Амфифильные полимеры N-винилпирролидона

Расчетное количество натрия или метилата натрия растворяли в абсолютированном этиловом спирте. Полученный раствор этилата натрия добавляли по каплям с постоянной скоростью в течение 2 часов к перемешиваемой смеси ПВП и хлорацетамида при температуре 283 К (10С). Для проведения реакции эпоксидирования использовалось мольное соотношение полимер: хлорацетамид:натрий 1:0,75:1 соответственно. После добавления этилата натрия температура самопроизвольно поднималась на 2-3°С. При этой температуре смесь перемешивали в течение пяти часов. По истечении заданного времени выпавший осадок отфильтровывали и экстрагировали на приборе Сокслета серным эфиром в течение 3 дней. Фильтрат концентрировали на роторном испарителе. Далее продукт реакции был растворён в сухом ДМСО и раствор полимера трижды отфильтровывали от хлорида натрия на фильтре Шотта. Фильтрат высадили в ацетон и сушили в вакуумном шкафу до постоянного веса.

Полимер, полученный после концентрирования на роторном испарителе, очищали точно таким же образом [64]. Выход составляет 65% от загрузочной массы.

Полученный полимер представлял собой белый порошок, хорошо растворимый в воде, плохо в диметилформамиде, диметилсульфоксиде, уксусной кислоте; нерастворимый в спирте, эфире, гептане и других обычных органических растворителях.

2.2.5 Модификация эпоксидированного поливинилпирролидона (ЭПВП) аминокислотами

В колбу, снабженной мешалкой загружали 10 г. ЭПВП, содержащего 10% эпоксидных групп (0, 086 моль), 20-ти кратный избыток аминокислоты (глицин - 13,0 г; -аланин - 15,5 г; -аминомасляная кислота - 17,9 г;) и 167 мл дистиллированной воды. После растворения реагентов при перемешивании в колбу добавляли водный раствор едкого натра в количестве 7,1 г (0,18 моль) в 16,7 мл дистиллированной воды. Реакция протекает в течение 4 часов при комнатной температуре (298К). Реакционную смесь оставляли на ночь и затем проводили нейтрализацию 0,5 н раствором HCl до pH=7. После нейтрализации раствор очищали диализом в течение 5-7 дней и сушили лиофильно. Выход 7 г (70%).

Состав продукта определяли функциональным анализом по вторичной аминогруппе и карбоксильной группе аминокислотного остатка.

2.2.6 Определение количества эпоксидных групп методом потенциометрического титрования

Метод основан на способности эпоксидной группы полимера присоединять хлористый водород с образованием хлоргидрида. По разности между количеством введенной и непрореагировавшей кислоты, определяемой титрованием щелочью, рассчитывали содержание эпоксидных групп. Для этого навеску полимера 0,1 г вносили в бюкс и добавляли 10 мл 0,1 н раствора HСl в воде. Одновременно ставили холостой опыт. Спустя 3 часа оттитровали пробу 0,1 н раствором гидроксида калия. Расчет количества эпоксидных групп проводили по формуле:

где М₁ и М₂ - молекулярные веса мономеров;

X - количество эпоксидных групп, мол.%;

g - навеска полимера, г;

Т - титр раствора щелочи (КОН);

V_о, V - объем щелочи, пошедший на титрование холостого опыта и пробы, соответственно, мл.

2.2.7 Анализ полимера, содержащего аминокислотные группы

Определение содержания аминогрупп

Содержание аминогрупп определяли методом прямого потенциометрического титрования. Навеску полимера 0,1 г растворяли в 10 мл дистиллированной воды и титровали 0,01 н раствором HCl в дистиллированной воде.

Расчет количества аминогрупп проводили по формуле:

где 111 - молекулярная масса винилпирролидоного звена;

90 - процентное содержание ВП в цепи;

М₁ - молекулярная масса эпоксидированного винилпирролидоного звена (или звено аллилглицидилового эфира);

М₂ - молекулярная масса аминокислоты;

М₃ - молекулярная масса гидролизованного эпоксидированного винилпирролидонового звена (или гидролизованного звена аллилглицидилового эфира);

g - масса полимера, взятого для титрования;

V_HCl - объем соляной кислоты, пошедшей на титрование;

N_HCl - нормальность соляной кислоты, пошедшей на титрование;

X - процентное содержание вторичных аминных групп.

Определение содержания карбоксильных групп.

Навеску полимера 0,1 г растворяли в 10 мл дистиллированной воды и титровали потенциометрически 0,01 н раствором NaOH в дистиллированной воде. Расчет карбоксильных групп проводили по следующей формуле:

где V_NaOH - объем едкого натра, пошедшего на титрование;

N_NaOH - нормальность едкого натра, пошедшего на титрование;

X - процентное содержание карбоксильных групп.

2.3 Биологические исследования

2.3.1 Определение биологического действия амфифильных полимеров N-винилпирролидона, содержащего аминокислотные остатки

Опыты проведены на 48 белых крысах-самцах весом 100-140 грамм. Острое отравление тетрахлорметаном воспроизводили путем ежедневного подкожного введения 1 мл/кг ССL₄ растворенного в равном объеме оливкового масла в течение шести дней. Животных опытных и контрольной группы эфтаназировали попарно, одновременно, под гексеналовым наркозом, на 10-й день лечения. Лечение проводили в дозе 5 мл/кг в течение пяти дней (примерно такая доза вводится больным в клинике).

3. Обсуждение результатов

3.1 Получение и свойства амфифильных полимеров N-винилпирролидона

3.1.1 Синтез и свойства полимеров N-винилпирролидона, содержащих одну концевую карбоксильную группу

В качестве метода синтеза амфифильных производных поли-N-винилпирролидона, содержащих концевые гидрофобные группы, в данной работе использован двухстадийный подход, когда на первой стадии проводилась радикальная полимеризация соответствующих мономеров в присутствии инициаторов, генерирующих первичные радикалы, и передатчиков радикалов, генерирующих под действием этих первичных радикалов новые радикалы, инициирующие рост цепи. В качестве таких передатчиков - инициаторов в данной работе была использована меркаптоуксусная кислота, содержащая помимо меркаптогруппы дополнительную функциональную группу, что позволяет ввести в полимер одну концевую карбоксильную группу. Применение в качестве регулятора роста цепи при радикальной полимеризации мономера меркаптоуксусной кислоты было обусловлено её наибольшей эффективностью и возможностью воспроизводимо получать с высоким выходом и контролируемым значением молекулярной массы полимеры, содержащие одну концевую карбоксильную группу на макромолекулу полимера. Кроме того, реакция модификации карбоксильных групп полимера гораздо проще, менее трудоемка и обеспечивает большие выходы амфифильных производных ПВП, чем модификация полимеров с концевой аминогруппой [65].

Основные реакции, протекающие в этой системе при достаточном количестве меркаптана, могут быть представлены следующей схемой:

А. Образование инициирующего радикала:

I [2R₁^?]; [2R₁^?] R₁^? + R₁^?; (1)

[2R₁^?] R₁-R₁; (2)

R₁^? + H-S R₁-H + S^?; (3)

Б. Инициирование:

S^? + M S-M^?; (4)

R₁^? + M R₁-M^?; (5)

В. Рост цепи:

R₁^?-M + M_n R₁-M_n+1^? (6)

S-M^? + M_n S - M_n+1^? (7)

Г. Обрыв цепи:

S-M_n+1^? + H-S S-M_n+1-H + S^? (8)

S-M_n+1^? + ^?M_n+1-S S-M_n+1-M_n+1-S (9)

S-M_n+1^? + S^? S-M_n+1-S (10)

S-M_n+1^? + R₁^? S-M_n+1-R₁ (11)

где: I - инициатор; М - мономер; R₁^? - первичные радикалы, образующиеся при распаде инициатора; S^? - радикал, образовавшийся из меркаптана, S-M^?, R₁-M^?, R₁-M_n+1^?, S-M_n+1^? - растущие полимерные радикалы; S-M_n+1-H, S-M_n+1-M_n+1-S, S-M_n+1-S, S-M_n+1-R₁ и S-M_n+1-H - инертные молекулы; H-S - молекула регулятора.

При достаточном количестве меркаптана инициирование роста цепи может реализоваться не за счет первичного радикала, образующегося при распаде инициатора, а за счет радикала S^?, образующегося при отрыве протона от меркаптана, т.е. при преобладании реакции S^? + M S-M^? над реакцией R₁^? + M R₁-M^?.

Как известно, скорость взаимодействия первичных радикалов с меркаптанами на несколько порядков превышает скорость инициирования [23]. Поэтому можно предположить, что первичный радикал R₁^? расходуется предпочтительно в реакции R₁^? + H-S R₁-H + S^?. Таким образом, в этих условиях инициирование роста цепи реализуется главным образом за счет радикала S^? с началом цепи именно с этой группы.

В упрощенном виде инициирование полимерной реакции динитрилом азобисизомасляной кислоты (ДАКом) может быть представлено следующим образом:

где М - молекула или звено мономера;

R' = - CH₂COOH.

Как видно из рисунков 4 и 5, с увеличением количества введенного в реакцию меркаптана молекулярная масса и выход полимера снижались, что, очевидно, связано с возрастанием скорости обрыва цепи [65].

При этом полученные полимеры содержали одну концевую функциональную группу, что было подтверждено соответствием молекулярных масс полимеров, определенных по содержанию в них концевых групп, и альтернативно, методом паровой осмометрии (табл. 1).

Таблица 1. Синтезированные семителехелевые полимеры N-винилпирролидона с концевыми карбоксильными группами

МУК - отношение количества моль меркаптоуксусной кислоты к числу моль мономера.

М_n* - среднечисленная молекулярная масса полимера, определенная по концевым группам.

М_n** - среднечисленная молекулярная масса полимера, определенная методом паровой осмометрии.

N - число звеньев в цепи полимера.

Рис. 4. Зависимость молекулярной массы поли-N-винилпирролидона от количества введенной меркаптоуксусной кислоты

МУК - количество введенной меркаптоуксусной кислоты на один моль мономера.

Рис. 5. Зависимость выхода реакции радикальной полимеризации винилпирролидона от количества введенной в реакцию меркаптоуксусной кислоты

МУК - количество введенной меркаптоуксусной кислоты на один моль мономера.

Таким образом, на этой стадии образовывались семителехелевые полимеры, имеющие молекулярные массы соответствующие требуемым для создания на их основе носителей лекарственных препаратов.

3.1.2 Синтез и свойства амфифильных полимеров N-винилпирролидона, содержащих концевые алкильные группы

На второй стадии в полученные семителехелевые полимеры, содержащие одну концевую реакционно-способную группу, вводили длинноцепную алкильную группу, проводя реакцию с алифатическим амином. Модификацию проводили обработкой карбоксилсодержащих полимеров, карбоксильная группа которых была активирована N, N'-дициклогексилкарбодиимидом (ДЦГК), н-октиламином. Роль ДЦГК заключается в превращении карбоксильной группы в активированную сложноэфирную (1), способную легко взаимодействовать со свободной аминогруппой алифатического амина, с образованием амидной связи и выделением в качестве побочного продукта N, N'-дициклогексилмочевины (ДЦГМ) (2).

Амины реагируют с карбоновыми кислотами с образованием амидов в присутствии ДЦГК в мягких условиях и с хорошими выходами, при малом времени реакции и низкой степени рацемизации, что важно для оптически активных карбоновых кислот.

В результате был получен ряд водорастворимых амфифильных полимеров, с одной концевой октильной гидрофобной группой при различной молекулярной массе полимерного фрагмента. Выход полимеров и загрузки веществ приведены экспериментальной части.

Определение степени замещения реагирующих концевых групп проведено методом потенциометрического титрования в тех же условиях, что и при определении этих групп при нахождении молекулярной массы полимеров. При этом во всех образцах полимеров концевые группы обнаружены не были, что позволяет предположить, что степень их замещения близка к полной.

Синтезированные семителехелевые и амфифильные полимеры были исследованы методом ИК-спектроскопии. При этом была установлена разница между ИК-спектрами полимеров без концевой гидрофобной группы (семителехелевых полимеров) и амфифильных полимеров, содержащих концевой алифатический гидрофобный фрагмент. На ИК-спектрах полимеров (таблетки в КВr) в области поглощения карбонильной группы наблюдалось кроме основного поглощения соответствующего карбонилу полностью замещенного амида пирролидонового кольца (~1650 см^-1) дополнительное поглощение соответствующее монозамещенному амиду концевой группы (~1680 см^-1). При этом интенсивность этого поглощения повышается с уменьшением молекулярной массы полимера. Кроме того, на ИК-спектрах этих полимеров наблюдалось увеличение интенсивности поглощения метиленовых групп из-за введения концевых длинноцепных алкильных радикалов.

3.1.3 Синтез полимеров N-винилпирролидона, содержащих боковые эпоксидные группы

Для обеспечения возможности связывания с полимером в качестве комплексообразующих групп остатков аминокислот был использован разработанный ранее метод введения в часть звеньев поли-N-винилпирролидона эпоксидных групп.

Получение эпоксидсодержащих поливинилпирролидонов проводилось модификацией готового поливинилпирролидона по реакции Дарзана.

В случае проведения реакции Дарзана активную эпоксидную группу вводили в полимер путем обработки его хлорацетамидом в присутствии щелочных металлов в спиртовой среде.

3.1.4 Синтез полимеров N-винилпирролидона, содержащих аминокислотные остатки

Известно, что соединения, содержащие эпоксидную группу, взаимодействуют с веществами, имеющими активный водород, в том числе с аминами, с раскрытием эпоксидного цикла. Для раскрытия эпоксидного кольца часто применяют катализаторы как кислого так и основного характера. Так как аминокислоты являются амфотерными соединениями, то для получения продуктов, связанных с аминной группой применяют щелочные соли или реакцию проводят в щелочной среде (pH 7). Это объясняется тем, что при pH 7 разрушается цвиттер-ионный характер аминокислот и их аминогруппа приобретает основные свойства:

По правилу Красуского К.А., аминогруппа направляется преимущественно к более гидрогенизированному атому углерода оксиранового цикла.

Следовательно реакция получения полимера содержащие остатки аминокислоты -аланина может быть представлена следующим образом:

С целью синтеза модифицированных полимеров применена методика, по которой ЭПВП (содержание эпоксидных групп 10%) и соответствующую аминокислоту (соотношение 1: 20) растворяли в дистиллированной воде и при перемешивании вводили водный раствор гидроксида натрия. Реакцию проводили в течение 4 часов при комнатной температуре.

При взаимодействии эпоксидсодержащих полимеров с аминами в водной среде имеет место ускорение реакции и увеличение степени превращения за счет каталитического действия образующейся вторичной спиртовой группы, обладающей высокой нуклеофильностью.

Реакцию проводили при двадцатикратном избытке аминокислоты, так как при увеличении количества аминокислоты по отношению к эпоксидной группе увеличивается степень превращения. Конечные продукты очищали диализом и лиофильно сушили. Полученные продукты идентифицировали по данным функционального анализа.

Таким образом, в результате проведенных реакций образуются полимеры ЭПВП с аминокислотными остатками в боковой цепи. В модифицированных полимерах аминокислоты связаны с эпоксидными звеньями исходного полимера по аминным группам. Причем присоединение к оксирановому циклу идет по углероду, находящемуся в азотсодержащем цикле.

Полного замещения эпоксидных групп на аминокислотные остатки не происходит. При этом функциональный анализ на эпоксидную группу показывает, что в модифицированных полимерах отсутствуют реакционноспособные эпоксидные группы. Определенный процент приходится на гидроксильные группы оксиранового цикла, так как эпоксидные соединения при pH 7 вступают в реакцию с водой по следующей схеме:

В условиях проведения полимераналогичного превращения вода конкурирует с аминной группой аминокислоты в реакции с оксирановым циклом полимера. Так как вода обладает менее основными свойствами по сравнению с аминной группой, то эпоксидная группа преимущественно взаимодействует с аминной группой аминокислоты и незначительно с водой.