Детекторы (6) для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения, которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно. Регистрирующая (7) система в простейшем случае состоит из дифференциального усилителя и самописца.

2.2 Материалы и условия экспериментов

2.2.1 Использованные реактивы и материалы

В работе были использованы следующие реактивы и материалы: Трис- (гидроксиметил)-аминометан, КCl, N,N'-метилентрисакриламид, додецилсульфат натрия, N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, персульфат аммония, АТР, АМР и мальтогептоза ("Sigma", США), человеческий сывороточный альбумин ("Reanal" Венгрия), маркеры молекулярной массы белков ("Sigma", США), другие реактивы - препараты отечественного производства квалификации ос.ч.

Препараты IgG, sIgA и IgM антител были любезно предоставлены сотрудниками ЛФР ИХБФМ СО РАН. Электрофоретически гомогенные препараты ЛФ из молока лактирующих женщин были получены Бабиной С. Е. (ИХБФМ СО РАН) согласно методикам описанным ранее [27, 28, 29].

2.2.2 Подготовка образцов лактоферрина для анализа

После получения электрофоретически гомогенных препаратов лактоферрина их диализовали против 50 мМ Трис-НСl, рН 7.5, замораживали в жидком азоте и лиофилизовали на стандартной установке для лиофилизации при температуре - 3-4^оС. Лиофилизованные препараты хранились практически без потери активности примерно в течение 1 года. В проведенных нами исследованиях использовались свежеполученные растворы лиофилизованных препаратов ЛФ (2 - 10 мг/мл) в 50 мМ Трис-НСl, рН 7,5. Сразу после растворения препаратов ЛФ их подвергали центрифугированию (5 мин, 10 тысяч оборотов/ мин) на центрифуге Eppendorf для удаления небольшого количества нерастворимого белка. Затем полученные растворы ЛФ (2-10 мг/мл ) инкубировали в 50 мМ Трис-НСl буфере, рН 7,5, без дополнительных компонентов или добавляли КСl (0,1 - 1 M), а также один из природных лигандов в насыщающих концентрациях: 50 мМ АТР, 50 мМ АМР или 5 мМ мальтогептозу. В зависимости от типа эксперимента смеси инкубировали при 25С в течение 5 ч или нескольких суток (вплоть до 1 месяца) при 25 или 4 С. Аликвоты реакционных смесей использовали для анализа олигомерного состояния ЛФ с помощью четырех различных методов (см. ниже) сразу после их получения или после инкубации в течении различного времени.

2.2.3 Условия проведения гель-хроматографии белков

Для анализа олигомерного состояния ЛФ после его инкубации в различных условиях использовали сорбент Sepharose 4B, который из всех проверенных смол для гель-хроматографии обладал минимальной способностью взаимодействавоть с ЛФ и его олигомерными комплексами. Хроматографию проводили с помощью хроматографа "Biocad Sprint", снабженного перестальтическим насосом с мягкой подачей раствора на колонку. Раствор ЛФ (0,2- 0,4 мл; 2-4 мг /мл) в в 50 мМ Трис-НСl буфере, рН 7,5, содержащем или несодержащем другие лиганды (до и после инкубации в различных условиях, см. выше) наносили на колонку Sepharose 4B (0,8 х 33 см), предварительно уравновешенную этим же буфером. Элюцию белков с сорбента проводили с помощью 50 мМ Трис-НСl буфера, рН 7,5, без соли или буфер содержал 0,1 или 0,15 М КСl. За выходом ЛФ следили по его поглощению на 280 нм. Для оценки мол. масс ЛФ и его комплексов с помощью метода гель-хроматографии использовали белки с известной мол. массой. Была получена калибровочная кривая, которая приведена ниже. Контрольные белки, как и ЛФ, наносили в объеме 0,1 - 0,3 мл в концентрации 1-3 мг/мл. Чувствительность детектора хроматографа равна 1?10^-8 г/мл. Среднеквадратичное отклонение пиков при хроматографии препаратов ЛФ было найдено <2%. Минимальная характерная селективность разделения ближайших пиков ЛФ составила 1,3-1,4. Степень разделения варьировала от 0,3 до 2,5. Точность соответствия стандартам была оценена ? 6%.

2.2.4 Условия проведения экспериментов по анализу ЛФ методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР)

Смеси (0.1 - 2 мл) для анализа содержали 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5, 1-6 мг/мл (12-72 мкМ) ЛФ, в некоторые из них добавляли 0.1 - 1 М КСl. К реакционным смесям добавляли АМР, АТР или олигосахарид (0.1-5 мкл) в различных концентрациях, включая насыщающие: 50 мМ нуклеотиды и 5 мМ олигосахарид. В некоторых экспериментах в смесь были добавлены 3 M NaCl или 3 M MgC12 до конечной концентрации 1 М или 5 -25 мМ, соответственно. В МУРР и СР экспериментах использовали те же смеси, что и для гель-хроматографии. Измерения с помощью МУРР и СР и обработку полученных результатов проводили как описано выше.

2.2.5 Измерение индикатрис светорассеяния

Прибор для измерения светорассеяния от анализируемых образцов (световой дифрактометр) состоял из одного фотодетектора и 14 лазерных монохроматических источников, установленных по внутреннему периметру камеры светорассеяния. В центр камеры помещали образец, а управление установкой и получение значений интенсивности производили при помощи компьютера. При этом поочередно включались лазерные источники и рассеянное излучение попадало в фотоприемник (детектор), после чего сигнал с приемника поступал на фотоэлектронный умножитель, откуда через аналоговый цифровой преобразователь передавался на компьютер. Индикатрисы светорассеяния измеряли в угловом диапазоне 2И = 56,25? 123,75⁰ (h = 0.0018 ? 0.004 А^-1), где h = 4 • р • n ? sin(И)/л; n - показатель преломления буферной смеси (~1,35). Длина волны используемого светового излучения л = 4300 А, применима к исследованию частиц 0,005 - 50 мкм, температура образцов при измерении индикатрис 20⁰С. В индикатрисы вносили поправки на фоновое рассеяние и поглощение излучения образцом. Измерения проводились с точностью 3-5%, исходя из оценки точности , где N количество измерений. Чувствительность прибора составляет 10 импульсов/сек.

Для изучения олигомерных форм ЛФ необходимы были прямые методы анализа олигомерных форм белков в растворе. Известно, что использование дифракционных методов для анализа макромолекул и их комплексов позволяет получить информацию о их структуре и дисперсном составе непосредственно в растворе [. Tuzikov F.V., Zinoviev V.V., Vavilin V.I. and Malygin E.G. Application of the Small-Angle X-ray Scattering technique for the study of two-step equilibrium enzyme-substrate interactions. Biopolymers. 1996. V.38. P.131-139.31, . Гилл Ф., Мюррей У., Райт М. 1985. Практическая оптимизация. М.: Мир., 509с., Тузиков Ф.В. Анализ биологических наноструктур в системах метаболизма белков и липидов: строение, дисперсный состав и механизмы равновесных взаимодействий макромолекул. Дисс. на соиск. уч. степ. д.б.н. 20005. Новосибирск. 364с.

].

Для исследования олигомерного состояния ЛФ на первом этапе было использовано два подхода - метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР) и светорассеяния (СР). Это определялось тем, что потенциально ЛФ мог находиться в различных олигомерных формах от мономера до высокополимерных состояний. В то же время, с помощью МУРР можно видеть только частицы относительно небольшого размера, характеризуемые параметром h = 0.013 ? 0.103 A^-1, что сопоставимо в размером олигомеров ЛФ, содержащих от 1 до 4 мономерных единиц, этот метод "не видит" более крупных частиц. Наличие в растворе более крупных частиц с h = 0,00137 ? 0.00206 A^-1 можно анализировать с помощью метода СР.

Обычно в экспериментах по исследованию ЛФ используются препараты белка, которые после очистки хранятся в нейтральных растворах с концентрацией порядка 2 - 10 мг/мл при 4^oС или растворы белка замораживаются. Сначала нами были получены рентгенограммы МУРР для стандартного раствора лиофилизованного ЛФ (50 мМ Трис -НСl буфер, рН 7,5), хранившегося в течение месяца при 4^оС (рис. 7).

Рис. 7. Рентгенограммы МУРР в координатах I(h) от h для одного из препаратов агрегированного ЛФ (68 мкМ) в 50 мМ Tрис-НCl буфере, рН 7.5, до и после инкубации с 1 M NaCl в течение 1 - 42 ч. Этим четырем кривым соответствуют значения R_g, равные: 43.7, 38.6, 32.9 и 27.4 A, соответственно. Из данных МУРР следует что ЛФ переходит в мономерную форму при 1 М концентрации NaCl.

Данные для ЛФ были построены в координатах Гинье и на их основании рассчитано значение Rg. Согласно данным МУРР оно равно 43.7 A, что значительно выше ожидаемого и свидетельствует в пользу того, что ЛФ находится в растворе не в моно, а в полидисперсном состоянии. Как известно, при добавлении 1 М NаСl олигомерные формы ЛФ должны диссоциировать до мономеров [16-17]. На рис. 7 приведены данные по изменению рентгенограмм МУРР во времени для раствора ЛФ после добавления NaCl до конечной концентрации 1 М. Из этих данных были оценены величины Rg для ЛФ через разные промежутки времени после добавления NаСl: 38.6 A (через 1 ч); 32.9 A (20 ч) и 27.4 A, (42 ч). Как видно из рис. 7, кривая, соответствующие 42 ч инкубации совпадают с таковыми для ожидаемого мономера ЛФ с величиной Rg = 26.7 A. Следовательно, диссоциация олигомерных форм ЛФ под действием соли происходит медленно, и только после 42 ч инкубации раствор содержит преимущественно мономерные формы белка.

Эти же растворы были проанализированы с помощью СР (подробнее смотри ниже). По данным СР растворы лиофилизованных препаратов ЛФ содержали олигомеры более высокой олигомеризации, чем тетрамеры, которые можно видеть с помощью МУРР.

Из данных полученных выше, было очевидным, что при длительном хранении растворов ЛФ происходит образование различных олигомерных форм белка. Для исследования эффектов различных лигандов на процессы олигомеризации необходимо было оценить временные интервалы, за которые происходит образование олигомеров в отсутствие и в присутствии различных лигандов ЛФ, а также КСl.

Как известно, ЛФ является исключительно конформационно активным белком [24]. Полученные данные свидетельствовали в пользу того, что в процессе лиофилизации молекулы белка могут переходить в какую-то конформацию, которая не способствует его олигомеризации с образованием форм с исключительно большой мол. массой. По-видимому, в процессе хранения растворов происходит медленное изменение конформации ЛФ и накопление таких мономеров, которые легко образуют его высокоолигомерные формы.

При помощи измерения светорассеяния на угол 90⁰ была исследована кинетика олигомеризации ЛФ после добавления буфера, соли и лигандов (см. рис. 8).

Рис. 8. Относительное изменение светорассеяния на угол 90^о при инкубации ЛФ в 50 мМ трис-НСl буфере от отсутствии (а) и в присутствии 0.1 М KCl (б). Реакционные смеси инкубировали в отсутствие других лигандов (кривые 1), в присутствии 50 мМ АТР (кривые 2) или 5 мМ олигосахарида (кривые 3).

Как видно из рис. 8а, в отсутствие КСl, происходит сильное увеличение СР раствора ЛФ в течение первых примерно 10 ч инкубации, а затем ее заметное уменьшение. При добавлении в инкубационную смесь АТР или олигосахарида процесс олигомеризации ЛФ замедляется; максимальные изменения СР наблюдаются после примерно 4-5 ч инкубации, а затем идет медленное возрастание СР.

Добавление 0,1 М КСl скорость начального процесса олигомеризации уменьшается, но после длительной инкубации достигается кажущегося плато значений СР, близкое к таковому для смеси без соли. Добавление АТР или олигосахарида в инкубационную смесь, содержащую 0,1 М КСl, приводит в большей степени к замедлению олигомеризации ЛФ в присутствии олигосахарида, чем АТР. Интересно, что как в отсутствие, так и в присутствии КСl после 100 ч инкубации раствора ЛФ с АТР значение СР выше, чем для растворов без АТ. Наклон кинетических кривых изменения интенсивности СР в присутствии АТР и олигосахарида свидетельствует в пользу того, инкубация смесей более 100 ч (~ 4 дней) может приводить к образованию большего количества олигомерных форм ЛФ в присутствии лигандов, чем в их отсутствии. Учитывая это, в описанных ниже экспериментах анализ содержания олигомерных форм ЛФ проводили после инкубации всех реакционных смесей более 10 дней.

3.1 Анализ олигомерных форм ЛФ методом гель-хроматографии

Как отмечалось выше, ЛФ взаимодействует со многими широко распространенными сорбентами, используемыми для гель-хроматографии. Сотрудниками ЛФР ИХБФМ в результате анализа ряда сорбентов было показано, что наиболее оптимальным для анализа ЛФ c помощью метода гель-хроматографии является Sepharose 4B. Этот сорбент слабо взаимодействует с ЛФ и относительное время выхода олигомерных форм ЛФ при гель-хроматографии соответствует их относительным молекулярным массам. Учитывая это, в данной работе был проведен анализ относительного содержания олигомерных форм ЛФ, инкубированного в различных условиях, с помощью гель-хроматографии.

Для оценки относительной массы олигомерных форм ЛФ сначала была проведена гель-хроматография контрольных белков с известной мол. массой и построена калибровочная кривая (рис. 9).

Рис. 9. Калибровочная кривая для оценки мол. масс белков, полученная с использованием белков с известными мол. массами: ЧСА (67), IgG (150 кДа), IgA (400 кДа), IgM (800 кДа).

Следует отметить, что точное определение мол. масс небольших пиков белка около 800 кДа и более сильно затруднено, так как при таком малом времени выхода, значительными становятся такие факторы как ширина пика, а так же объем и время нанесения пробы на сорбент. Кроме того, Sepharose 4B обладает плохой эффективностью разделения белков с мол. массами ? 800 кДа. Учитывая это, далее следует считать, что фракции ЛФ, кажущиеся мол. массы которых оценены приблизительно как 780, 800 кДа и более (но не меньше) могут иметь и значительно большую мол. массу, или быть смесью нескольких субфракций белка, мол. масса которых превышает 780 кДа. В то же время пик декамера, соответствующий 754 кДа (см. ниже), скорее всего, можно считать определенным с более высокой точностью ввиду его малой ширины и хорошей высоты пика белка, а так же существенного удаления от характерного места выхода небольших по размеру пиков более 780 кДа.

На рис. 10 приведен профиль оптической плотности, соответствующей гель-хроматографии лактоферрина, инкубированного в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, а так же после инкубации ЛФ в этом же буфере, содержащем, 0,1 и 0,15 КСl. Видно, что ЛФ, инкубированному в буфере без соли, соответствует большой пик с кажущейся мол. массой 275 кДа с двумя плечами в области 295 и 251 кДа. Кроме того, видны пики в области ?145 кДа и относительно маленький по величине пик в области примерно 780 кДа.

Добавление к раствору ЛФ 0,1 М КСl ведет к очень сильному уменьшению пика с мол. массой 275 кДа и резкому увеличению пиков с мол. массами 145 и 68 кДа. Одновременно происходит уменьшение высокомолекулярного пика в области 780 кДа. Увеличение концентрации КСl до 0,15 М приводит к еще более сильному перераспределению относительного количества ЛФ в указанных пиках. После инкубации ЛФ с 1 М КСl обнаружен только один пик белка, элюируемый в области 68 кДа.

На основании данных Таблицы 5 можно выделить несколько закономерностей:

1) Инкубация ЛФ в буфере, не содержащем КСl и других соединений основной формой белка является тетрамер.

2) Добавление в раствор ЛФ 0,1 - 0.15 М КСl ведет к разрушению тетрамеров с образованием преимущественно димеров белка.

4) В отсутствие соли только АМР стимулирует заметное образование декамера, а в присутствии 0,1 М КСl происходит образование необычной формы ЛФ, его пентамера.

Следует отметить, что пик белка, соответствующий олигомеру(ам) крупнее декамера (с мол. массой ? 780 -800 кДа) присутствовал в ряде реакционных смесей. Однако в случае анализа олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии он был маленьким во всех случаях кроме АTР и 0,1 М KCl. Учитывая это, во всех случаях содержание этого пика было принято близким к 0. Скорее всего, этот олигомер является неустойчивым и разрушается во время хроматографии.

Следует отметить, что все олигомеры ЛФ являются не очень стабильными и легко разрушаются при добавлении соли. Кроме того, нельзя было исключить, что часть олигомерных форм ЛФ может разрушаться при гель-хроматографии, а взаимодействие молекул ЛФ с сорбентом может стимулировать диссоциацию комплексов белка. Поскольку некоторые пики, соответствующие высокоолигомерным формам, относительно маленькие, а их уменьшение может быть связано с перераспределением белковой плотности между пиками представляется в процессе хроматографии, корректная оценка содержания с помощью гель-хроматографии высокоолигомерных форм белка в растворе представляется не возможной. Одним из методов оценки относительных размеров белков непосредственно в растворе является метод СР. Как указывалось выше, олигомеры ЛФ, содержащие от 1 до 4 мономерных единиц белка, должны относительно слабо рассеивать свет. В то же время, именно олигомерные формы, содержащие больше 4 субъединиц белка, должны вносить максимальный вклад в СР.

3.2 Анализ олигомеров ЛФ методом светорассеяния

В экспериментах по СР были использованы те же самые растворы ЛФ, что и для гель-хроматографии. Для каждого раствора были измерены индикатрисы СР (рис. 14). Экстраполируя индикатрисы СР к нулевому углу и пользуясь тем, что I(0)~N*M², можно оценить среднеквадратичную молекулярную массу в каждой из смесей (рис. 15).

Рис. 14. Анализ светорассеяния олигомерными формами ЛФ, полученными в разных условиях. ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 0,1 М КСl (кривая 1) и один из лигандов: 2 - 5 мМ олигосахарид, 3 - 50 мМ АТР, 4 - 50 мМ АМР.

Рис. 15. Значения корней среднеквадратичных масс для всех исследованных растворов ЛФ. Серии из трех столбиков диаграммы соответствуют: 1 - олигосахарид, 2 - ЛФ в отсутствии лигандов, 3 - АТР, 4 - АМР. В каждой из серий столбики соответствуют: 1 - ЛФ в отсутствие соли, 2 - в присутствии 0,1 M КСl, 3 - в присутствии 0,15 M КСl.

При получении данной оценки считалось, что ЛФ, инкубированный с олигосахаридом в 0,15 M KCl, имеет среднеквадратичную массу 145 кДа (согласно данным гель-хроматографии) и не содержит олигомерных форм большего тетрамера.

Оцененная таким образом среднеквадратичная масса олигомерных форм ЛФ оказалась во всех случаях больше массы, оцененной с помощью гель-хроматографии, а в некоторых случаях она была больше массы тетрамера. Это означает, что долю крупных олигомерных форм, не учтенных при гель-хроматографии (или диссоциировавших в ходе хроматографии), можно оценить с помощью СР.

Очевидно, что при ассоциации могут образовываться различные олигомерные формы ЛФ, содержащие более 4-х мономерных единиц, которые будут рассеивать свет. По данным гель-хроматографии АМР стимулирует достоверное образование декамера, который в присутствии соли диссоциирует до пентамера. По приблизительным оценкам олигомеры с кажущейся мол. массой больше 800 кДа, которые наблюдаются в ряде случаев, могут быть примерно 16-мерами. К сожалению, оценка относительного содержания ассоциатов с разной степенью олигомеризации на основании полученных данных не представляется возможной. В то же время, можно оценить примерное содержание какого-либо одного высокоолигомерного ассоциата, если предположить, что данный ассоциат - единственный крупный олигомер (декамер и больше). На основании численных данных, приведенных на рис. 15, был проведен теоретический анализ возможного содержания 10-мерного и 16-мерного ассоциатов ЛФ в анализируемых растворах белка. Полученные данные приведены в табл. 5.

Интересно, что согласно проведенному анализу данных СР декамер может присутствовать во всех смесях ЛФ, кроме белка инкубированного в буфере, содержащем 1 М КСl. В данной модели анализ теоретического содержания крупных олигомеров проводился путем сравнения с наименее олигомеризованной смесью - ЛФ с олигосахаридом в 0,15 М КСl, т.е. считалось что в данном растворе олигомерный состав соответствует гель-хроматографии). При этом содержание декамера эффективнее всего стимулируется и регистрируется хроматографически только при добавлении АМР, затем (игнорируя содержание более крупных форм даже и зарегистрированных гель-хроматографией) АТР и хуже всего олигосахарида. Добавление 0,1 М КСl приводит к уменьшению содержания в растворе высокоассоциированных форм ЛФ, кроме ЛФ инкубированного с АTP, в котором олигомеризация повышается (согласно гель-хроматографии за счет крупного олигомера, при разрушении тетрамера).

В случае предположения о содержании в растворе только 16-мера ЛФ численные значения уменьшаются примерно в 2-3 раза, но общие закономерности те же самые (Таблица 5).

Таким образом, данные СР свидетельствуют в пользу того, что в растворе, в отсутствие других лигандов, а также в присутствии АТР и АМР может происходить образование высокоолигомерных форм ЛФ, которые, по-видимому, не стабильны и разрушаются в процессе гель-хроматографии на Sepharose.

ЛФ - конформационно активный белок, который может по-разному изменять свою структуру в присутствии лигандов разного типа. Поэтому различная эффективность образования олигомеров различной степени олигомеризации и стабильности, обнаруженные с помощью данных СР и гель-хроматографии (табл. 5) может свидетельствовать в пользу того, что под действием разных лигандов и в их отсутствии образуются олигомеры с разным типом организации. В пользу того, что олигосахарид, АТР и АМР стимулируют образование олигомеров ЛФ разного типа свидетельствуют данные о различной стабильности белковых ассоциатов, образующихся в присутствии этих лигандов. Так согласно данным СР, олигомерные формы ЛФ, образованные в присутствии АТР, разрушаются до мономеров в присутствии 50 мМ MgCl2 в течение 25 мин. в то время как АМР-зависимые комплексы в этих условиях достаточно стабильны (данные не приводятся).

С помощью индикатрис светорассеяния можно так же оценить средний радиус инерции для набора частиц, содержащихся в каждом из растворов. рис. 14 приведены данные по СР растворами ЛФ, инкубированными в различных условиях. С помощью уравнения Гинье средний радиус инерции (Rg) для ЛФ, инкубированного с ATP в присутствии 0,1 M KCl составил 41 ± 3 нм, а для ЛФ инкубированного с AMP в 0,1 M KCl - 40 ± 3 нм. Эти величины существенно больше величины Rg = 26.7 A, найденного с помощью МУРР для мономера ЛФ. Поскольку основной вклад в СР вносят крупные по размеру частицы, то эти значения Rg можно считать нижней оценкой размеров крупных олигомеров.

3.3 Анализ олигомеров ЛФ методом абляции

Одним из современных методов исследования мол. масс белков является МАЛДИ. Однако, этот метод исследования является достаточно жестким и при переходе нанесенных на носитель белков в газовую фазу происходит частичное разрушение белковых молекул. В связи с этим метод МАЛДИ не пригоден для исследования белковых олигомерных комплексов, в которых субъединицы обычно связаны слабыми нековалентными электростатическими, гидрофобными, Ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями и водородными связями. Метод абляции различных соединений с твердых подложек существенно мягче, чем МАЛДИ, по условиям переведения соединений в газовую фазу. В настоящее время сотрудниками ИЦиГ и ИКХиГ СО РАН показано, что пероксидаза хрена может быть аблирована из лиофилизованного состояния и при этом она сохраняет свою каталитическую активность.

В данной работе впервые были сделаны попытки проанализировать на примере комплексов ЛФ возможность анализа олигомерного состояния белков с помощью метода абляции. Сначала были проведены эксперименты по абляции некоторых стандартных белков из лиофилизованного состояния. В качестве подложки для лиофилизации использовали силуфольные пластины. Растворы белков наносили на поверхность пластин, содержащих слой силикагеля и на обратную - чистую сторону алюминиевой пластины. Образцы, нанесенные на пластины, замораживали над жидким азотом и затем подвергали абляции. Было показано, что абляция белков с поверхности, содержащей силикагель, приводит к появлению в спектре в основном частиц с мол. массой, соответствующей использованным белкам. В то же время использованные белки в этом случае подвергались частичной деструкции. В то же время при абляции белков с алюминиевой поверхности заметной деструкции белков не наблюдалось. Аналогичные данные были получены при абляции комплексов ЛФ с силуфольной и алюминиевой поверхности. На рис. 16 приведен спектр белковых частиц, соответствующий комплексу ЛФ после его инкубации в нейтральном буфере в отсутствии соли.

Основной формой ЛФ в случае силуфола (рис. 16а) является тетрамер; димер и мономер не разделились. Наличие частиц в спектре частиц с размером менее 5 нм позволяет предположить, что произошло разрушение не только олигомеров крупнее тетрамера, но так же и разрушение мономера.

При абляции ЛФ с алюминиевой подложки (рис. 16б) и при меньшей интенсивности излучения, мономер и димер не были обнаружены, но удалось зарегистрировать крупные олигомеры с размером порядка 103 нм, что согласуется данными светорассеяния. При условии что еще более крупные олигомеры не "развалились", это может означать, что растворы ЛФ могут содержать ассоциаты типа 16-меров (или больше). Таким образом очевидно, что абляция с алюминиевой подложки более перспективна для исследования нековалентных олигомерных комплексов белков.

Рис. 16. Абляция ЛФ инкубированного в буфере. а) ЛФ аблироавнный с силуфола, б) ЛФ аблированный с алюминиевой подложки.

1. Методом гель-хроматографии впервые проведен анализ олигомерных форм лактоферрина (ЛФ), которые образуются под действием его природных лигандов. Показано, что в нейтральном буфере при низкой ионной силе основной формой лактоферрина, устойчивой в условиях хроматографии, является тетрамер, диссоциирующий до димеров и мономеров после добавления 0,1 М КСl. АТР и АМР в отсутствие соли стимулируют образование преимущественно димерной, а олигосахарид - мономерной формы белка. Олигосахарид в присутствии соли КСl стимулирует образование димера, ATP разрушает тетрамерную и димерную форму ЛФ, а в присутствии АМР происходит формирование димера и необычной формы лактоферрина - пентамера.

2. Методом светорассеяния исследована эффективность образования олигомеров в присутствии и отсутствии различных лигандов и показано, что лактоферрин в присутствии АТР и АМР образует высокоолигомерные формы. Согласно средним радиусам инерции этих олигомеров они могут содержать в своем составе до 10 и более мономеров ЛФ.

3. Впервые исследованы олигомерные формы лактоферрина методом лазерной абляции. Данные светорассеяния и абляции приводят к сопоставимым результатам, подтверждающим наличие в растворах лактоферрина крупных по размеру олигомеров лактоферрина. Сравнение данных гель-хроматографии, светорассеяния и лазерной абляции свидетельствует в пользу того, что высокоолигомерные формы лактоферрина могут разрушаются при их контакте с сорбентом в процессе хроматографии.

Список литературы

лактоферрин дифракция олигомерный аббеляция

Birgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331.

Birgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331.

Levay, P.F., Viljoen, M. Lactoferrin: a general review. (1995) Haematologica., 80(3), 252-267.

Отт В.Д., Дюкарева С.В., Мельников О.Р. Лактоферрин и перспективы его использования в алиментарной профилактике анемий. (1993) Вопр. Питания, 1, 6-13.

Weinberg, E.D. Human lactoferrin: a novel therapeutic with broad spectrum potential. (2001) J. Pharm. Pharmacol. 53(10), 1303-10.

. Metz-Boutigue, M.H., Jolles, J., Mazurier, J., Schoentgen, F, Legrand, D., Spik, G., Montreuil, J., and Jolles, P. Human lactotransferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins. (1984) Eur. J. Biochem., 145, 659.

Jameson, G.B., Anderson, B.F., Norris, G.E., Thomas, D.H., Baker, E.N. Structure of human apolactoferrin at 2.0 A resolution. Refinement and analysis of ligand-induced conformational change (1998) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 54, 1319-1335.

Legrand, D., Salmon, V., Coddeville, B., Benaissa, M., Plancke, Y., Spik, G. Structural determination of two N-linked glycans isolated from recombinant human lactoferrin expressed in BHK cells (1995) FEBS Lett., 365(1), 57-60.

Van Berkel, P.H., van Veen, H.A., Geerts, M.E., de Boer, H.A., Nuijens, J.H. Heterogeneity in utilization of N-glycosylation sites Asn624 and Asn138 in human lactoferrin: a study with glycosylation-site mutants (1996) Biochem. J., 319, 117-122.

Van Berkel, P.H., Geerts, M.E., van Veen, H.A., Kooiman, P.M., Pieper, F.R., de Boer, H.A., Nuijens, J.H. Glycosylated and unglycosylated human lactoferrins both bind iron and show identical affinities towards human lysozyme and bacterial lipopolysaccharide, but differ in their susceptibilities towards tryptic proteolysis (1995) Biochem. J., 312, 107-114.

Moguilevsky, N., Retequi, L., Masson, P. . Comprasion on human lactoferrins from milk and neutrophilic leucocytes. Relative molecular mass, isoelectric point, iron-binding properties and uptake by the liver. (1985) Biochem. J., 229, 353-359.

Shongwe, M.S., Smith, C.A., Ainscough, E.C., Baker, H.A., Brodie, A.M., Baker, E.N. Anion binding by human lactoferrin: results from crystallographic and physicochemical studies. (1992) Biochem. J., 31, 4451-4458.

Davidson, L. A., and Lonnerdal, B. Fe-saturation and proteolysis of human lactoferrin: effect on brush-border receptor-mediated uptake of Fe and Mn. 1989 Dec;257(6 Pt 1):G930-4.

Mazurier J., SpikG. Comparative study of the iron-binding properties of human transferring. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin. 1980 Biochim. Biophys. Acta, 629, 399-408.

Sousa, M., Brock, J.H., Iron in immunity. Cancer and Inflammation (1989) John Wiley & Sons.

Bennett, R.M., Bagby, G.C., Davis, J. (1981) Calcium-dependent polymerization of lactoferrin Biochem. Biophys. Res. Commun., 101(1), 88-95.

Bagby, G.C.Jr., Bennett, R.M. Feedback regulation of granulopoiesis: polymerization of lactoferrin abrogates its ability to inhibit CSA production (1982) Blood, 60(1), 108-112.

Mantel, C., Miyazawa, K., Broxmeyer, H.E. Physical characteristics and polymerization during iron saturation of lactoferrin, a myelopoietic regulatory molecule with suppressor activity (1994) Adv. Exp. Med. Biol., 357, 121-132.

Rosenmund, A., Kuyas, C., Haeberli, A. Oxidative radioiodination damage to human lactoferrin. (1986) Biochem. J., 240, 239-245.