормон, биологический предшественник адреналина), использующий ткани грибов, иммобилизованные на электроде при помощи углеродной пасты. Преимущества использования тканей вместо очищенных ферментов состоят в следующем: ткани существенно дешевле, содержащиеся в них ферменты находятся в естественном окружении, поэтому они дольше и надежнее работают. Таким образом, использование тканей в биосенсорах решает проблемы деактивации и деградации ферментов при их иммобилизации, увеличивает стабильность ферментов. При этом существенным недостатком, который ограничивает спектр возможных применений тканей, очевидно, является их низкая селективность, связанная с присутствием большого количества посторонних ферментов. Тем не менее, использование тканей в рецепторных слоях в некоторых случаях позволяет радикально снизить себестоимость биосенсоров [5].

К биосенсорам на основе тканей идеологически близки технологии с использованием клеток в качестве распознающих элементов. По мнению автора, клеточные биосенсоры наряду с ферментными занимают лидирующие позиции по степени разработки и внедрения. Необходимо отметить, что для многих клеток разработаны методы генной инженерии, позволяющие повысить выработку определенного белка и таким образом повысить эффективность работы сенсора.

В обзоре рассматриваются клеточные биосенсоры, созданные с использованием технологий генной инженерии. При проникновении внутрь клетки аналит вызывает синтез легко детектируемого белка, например, флуоресцентного белка GFP. В число достоинств таких биоиндикаторов входят следующие: способность проводить анализ с пространственным разрешением порядка размера клетки (например, для анализа химического состава почвы), возможность быстрого обнаружения токсичных веществ, возможность измерять концентрации веществ в естественной среде, а не в пробе.

Биосенсоры, использующие ферменты в рецепторном слое, иногда называют каталитическими. Существуют еще и аффинные биосенсоры (affinity biosensors), использующие антитела, нуклеиновые кислоты и рецепторы. Отличие между ними состоит в следующем. В ферментативных сенсорах происходит реакция по общей схеме

Субстрат (S) связывается с ферментом (E), образуя комплекс ES, затем субстрат превращается в продукт (P) и высвобождается. Эта реакция описывается кинетикой Михаеэлиса-Мэттен. В случае аффинных биосенсоров в рецепторном слое происходит реакция вида

В таких реакциях не образуется новых продуктов, происходит связывание молекул А и В в комплекс АВ. Реакции этого типа также называют реакциями непродуктивного связывания. В общем случае это приводит к ужесточению требований, предъявляемых к трансдьюсеру, т.к. акт связывания сложнее зарегистрировать. К аффинным биосенсорам относятся сенсоры на ДНК, на антигены и антитела и сенсоры с использованием рецепторов.

Детектирование молекул ДНК основано на взаимодействии между комплементарными цепями. Природа этого взаимодействия - водородные связи между парами нуклеотидов. В ДНК-сенсорах рецепторный слой состоит из иммобилизованных одноцепочечных ДНК, которые улавливают из раствора комплементарные цепи. Hекордно предел обнаружения ДНК был достигнут с использованием метода электрохимической хемилюминесценции и составил 10 аМ (10-18 М) [5].

Приготовление образцов ДНК для исследований является сложным и трудоемким процессом. После очистки пробы для увеличения количества молекул ДНК определенного типа используется процедура полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Развитие ДНК-биосенсоров позволит обходиться без специальных методов выделения ДНК из образца и ПЦР, и детектировать отдельные цепи в течение часа. В последние годы была создана технология ДНК-биочипов, которая позволяет вести анализ большого числа генов одновременно. Развитие ДНК-биосенсоров представляется крайне важным т.к., оно поможет в обнаружении патогенных микроорганизмов, мутаций, диагностике наследственных заболеваний, и во многих других областях. Необходимо отметить развитие методов анализа ДНК с целью идентификации личности.

Антитела - это сложные белковые молекулы, построенные из нескольких субъединиц, вырабатывающиеся в организмах позвоночных в ответ на проникновение чужеродных агентов (антигенов), например, токсинов, вирусов или чуждых организму макромолекул. Циркулирующие в крови антитела связываются с антигенами, деактивируют их и выводятся из организма. Кроме того, связанные антитела служат метками для микроорганизмов, подлежащих уничтожению. Взаимодействие антиген - антитело считается наиболее селективным для применения в биосенсорах. С точки зрения физики, это взаимодействие осуществляется теми же по природе силами, что и взаимодействие фермента с субстратом: вандерваальсовыми силами, ионными, гидрофобными и гидрофильными взаимодействиями, водородными связями. Сложность применения антител в биосенсорах состоит в том, что акт связывания антигена часто тяжело зарегистрировать. Это является общим недостатком аффинных биосенсоров и требует применения специальных методов, например, использования меток. Другая сложность состоит в том, что аффинные взаимодействия часто имеют высокие значения константы ассоциации, т.е. слабо обратимы, и использующие их распознающие элементы часто являются одноразовыми или требуют специальных методов регенерации. Например, для разрушения связи антиген-антитело иногда используются 10-100 мМ HCl или глициновый буфер pH 1.7-2.2 [5].

Рецепторы - это мембранные белки, способные связывать определенные лиганды и вызывать определенный физиологический отклик в ответ на акт связывания. Рецепторы обычно используются в биосенсорах в составе клеток, так как в очищенном виде они недостаточно стабильны. Биосенсоры на основе рецепторов не получили широкого распространения. В работе для изучения активности фермента одновременно использовались методы регистрации аффинного взаимодействия и каталитической реакции. Белок бета-лактамаза, который иногда ответственен за устойчивость бактерий к антибиотикам, был иммобилизован на поверхности, кинетика образования монослоя контролировалась методом поверхностного плазмонного резонанса. Далее в систему вводился субстрат - нитроцефин, который под действием бета-лактамаз гидролизовался с образованием окрашенного продукта. Он регистрировался спектроскопически по изменению спектра поглощения. В аффинных биосенсорах часто используется метод меток и конкурирующего связывания. Для анализа образца в сенсор специально вводится некоторое количество меченого аналита. Метки могут быть различной природы, например, флуоресцентные или радиоактивные. Связывание меченого аналита, содержащегося в растворе в малой концентрации, очень чувствительно к концентрации немеченого аналита, которую требуется измерить. Между мечеными и немечеными молекулами аналита возникает конкуренция за связывание с рецепторным слоем. После того как в системе устанавливается равновесие, требуется измерить количество связанных и свободных меток и вычислить концентрацию аналита. Классический пример использования радиоактивных меток - радиоиммунологический анализ. В нем используется конкуренция между мечеными и немечеными антигенами за связывание с антителами. Флуоресцентные метки часто используются в биосенсорах с оптическими трансдьюсерами. В иммуноферментном анализе метками являются ферменты, которые ковалентно пришиваются к антигенам или антителам, они обнаруживаются при добавлении в систему субстрата.

Достоинства и недостатки использования меток в сенсорных технологиях: прямые методы измерений, не использующие меток, часто работают быстрее и с большей точностью, чем косвенные. Введение меток в ряде случаев приводит к ухудшению связывания за счет возникновения стерических ограничений или нестабильностью меток. В то же время, при отсутствии меток требуется использовать дорогостоящее оборудование для регистрации актов связывания [5].

Применение рецепторного анализа

Данные о рецепторном анализе скептически воспринимаются клиницистами, исходя из той точки зрения, что подобные данные ничего не говорят о функции. Да, рецепторный анализ посвящен исключительно применению в фармакологии. Он демонстрирует существование рецепторов на молекулярном уровне. Метод посвящен выделению и очистке белков и позволил выделить первый рецепторный ген. Это позволило изучить локализацию рецепторов на анатомическом и клеточном уровне и дикамику рецепторного взаимодействия, включая такие аспекты, как десенситизация рецепторов, рецепторы эндо- и экзоцитоза, транспорт рецепторов через аксоны.

В области открытия и изучения новых лекарственных средств, рецепторный анализ стал революционным открытием. Поиск лекарственных средств с использованием рецепторного взаимодействия начался в середине 1970х и вскоре привел к созданию автоматизированного рецепторного анализа, позволяющего изучить влияние тысяч соединений одновременно на многие рецепторы с минимальным участием персонала [4].

Рецепторный анализ показал, что многие лекарственный средства, уже длительно применяемые в клинической практике, взаимодействуют не с одним, а со многими рецепторами, что может вызывать определенные побочные эффекты.

Рецепторный анализ дает возможность выбрать между конкурирующими гипотезами о селективном или многоцелевом действии лекарственных средств.

Описан ряд клинических состояний, при которых нарушается взаимодействие между гормоном и его специфическим рецептором. Такие нарушения объясняют изменением числа рецепторов или их сродства к гормону, а также спонтанным образованием антител к гормональным рецепторам. У больных с атаксией-телеангиэктазией может отмечаться резкая инсулинорезистентность вследствие выраженного уменьшения сродства рецепторов к инсулину. У некоторых больных со злокачественной миастенией образуются антитела к экзогенным рецепторам ацетилхолина, что и обусловливает развитие соответствующего клинического синдрома. Подобно этому у больных с acanthosis nigricans клинически выявляется инсулинорезистентность, причем результаты обследования таких больных убедительно свидетельствуют о роли антител к инсулиновым рецепторам в имеющейся инсулинорезистентности. Число специфических рецепторов инсулина, приходящееся на каждую клетку, может быть снижено при ожирении, вследствие чего у тучных больных уменьшается чувствительность к инсулину. При уменьшении массы тела у этих больных число инсулиновых рецепторов на клетку увеличивается и нормализуется чувствительность к инсулину. У некоторых больных с гипертиреозом в крови присутствуют антитела к рецепторам ТТГ. В отличие от больных со злокачественной миастенией и диабетом, у таких больных антитела к рецепторам ТТГ могут стимулировать мембранные рецепторы в ткани щитовидной железы, индуцируя повышенную продукцию и секрецию тироксина и трийодтиронина, что и обусловливает гипертиреоидное состояние [7].

Принцип радиорецепторного метода по существу не отличается от радиоиммунологического, только гормон, вместо того чтобы связываться с антителами, связывается со специфическим гормональным рецептором плазматической мембраны или цитозоля. Специфические рецепторы большинства полипептидных гормонов располагаются на наружной поверхности плазматической мембраны клеток, тогда как рецепторы биологически активных стероидов, а также тироксина и трийодтиронина -- в цитозоле и ядрах. Чувствительность радиорецепторного анализа ниже, чем радиоиммунологического и большинства биологических методов в системах in vitro. Для того чтобы взаимодействовать со своим рецептором, гормон должен иметь соответствующую конформацию, т. е. быть биологически активным. Возможна ситуация, в которой гормон теряет способность связываться со своим рецептором, но продолжает взаимодействовать с антителами в системе для радиоиммунологического анализа. Это расхождение отражает тот факт, что антитела и рецепторы «узнают» разные участки молекулы гормона.

Предложен ряд радиорецепторных методов гормонального анализа. Обычно получают ткань специфического для данного гормона органа-мишени и с помощью стандартных методик выделяют из нее рецепторы. Изолированные рецепторы плазматической мембраны в осадке при хранении в условиях температуры менее -20 °С относительно стабильны. Однако солюбилизированные рецепторы полипептидных и стероидных гормонов, выделенные из плазматических мембран либо из цитозоля и не связанные с лигандами, оказываются нестабильными, что проявляется снижением их способности связывать специфические гормоны, даже если они хранились в замороженном виде, сравнительно недолго [9].

Как пример использования рецепторных методов анализа в современной клинической фармакологии в качестве методики обнаружения лекарственного средства можно привести исследование фармакодинамики фенотропила [10]. Для количественного определения рецепторов в мембранных препаратах, приготовленных из компетентных морфофункциональных образований (гиппокампа, полосатого тела, коры больших полушарий) мозга крыс, применяли общепринятый метод радиорецепторного анализа с использованием специфических лигандов, меченных по тритию, в подборе которых основывались на рекомендациях IUPHAR от 2006 г. Были использованы два методических подхода в действии Фенотропила на рецепторы нейромедиаторов: метод in vitro и метод ex vivo. В первом случае мембраны мозга, содержащие рецепторы, инкубировали в пробирках вместе с радиоактивно меченным лигандом определенного рецептора в присутствии различных концентраций Фенотропила. Измерение специфически связавшегося в данных условиях радиоактивного лиганда с мембранным рецептором давало ответ на вопрос: оказывает ли лекарственное вещество прямое, конкурирующее действие на изучаемый тип рецептора? Активность препарата в данном варианте опытов выражали величиной концентрации, изменяющей специфическое связывание радиоактивного лиганда с рецептором на 50%, - IC50 (“inhibitory concentration 50”). Во втором случае Фенотропил вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг, один раз в день в течение 7 сут. Группе контрольных животных вводили физиологический раствор. Через 24 ч после последней инъекции крыс декапитировали, извлекали мозг, готовили мембраны выделенных структур мозга, образцы которых инкубировали в присутствии радиолиганда.

Обработанные результаты измерений были представлены величинами Bmax и Kd, отражающими концентрацию рецепторов в мембранах и степень структурного сродства (аффинитета) лекарственного средства к рецептору.

соответственно. Анализ данных ex vivo позволяет интерпретировать полученные сведения в свете возможного непрямого, модулирующего влияния Фенотропила на рецепторный профиль, отражающий реакцию клеток мозга на субхроническое введение препарата. Все меченые лиганды были получены методом твердофазного катализа в ОХВАВ Института молекулярной генетики РАН (заведующий - академик РАН Н.Ф. Мясоедов). Результаты экспериментов обрабатывали с помощью программ Statistica 6.0 и GraphPad 4.0 Prism [10].

Также рецепторный анализ можно использовать для определения альбумина в моче методом гетерогенного твердофазного одностадийного конкурентного рецепторного анализа при изучении клинической фармакологии пероральных гипогликемических средств, а также многих других [8].

С учетом того, что в Российской Федерации с 2007 года существует ГОСТ, регламентирующий использование рецепторного анализа для обнаружения противомикробных средств в молоке и молочных продуктах, следует отметить широкую востребованность рецепторных методов на территории СНГ.

Список использованных источников