1.1.1 Строение молекулы лактоферрина

Белки семейства трансферринов, которые содержатся в крови, контролируют уровень железа у высших животных путем прочного, но обратимого связывания ионов железа [. Birgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331.]. Лактоферрин (ЛФ) является одним из белков этого семейства, он был впервые открыт в женском молоке в конце 30-х годов. В дальнейшем изучению его строения и физиологической роли было посвящено значительное число исследований, которые показали, что ЛФ содержится в плазме крови, нейтрофильных лейкоцитах и является одним из основных белков практически всех экзокринных секретов млекопитающих [. Birgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331.]. В наибольшей концентрации ЛФ содержится в молозиве человека (до 6 - 7 мг/мл), в процессе лактации этот показатель в молоке уменьшается до 1 мг/мл (Табл. 1) [. Levay, P.F., Viljoen, M. Lactoferrin: a general review. (1995) Haematologica., 80(3), 252-267.

Отт В.Д., Дюкарева С.В., Мельников О.Р. Лактоферрин и перспективы его использования в алиментарной профилактике анемий. (1993) Вопр. Питания, 1, 6-13.].

Таблица 1. Уровень ЛФ в различных жидкостях и тканях человека в норме*.

*Концентрация белка в некоторых жидкостях, таких как амнион, слюна, синовиальная жидкость в случае инфекции увеличивается в 2-10 раз [. Weinberg, E.D. Human lactoferrin: a novel therapeutic with broad spectrum potential. (2001) J. Pharm. Pharmacol. 53(10), 1303-10.].

**при бактериальных менингитах, в нормальном состоянии ЛФ не детектируется

ЛФ представляет собой гликопротеид с мол. массой 76 000 - 80 000 дальтон [1-3]. Белок существует в двух формах - железонасыщенной (холо-ЛФ, 80 кДа) и железоненасыщенной (апо-ЛФ, 75 - 76,4 кДа). По аминокислотному составу и мол. массе он сходен с трансферрином (73,8 - 86 и 75 - 76,6 кДа холо- и апо -формы, соответственно). Аминокислотные составы ЛФ и трансферрина имеют 59% и 49% гомологии между двумя соответствующими доменами, входящими в состав этих белков [. Metz-Boutigue, M.H., Jolles, J., Mazurier, J., Schoentgen, F, Legrand, D., Spik, G., Montreuil, J., and Jolles, P. Human lactotransferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins. (1984) Eur. J. Biochem., 145, 659.]. Вторичные и третичные структуры этих двух белков также сходны между собой. ЛФ отличается от трансферрина антигенной структурой, углеводными компонентами, изоэлектрической точкой, растворимостью в воде и расположением железосвязыващих участков и сайтов гликозилирования этих белков.

ЛФ образован одной полипептидной цепью, которая содержит 703 аминокислотных остатка. На основании данных рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.0 A была предложена модель трехмерной структуры ЛФ, согласно которой полипептидная цепь свернута в два гомологичных домена, называемых N- и C-долями, содержащими 1-338 и 339-703 остатки соответственно, а их концы соединены короткой -спиралью (рис. 1). Каждая доля белка состоит из двух доменов: N1, N2 и C1, C2. Третичные структуры железонасыщенного и железоненасыщенного ЛФ различны; для апо-ЛФ характерна "открытая" конформация N-доли и "закрытая" конформация С-доли, а для Fe-ЛФ характерна закрытая конформация обеих долей (рис. 1) [. Jameson, G.B., Anderson, B.F., Norris, G.E., Thomas, D.H., Baker, E.N. Structure of human apolactoferrin at 2.0 A resolution. Refinement and analysis of ligand-induced conformational change (1998) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 54, 1319-1335.]. Между N- и C-долями наблюдается значительная степень гомологии: они имеют 125 одинаковых аминокислотных остатков, что составляет 37% гомологии [5].

Это привело к возникновению теории о копировании генов, когда 500 миллионов лет назад первоначальная молекула массой 40 кДа удвоилась и сформировала два гомологичных домена с молекулярной массой около 80 кДа [3]. Предполагают также, что ЛФ возник в процессе эволюции позже трансферрина.

Углеводный компонент молекулы белка состоит из остатков сиаловой кислоты, фукозы, гексозы и N-ацетилглюкозоамина, которые образуют связи с остатками аспарагина 137 и 478 белковой части ЛФ [. Legrand, D., Salmon, V., Coddeville, B., Benaissa, M., Plancke, Y., Spik, G. Structural determination of two N-linked glycans isolated from recombinant human lactoferrin expressed in BHK cells (1995) FEBS Lett., 365(1), 57-60.]. ЛФ содержит два сайта гликозилирования по одному на N2 и C2 доменах, но степень гликозилирования белка может быть различной [. Van Berkel, P.H., van Veen, H.A., Geerts, M.E., de Boer, H.A., Nuijens, J.H. Heterogeneity in utilization of N-glycosylation sites Asn624 and Asn138 in human lactoferrin: a study with glycosylation-site mutants (1996) Biochem. J., 319, 117-122.]. Именно поэтому мол. масса белка варьирует в диапазоне 76-80 кДа. Показано, что первичная структура гликозидных остатков ЛФ плазмы крови идентична углеводному компоненту ЛФ молока, за исключением двух остатков сахаров, связанных с белком N-гликозидной связью. Функция этих углеводных остатков точно не определена, однако их удаление не влияет на такие функции ЛФ, как связывание рецепторов [3]. ЛФ демонстрирует поразительную устойчивость к действию трипсина и трипсин - подобных протеаз, что обеспечивает сохранение целостности молекул белка в желудке. Было показано, что устойчивость ЛФ к деградации протеазами и при низких значениях рН обусловлена высокой степенью гликозилирования белка [3, . Van Berkel, P.H., Geerts, M.E., van Veen, H.A., Kooiman, P.M., Pieper, F.R., de Boer, H.A., Nuijens, J.H. Glycosylated and unglycosylated human lactoferrins both bind iron and show identical affinities towards human lysozyme and bacterial lipopolysaccharide, but differ in their susceptibilities towards tryptic proteolysis (1995) Biochem. J., 312, 107-114.]. Железонасыщенная форма ЛФ более устойчива к протеолизу, чем апо-форма белка [3]. ЛФ относится к щелочным белкам, значение его изоэлектрической точки составляет 8,7 [. Moguilevsky, N., Retequi, L., Masson, P. . Comprasion on human lactoferrins from milk and neutrophilic leucocytes. Relative molecular mass, isoelectric point, iron-binding properties and uptake by the liver. (1985) Biochem. J., 229, 353-359.].

1.1.2 Связывание ионов железа

Каждая молекула белка может обратимо связывать два иона трехвалентного железа или ионы цинка, меди, магния и других металлов [3]. Причем центры связывания в каждой из двух белковых глобул, входящих в молекулу ЛФ, локализованы ближе к междоменной щели. В этих центрах железо координационно связано с двумя остатками тирозина, одним гистидином и одним остатком аспарагиновой кислоты [. Shongwe, M.S., Smith, C.A., Ainscough, E.C., Baker, H.A., Brodie, A.M., Baker, E.N. Anion binding by human lactoferrin: results from crystallographic and physicochemical studies. (1992) Biochem. J., 31, 4451-4458. ]. Показано, что ЛФ участвует не только в транспорте ионов железа, цинка и меди, но и в регуляции их всасывания [. Davidson, L. A., and Lonnerdal, B. Fe-saturation and proteolysis of human lactoferrin: effect on brush-border receptor-mediated uptake of Fe and Mn. 1989 Dec;257(6 Pt 1):G930-4. ]. Наличие непрочно связанных ионов цинка и меди не влияет на железосвязывающую функцию ЛФ, а фактически даже усиливает ее. ЛФ образует с железом комплекс красноватого цвета. Одновременно с фиксацией ионов металла в железосвязывающем центре белка происходит фиксация аниона, в физиологических условиях это карбонат или бикарбонат ион, который с помощью электростатических взаимодействий связан с остатком аргинина. Присутствие аниона необходимо для прочного связывания железа с ЛФ, так как он нейтрализует положительный заряд катиона металла [3].

Сродство ЛФ к железу (Кd ~ 10^-24 M) в ~300 раз выше, чем сродство трансферрина [. Mazurier J., SpikG. Comparative study of the iron-binding properties of human transferring. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin. 1980 Biochim. Biophys. Acta, 629, 399-408.]. Кроме того, показано, что в слабокислой среде сродство ЛФ к железу повышается, что и облегчает переход металла с трансферрина на ЛФ при воспалительных процессах, когда рН тканей снижается за счет накопления молочной и других кислот [. Sousa, M., Brock, J.H., Iron in immunity. Cancer and Inflammation (1989) John Wiley & Sons.]. Степень насыщения железом нативного ЛФ в женском молоке составляет по оценкам разных авторов от 10 до 30% [13, 14].

1.1.3 Олигомерные формы лактоферрина

Как в плазме крови, так и в секреторных жидкостях ЛФ может существовать в виде различных олимерных форм от мономера, до тетрамера. Показано [14], что белок обнаруживает резко выраженную тенденцию к полимеризации in vitro и in vivo, и при высоких концентрациях преобладают олигомерные формы ЛФ. Кроме того, с помощью метода гель-хроматографии рядом авторов было обнаружено, что доминирующей формой ЛФ в физиологических условиях является тетрамер [. Bennett, R.M., Bagby, G.C., Davis, J. (1981) Calcium-dependent polymerization of lactoferrin Biochem. Biophys. Res. Commun., 101(1), 88-95., . Bagby, G.C.Jr., Bennett, R.M. Feedback regulation of granulopoiesis: polymerization of lactoferrin abrogates its ability to inhibit CSA production (1982) Blood, 60(1), 108-112., . Mantel, C., Miyazawa, K., Broxmeyer, H.E. Physical characteristics and polymerization during iron saturation of lactoferrin, a myelopoietic regulatory molecule with suppressor activity (1994) Adv. Exp. Med. Biol., 357, 121-132.]; соотношение мономер: тетрамер при концентрации белка 10^-5 М составляет 1 : 4. Авторы работ [15, 16] также предположили, что олигомерное состояние ЛФ определяется концентрацией данного белка в среде. Кроме того, по их мнению, полимеризация ЛФ строго зависела от присутствия ионов Ca²⁺. В присутствии ионов кальция и при концентрации белка менее 10^-10 - 10^-11 M авторы наблюдали преобладание мономерной формы белка. При концентрациях ЛФ более 10^-9 - 10^-10 M происходил переход в тетрамерную форму. Интересно отметить, что титр ЛФ в крови соответствует величине именно этой "переходной концентрации", и, таким образом, ЛФ в крови должен быть представлен как в виде мономера, так и тетрамера. Причем авторы не принимали во внимание существование прочих (димерных и тримерных) форм белка. Эти же исследователи обнаружили, что ряд функциональных свойств ЛФ определяется его олигомерным состоянием. Так, ЛФ в виде мономера способен к прочному связыванию с ДНК и регуляции процессов гранулопоэза, а тетрамерная форма не связывает ДНК [15, 16].

Авторами работы [. Rosenmund, A., Kuyas, C., Haeberli, A. Oxidative radioiodination damage to human lactoferrin. (1986) Biochem. J., 240, 239-245.] при определении олигомерного состояния ЛФ методом гель-хроматографии обнаружена только мономерная форма белка при нанесении на колонку 1 мг белка и около 10 % тетрамерной формы при нанесении 4 мг ЛФ. Причем тетрамер присутствовал только при анализе железонасыщенной фракции белка. Кроме того, SDS-электрофорез в восстанавливающих условиях показал, что только 30 % тетрамерной формы переходит в мономер, что, по их мнению, говорит о ковалентных межмолекулярных связях, формирующихся в процессе полимеризации. Тем не менее, природа межсубъединичных связей олигомера ЛФ до настоящего времени не выяснена, а ковалентных связей между мономерами ЛФ не обнаружено.

Следует отметить, что в рассмотренных выше (и ниже) работах для анализа олигомерного состояния ЛФ авторы использовали метод гель-хроматографии и различные сорбенты полисахаридной природы. Интересно, что ЛФ эффективно взаимодействует с такими носителями и эффективность взаимодействия различных олигимерных форм может существенно зависеть как от их олигомерного состояния, так и конформации различных форм ЛФ [19]. В следствие этого, место выхода олигомерных форм ЛФ при гель-хроматографии может не соответствовать их истинным мол. массам. Так, например, в работе [. Semenov, D.V., Kanyshkova, T.G., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Human milk lactoferrin binds ATP and dissociates into monomers. (1999) Biochem. Mol. Biol. Int., 47(2), 177-84.] было показано, что в отсутствии соли в высокой концентрации (1 М) ЛФ может "залипать" на таких носителях как Sephadex и элюироваться с колонки за времена, соответствующие высокоолигомерному состоянию. Добавление АТР к ЛФ привело к смещению пика белка при гель-хроматографии в место выхода между мономерной и димерной формами белка [19]. Было сделано предположение, что взаимодействие ЛФ с АТР приводит к диссоциации его олигомерных форм. Однако, как будет показано ниже, ЛФ связывается не только с АТР, но и различными полисахаридами, включая сорбенты, используемые при гель-хроматографии. Поэтому нельзя исключать, что обнаруженный эффект АТР может быть связан с уменьшением сродства ЛФ к полисахаридным матрицам под действием АТР, что приводит к уменьшению времени выхода ЛФ с сорбента и ошибочным заключениям об его олигомерном состоянии.

Кроме того, большинство исследователей не принимают во внимание олигомерную организацию белка, рассматривая его a priori как мономер с молекулярной массой 76 кДа. Есть все основания полагать, что в организации олигомерного состояния белка участвуют слабые нековалентные взаимодействия - преимущественно гидрофобные и электростатические контакты боковых групп остатков аминокислот молекулы ЛФ и, возможно, гликозидных остатков белка.

1.1.4 Взаимодействие лактоферрина с лигандами и его изоформы

Одним из фундаментальных свойств ЛФ является его способность связывать полианионы типа гепарина, ДНК и РНК. Показано, что взаимодействие ЛФ с гепарином и другими полианионами имеет электростатическую природу [. Van Berkel, P.H., Geerts, M.E., van Veen, H.A., Mericskay, M., de Boier, H., Nuijens, J.H. N-terminal stretch Arg2, Arg3, Arg4 and Arg5 of human lactoferrin is essential for binding to heparin, bacterial lipopolysaccharide, human lysozyme and DNA. (1997) Biochem. J., 328, 145-151)]. Ф. Фурманским и соавторами [. He, J., Furmanski, P. Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA. (1995) Nature, 373, 721-724.] было установлено, что связывание белка с ДНК может иметь специфический характер, они обнаружили три специфические последовательности ДНК, к которым белок проявляет повышенное сродство: GGCACTT(G/A)C, TAGA(A/G)GATCAAA и ACTACAGTCTACA.

Недавние исследования показали, что в случае специфических последовательностей ДНК, ЛФ обладает двумя сайтами связывания [. Kanyshkova, T.G., Semenov, D.V., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with different affinities. (1999) FEBS Lett., 451, 235-237]. Один из них является высокоаффинным (Kd = 8.0·10^-9 М), второй сайт связывает ДНК с гораздо меньшим сродством (Kd ~ 1.0·10^-3 М). Показано, что высокоаффинный сайт локализован в N-концевой части молекулы белка, аналогично полианион-связывающему сайту ЛФ и антибактериальному домену. Взаимодействие ЛФ с гепарином и тРНК ингибировало связывание ДНК с белком. Это свидетельствует о том, что ДНК-связывающий сайт совпадает или частично перекрывается с полианион-связывающим сайтом и антибактериальным доменом ЛФ [22].

В работах [19, . Babina S.E., Nevinsky G.A. Lactoferrin interacts with nucleotides. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. 23(6&7), 1043-1046, . Georgy A. Nevinsky and Svetlana E. Babina. Human lactoferrin and its polyfunctional biological functions. In “Protein Structure. Kaleidoscope of Structural Properties and Functions” (Ed. V. N. Uversky), Research Signpost, 2003, 499-530] было показано, что ЛФ взаимодействует с АТР и другими нуклеотидами. С помощью метода аффинной модификации было установлено, что АТР связывающий центр ЛФ локализован в С-концевой части белковой молекулы [19].

Ф. Фурманским и соавторами [. Furmanski, P., Li, Z.P., Fortuna, M.B., Swamy, C.V., Das, M.R. Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron-binding capacity (1989) J. Exp. Med., 170, 415-429., . Furmanski, P., Li, Z.P. Multiple forms of lactoferrin in normal and leukemic human granulocytes. (1990) Exp. Hematol. 18(8), 932-935.] было показано, что ЛФ как гранулоцитов, так и молока человека представлен тремя изоформами, которые проявляют различное сродство к сорбенту Blue Sepharose и могут быть эффективно разделены с помощью этого сорбента. Причем только одна из изоформ (ЛФ-), в отличие от двух других, способна связывать ионы железа. Все три изоформы белка проявляют сходные физические, химические и антигенные характеристики (молекулярная масса, изоэлектрическая точка, устойчивость к протеолитическому расщеплению). Однако оказалось, что две изоформы, не связывающие ионы железа (ЛФ-в и ЛФ-г), обладают РНК-гидролизующей активностью.

В ряде работ [. Kanyshkova T.G., Babina S.E., Semenov D.V., Isaeva N., Vlassov A.V., Neustroev K.N., Kul'minskaya A.A., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Multiple enzymic activities of human milk lactoferrin. Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 3353-3361., . Бабина С.Е., Канышкова Т.Г., Бунева В.Н., Невинcкий Г.А. Лактоферрин - дезоксирибонуклеаза человеческого молока. Биохимия. 2004. 69(9), 1239-1250., . Бабина С.Е., Семенов Д.И., Бунева В.Н., Невинcкий Г.А. Лактоферрин грудного молока гидролизует рибонуклеозид-5'-трифосфаты. Молекуляр. биол., 2005. 39(3), 513-520.] хроматография ЛФ на Blue Sepharose была использована для анализа возможности наличия у белка каталитически активных изоформ белка с другими каталитическими активностями. При хроматографии ЛФ на Blue Sepharose достигнуто разделение белка на несколько отдельных субфракций с разным сродством к сорбенту, в результате которого происходит отделение от основного пика белка нескольких дополнительных пиков ЛФ. Все пики белка были исследованы в реакции расщепления ряда различных субстратов и показано, что кроме гидролиза РНК различные изоформы ЛФ активны а гидролизе ДНК (ДНКазаная), АТР (АТРазная), олиго- и полисахаридов (амилолитическая), а также отщеплении 5'-концевого фосфотной группы олигонуклеотидов (5'-фосфатазная активность). Положение пиков различных активностей на профиле хроматографии в основном не совпадало, но некоторые пики ЛФ обладали несколькими ферментативными активностями. Субстратная специфичность ЛФ в гидролизе ДНК отличается от таковой для известных ДНКаз человека [28]. В отличие от основной фракции ЛФ с самым высоким сродством к Blue Sepharose, все субфракции ЛФ с ДНКазной активностью оказались цитотоксичными и подавляли рост клеток раковых линий мышей и человека.

Молекула ЛФ обладает исключительной конформационной лабильностью и может существовать в самых разных конформационных состояних. Это связано с тем, что в молекуле белка два домена соединены с помощью достаточно гибкого аминокислотного фрагмента. Это создает дополнительные возможности различного рода изменений конформации белка в отсутствии и в присутствии природных лигандов и, как следствие, самым разным изменениям его биологических свойств. Таким образом, следует полагать, что в регуляции свойств ЛФ человека может быть задействовано несколько совершенно различных механизмов, которые включают: а) аллостерическое изменение конформации белка под действием ионов железа и других металлов, а также нуклеиновых кислот, белков, нуклеотидов или полисахаридов, б) изменение олигомерного состояния белка под действием указанных природных лигандов, в) существование мономеров белка в виде большого числа различных изобелковых форм, а также образования олигомерных форм белка, состоящих из различных субъединиц, соответствующих этим формам.

Таким образом, очевидно, что несмотря на более, чем 50-летнюю историю исследования механизмов функционирования ЛФ, изучение этого белка представляется исключительно актуальным и в настоящее время. Современные достижения в области развития новых физико-химических методов исследования белков представляются исключительно перспективными для анализа закономерностей возможности олигомеризации ЛФ под действием различных лигандов.

2. Экспериментальная часть

2.1 Теоретические основы использованных методов и аппаратурное обеспечение