Биокерамика на основе фосфатов кальция

Таким образом, результаты выполненного исследования указывают на необходимость правильного выбора метода синтеза порошков КГА для изготовления керамики, поскольку спекание ГА происходит при температурах 1100-1300⁰С. Однако для снижения температуры спекания могут быть использованы известные приемы активирования спекания, например посредством введения специальных добавок, формирующих жидкую фазу при более низких температурах, чем указанные.

В работе [165] изучали спекание КГА-керамики из порошков, полученных твердо-жидкофазным взаимодействием оксида кальция, двузамещенного фосфата аммония и карбоната аммония в присутствие воды (образец 7, табл. 11). Порошки имели удельную поверхность 4,74 м²/г, размер частиц от 0,5 до 2 мкм, содержание карбонат-групп 1,560,2 масс.% (по данным химического анализа), параметры решетки а = 9,410 Е и с = 6,884 Е. Согласно данным ИК спектроскопии, КГА был АБ-типа замещения.

Составы активирующих спекание добавок выбирали, исходя из принципа нетоксичности компонентов для организма. Характеристики добавок приведены в табл. 12.

Образцы готовили прессованием смесей под давлением 100 МПа по относительной плотности 55% с последующим спеканием на воздухе при температуре 1000⁰С. Определяли открытую пористость и объемную усадку образцов. Для сравнения спекали образцы КГА без добавки. Результаты представлены на рис. 34 а и б. Как можно видеть, введение ортофосфата натрия в количестве 5 масс.% позволят снизить пористость керамики с 49 до 35%, однако при этом образуется промежуточная фаза ?-NaCaPO₄, согласно данным рентгеновского фазового анализа. Средний размер пор в керамике равен 0,54 мкм. Таким образом, добавки Na₃PO₄, эффективные при спекании ГА керамики при температурах 1150-1200⁰С, мало эффективны для активирования спекания КГА при более низких температурах. К положительному результату не привело также использование добавки CaCl₂ с температурой плавления 772⁰С, возможно из-за ее активного взаимодействия с КГА, сопровождающегося интенсивным выделением СО₂. Тем не менее, удалось подобрать состав добавки в системе карбонатных солей, введение которой позволило получит КГА-керамику с пористостью менее 1% при температуре спекания 800⁰С. Использование метода активированного добавками спекания с участием жидкой фазы, по-видимому, является более эффективным технологическим приемом по сравнению со спеканием в атмосфере увлажненного СО₂, предложенным в работе [117].

4. Материалы на основе фосфатов кальция

4.1 Гранулы

Гранулирование - это совокупность физико-химических и физико-механических процессов, обеспечивающих формирование частиц заданных размеров, формы, структуры и физических свойств.

Для гранулирования порошков, в том числе и апатитов, в отечественной и зарубежной практике применяют различные методы и аппаратуру. Процессы гранулирования можно классифицировать следующим образом [197]:

· из жидкой фазы диспергированием на капли с последующей кристаллизацией при обезвоживании или охлаждении;

· из твердой фазы прессованием с последующим дроблением брикетов до гранул требуемого размера;

· из смеси жидкой и твердой фаз агломерацией порошков с последующим окатыванием агломератов и упрочнением связи между частицами при удалении жидкой фазы;

· из газообразной фазы конденсацией (десублимацией) с образованием твердых гранул;

· из смеси жидкой и газообразной фаз с осуществлением химической реакции;

· из смеси жидкой, твердой и газообразной фаз с осуществлением химической реакции.

Эффективность процесса гранулирования зависит от механизма гранулообразования, который, в свою очередь, определяется способом гранулирования и его аппаратурным оформлением.

Гранулы на основе ГА изготовляют в основном путем дробления блоков с последующей обкаткой, распылительной сушкой, закалкой в жидкость, гидротермальным синтезом с получением нерегулярной или близкой к сферической геометрии [5,198].

Гидроксиапатитовые гранулы в ряде стран выпускаются в настоящее время в промышленном масштабе. В качестве примера можно привести гранулы марок Interpore^® 200 (425-1000 мкм), Pro Osteon^® (1-9 мм), Osteogen^® (300-1000 мкм), Tecknomed^® (3-5 мм) [198].

в работе [44] разработана и внедрена технология пористых гранул из ГА на основе связующих - коллагена и крахмала. В зависимости от размеров гранул и содержания связующей варьировали размер и распределение пор. Так, при размерах гранул от 0,2 до 2 мм и пористости 60-67% средний радиус пор составлял примерно 50 и 75 мкм соответственно. Изучено влияние технологических параметров (концентрация коллагена, крахмала в жидкой среде, соотношение компонентов, наклон и скорость вращения тарелки гранулятора) на параметры получаемых гранул. Эта технология позволяет получать гранулы размером от 20 мкм до 5-7 мм с пористостью 55 - 70 об. % и размером пор 0,1-50 мкм.

В работе [199] гранулы диаметром от 200 до 500 мкм получали путем изостатического прессования порошка ГА при давлении от 100 до 200 МПа с последующим дроблением блоков. Недостатком способа является нерегулярная геометрия гранул.

наибольший интерес представляет метод диспергирования жидкости в свободный объем, который позволяет получать гранулы сферической формы, что предпочтительней как для предотвращения воспалительной реакции организма, так и для процесса остеоинтеграции. Гранулирование этим методом заключается в разбрызгивании жидкости, например безводного плава гранулируемого вещества, на капли, приближенно однородные по размеру, и в последующей их кристаллизации при охлаждении в нейтральной среде. В качестве нейтральной среды используют воду, масло, жидкий азот и т.д. В частности, предложенный в работе [198] метод основан на использовании смесей суспензии ГА в растворе связующего (хитозана) и жидкого парафина. Полученную суспензию диспергируют в жидкий парафин и перемешивают лопастной мешалкой со скоростью 500 об/мин, что приводит к образованию гранул сферической формы. В качестве отвердителя использовали глютаральдегид. Однако способ не лишен недостатков, связанных с использованием расплавленного парафина. Известен способ изготовления гранул ГА, основанный на сферическом гелеобразовании. С помощью шприца суспензию ГА и полисахарида (альгината Na или карбоксиметилцеллюлозы) вводят в водный раствор хлористого кальция, который является отвердителем, и затем подвергают интенсивному перемешиванию. Размер гранул зависит от диаметра отверстия иглы и скорости перемешивания [200].

Нами была разработана технология изготовления пористых сферических частиц-гранул на основе ГА, ФГА, КГА, ТКФ и ТКФ-ГА [201-205]. Размер гранул можно варьировать в пределах от 50 до более чем 2000 мкм. Технология - суспензионная, основана на принципе несмешивающихся жидкостей. дисперсный порошок апатита или другого фосфата кальция смешивают с биополимером в определенной концентрации с получением суспензии, которую затем подвергают интенсивному перемешиванию в несмешивающейся жидкости - дисперсионной среде. В качестве такой жидкости может быть использовано растительное масло. На рис. 35 показано, в качестве примера, распределение гранул по их среднему размеру при температурах дисперсионной жидкости 15 и 30 ⁰С, соответственно. Например, средние значения размера гранул составляют 1735 и 1483 мкм при температуре 15 ⁰С и скоростях вращения 200 и 500 мин^-1, соответственно. Повышение температуры до 30 ⁰С снижает эти значения до 1187 и 670 мкм, соответственно, вследствие уменьшения вязкости жидкости. Таким образом, технология позволяет легко варьировать размеры гранул в широких пределах. Большое влияние на размер гранул оказывает удельная поверхность исходного порошка. С увеличением удельной поверхности порошка ГА размер гранул уменьшается. При этом добавки, например ФА до 10 масс. % в ГА, не влияют на процесс гранулообразования. Термическая обработка отвержденных гранул приводит к выжиганию биополимера, формированию системы открытых взаимосвязанных пор и к усадке гранул. Пористость около 70 об.% достигается при малых соотношениях ГА/биополимер и при низких температурах термообработки (около 1100⁰С). Доминирующая популяция относится к порам размером 0,1-5 мкм, относительное их содержание в общем, количестве открытых пор составляет до 60%. На рис. 36 приведены микрофотографии гранул ГА и их микроструктура, полученных по данной технологии. Однако при изготовлении гранул б-ТКФ наблюдается значительной разница в микроструктуре образцов керамики спеченной при 1100 и 1300⁰С, что показано на рис. 37. Установлено, что с повышением температуры спекания резко снижается пористость образцов до 40 %, а также наблюдается значительный рост частиц порошка. Кроме того, получаемые гранулы б-ТКФ не имеют сферической формы (Рис. 38).

Деструкция материалов на основе ГА внеклеточными жидкостями организма является одним из ключевых вопросов при разработке материалов как для локализованной доставки лекарственных препаратов в организм, так и для костной имплантации. Нами выполнено сравнительное исследование растворения гранул ГА, б-ТКФ и композиционных бифазных материалов в изотоническом 0,1М растворе хлорида натрия в течение до 28 дней. Исходные материалы: пористые гранулы с удельной поверхностью приблизительно 0,5 м²/г, средним размером 100-300 мкм и содержанием пор размером 0,1-10 мкм примерно 60 об.%. Результаты представлены на рис. 39. На начальной стадии зависимости хорошо аппроксимируются логарифмической функцией:

c=Alnt, (51)

где А некоторая постоянная.

Гранулы имеют высокую начальную скорость растворения в течение первых 5 дней, а затем процесс растворения замедляется, переходит в экспоненциальный, а затем в стационарный режим ввиду достижения состояния насыщенного раствора. Наиболее растворимыми являются гранулы из б-ТКФ, наименее - гранулы из ГА. С повышением содержания ТКФ в композиционных гранулах ГА-ТКФ скорость их растворения возрастает. Установлено, что не происходит образования новых кристаллических фаз при выдержке образцов в растворе (Рис. 40). Уменьшение интегральной величины пиков ТКФ и ГА свидетельствует о растворении обеих составляющих композита, однако растворение ТКФ в гранулах происходит в большей степени, чем ГА. Предполагается [206], что ТКФ первоначально подвергается гидролизу с образованием ГА. ГА, взаимодействуя с водой, конгруэнтно растворяется по реакции:

Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ (тв) 10Са²⁺ (ж) + 6РО₄^3- (ж) + 2ОН^- (ж)(52)

В растворе ионы Са²⁺, группы РО₄^3- и ОН^- могут взаимодействовать между собой. В нейтральной и кислой средах взаимодействие фосфат-ионов с протонами приводит к образованию НРО₄^2-

6РО₄^3- (ж) + Н⁺ (ж) 6НРО₄^2- (ж)(53)

Эти группы могут взаимодействовать с частью ионов кальция, продукт взаимодействия осаждается в форме менее растворимого СаНРО₄:

6НРО₄^2- (ж) + 6Са²⁺ (ж) 6СаНРО₄ (тв)(54)

Кроме того, группы ОН^- могут взаимодействовать с оставшейся частью ионов кальция с образованием малорастворимого гидроксида:

4Са²⁺ (ж) + 8ОН^- (ж) 4Са(ОН)₂ (тв) (55)

Продукты реакций осаждаются на поверхности ГА в растворе. Группы НРО₄^2- на поверхности керамики обусловливают прогрессивно снижающееся значение отношения Са/Р. Таким образом, с увеличением времени выдержки состояние поверхности смещается от нейтрального в сторону кислотного (с дефицитом по кальцию) состояния.

Такое поведение по типу растворение-осаждение может, по-видимому, иметь место в условиях in vivo при имплантации керамики на основе ГА и, в частности, определять биоактивные качества керамики.

В медицинской практике керамические гранулы находят применение в следующих областях: реконструктивно-восстановительная хирургия, стоматологии и в системе доставки лекарственных препаратов [207-213].

В реконструктивно-восстановительной хирургии гранулы используются при лечении пародонта (локальный и генерализованный пародонтит средней и тяжелой степени, идиопатическая патология пародонта при инсулиннезависимом сахарном диабете), околокорневых, фолликулярных и резидуальных кист челюстей и т.д. Например, в клинике челюстно-лицевой хирургии и стоматологии Военно-медицинской академии при проведении операции цистэктомии с удалением кист челюстей и заполнением послеоперационной костной полости отдают предпочтение гранулированному ГА. Гранулы также используют в сочетании с кальций фосфатными цементами для достижения высокой прочности имплантата.

Нами совместно с МНИОИ им П.А. Герцена и университетом Упсалы (Швеция) были проведены испытания пористых керамических гранул на основе ГА и ФГА in vitro и in vivo. В работе [204] исследовали адсорбцию 24 протеинов плазмы крови на поверхности ГА и ФГА пористых гранул. Результаты приведены в таблице 13. Установлено, что замещение ОН^--групп фтором в количестве до 10% не оказывает отрицательного влияния на абсорбцию протеинов плазмы крови. Вероятно, большее влияние на адсорбцию оказывает морфология поверхности, нежели введение фтора. Данное мнение соответствует результатам известных исследований, продемонстрировавших отсутствие отрицательного эффекта фтора на процесс остеоинтеграции [109]. С другой стороны, введение фтора может дать положительный результат вследствие его влияния на движущую силу осаждения апатита из раствора при реминерализации костной ткани.

В экспериментах in vitro свойства керамических гранул изучали на модели фибробластов человека (ФЧ). ФЧ пассировали в культуральных флаконах в полной ростовой среде (ПРС) состава: среда RPMI-1640 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, РАМН), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко), 10 мкг/мл гентамицына. Культивирование проводили в атмосфере увлажненного воздуха, содержащего 5% СО₂, при температуре 37⁰ С. В экспериментах использовали ФЧ в поздней логарифмической фазе роста (конфлюэнтный монослой, 96 часов культивирования). Для получения суспензии одиночных клеток монослой ФЧ обрабатывали 0,25% раствором трипсина и раствором для диссоциации клеток (Sigma). Суспензию отмывали центрифугированием в большом объеме ПРС и производили оценку жизнеспособности клеток, окрашивая суспензию 0,04%-ным раствором трипанового синего. Оценивали адгезивные свойства, острую цитотоксичность и динамику численной популяции фибробластов (стандартный МТТ-тест).

Для исследования биосовместимости образцов в экспериментах in vivo использовали модель подкожной имплантации. Мышам-самкам линии ВDF1 весом 18-20 г под гексеналовым наркозом (100 мг/кг массы животного) делали кожный надрез в области грудного отдела позвоночника (паравертебрально). При помощи автоматического дозатора имплантировали предварительно отмытый образец. Вес и объем материала был одинаковым для всех животных и составлял 120 мг в 300 мкл физиологического раствора. На 7-е, 10-е, 17-е 24-е и 31-е сутки эксперимента образцы керамики извлекали, один из них использовали для оценки плотности клеточной популяции аутологичных фибробластов на керамике с помощью адаптированного для этих целей МТТ-метода, второй - для визуальной оценки образцов.

Показано, что гранулы не вызывают острой цитотоксичности, и имеют адгезивную способностью, зависящую от добавок фтора, что выражается в различной скорости увеличения популяции ФЧ. Наилучшими по этому признаку оказались образцы гранул ГА, позволяющие наращивать в 2,5 раза больше клеток in vitro за равный отрезок времени по сравнению с контролем (культуральные лунки без гранул). На рис. 41 показано изменение оптической плотности раствора формазана при совместном культивировании ФЧ и гранул ГА с разной плотностью посева. Можно отметить трехкратное увеличение плотности популяции на 11-й день культивирования. Введение в ГА фторид-ионов в количестве 2 и 10 масс. % взамен групп ОН^- не улучшает свойства материалов как матриц для наращивания клеток. Однако ионы фтора, как известно, повышают устойчивость апатитовой керамики к резорбции внеклеточными жидкостями, что может быть полезным для ряда применений. Можно полагать, что керамические гранулы, обладая существенно более высокой площадью поверхности для клеточной экспансии по сравнению с контролем, изменяют исходную плотность посева на единицу потенциальной ростовой поверхности.

В экспериментах in vivo вокруг гранул уже к 10 суткам формируется капсула из соединительной ткани, толщина которой увеличивается со временем в течение эксперимента. На 10-е сутки после имплантации на поверхности капсулы отмечены многочисленные кровеносные сосуды, причем процесс неоангиогенеза не ограничивается только капсулой - на 24 и 38 день опыта кровеносные сосуды и капиллярная сеть видны и на многочисленных гранулах ГА внутри капсулы (рис. 42). В эти же дни отмечается активное прорастание соединительной тканью промежутков между гранулами внутри капсулы и заполнение фибробластами мыши пустот внутри некоторых гранул керамики.

На основе полученных результатов было проведено исследование гранул ГА в качестве матрикса для мезенхимальных стволовых клеток (МСК) на модели дефекта теменной кости крысы в экспериментах in vivo (МНИОИ им П.А. Герцена).

Работа выполнена на 10 крысах - самках линии Вистар весом 180-200 г. Все операции осуществляли под наркозом: на первом этапе - седация животного при помощи 0,5 мл дроперидола внутрибрюшинно, затем -0,3 мл кетамина внутримышечно. Ход операции по созданию дефекта теменной кости крысы был следующим: в лобно-теменной области животного производили кожный разрез скальпа, затем мобилизовали апоневроз, оголяя теменную кость. Посредством бора осторожно формировали дефект кости до твердой мозговой оболочки размерами 4 мм по длине, 2-3 мм по ширине, глубиной 1-2 мм. После операции область дефекта сверху укрывали апоневрозом и наглухо зашивали кожу скальпа.

Всего было сформировано три группы животных: I - костный дефект (контроль I); II- полость костного дефекта заполняли гранулами ГА (контроль II); III- полость костного дефекта заполняли МСК, предкультивированными на гранулах ГА (опыт). Рентгенологический и гистологический контроли осуществляли в день операции и далее через 3 месяца.

Первичная культура клеток из КМ крысы была полиморфной. Однако уже через неделю в культуре обнаруживались многочисленные фибробластоподобные клетки, которые далее формировали колонии и через 17-21 дней образовывали предконфлюэнтный монослой. Культура МСК крысы первого пассажа в основном была представлена клетками веретеновидной формы (80-90%), реже встречались округлые и кубоидальные клетки. После культивирования МСК крысы на гранулах ГА отмечалась их высокая жизнеспособность.

Показано, что в I контрольной группе животных (дефект теменной кости) через 3 месяца после операции наблюдали спонтанное неравномерное закрытие дефекта (рис. 43а). На гистологических срезах при этом отмечено формирование плотной надкостницы с грубыми рубцовыми изменениями в области трепанации.

Во II группе контрольных животных (дефект теменной кости, заполненный гранулами ГА) на рентгеновских снимках (рис. 43б) обнаружено закрытие дефекта на всем протяжении оперативного вмешательства с формированием надкостницы с интимно прилегающими к ней гранулами ГА. Морфологический анализ выявил формирование плотной фиброзной капсулы вокруг гранул ГА.

Наиболее интегрированные и упорядоченные структуры в области закрытия дефекта обнаружены в III группе животных (дефект теменной кости, заполненный гранулами ГА, насыщенными МСК) (рис. 43в). На гистологических препаратах отмечено равномерное закрытие дефекта на всем его протяжении, гранулы ГА были окружены плотной фиброзной капсулой, зрелая упорядоченная соединительная ткань заполняла промежутки между гранулами, прорастая ряд из них. На краях дефекта и под надкостницей наблюдали очаги остео- и хондросинтеза.

Таким образом, результаты испытания in vitro и in vivo свидетельствуют о принципиальной возможности использования гранул в качестве матриксов для аллогенных и аутологичных клеточных культур с целью замещения обширных тканевых дефектов.

Одно из важных применений гранул на основе ГА, и пористой керамики - система доставки лекарственных препаратов. Из литературных источников известно, что подход для решения этой проблемы с использованием керамики является относительно новым, несмотря на то, что первые исследования по системам локальной доставки лекарств начаты еще в 1930 году, а использование керамики как основы для таких систем доставки лекарств - только 1980 годах. Результаты первых клинических испытаний были опубликованы в 1997 году [210].

Главным направлением исследования системы доставки лекарственных препаратов является решение проблемы поддержания постоянной концентрации препарата в крови реципиента в течение заданного времени (пролонгированная фармокинетика). Это обусловлено тем, что периодичность перорального приема или паренторального введения лекарственных препаратов может вызвать превышение допустимой дозы вследствие кумулятивного накопления препарата и, как следствие, общую токсикацию (рис. 44).

Преимущества и недостатки использования керамики в системе доставки лекарственных препаратов следующие: преимущества - точечная, локальная терапия; постоянная скорость выделения препарата; минимум побочных эффектов; высокая эффективность; недостатки - высокая стоимость; иногда потребность в хирургическом вмешательстве.

Использование ГА керамики в качестве системы доставки дает возможность управляемого, локализированного выделения препарата, причем продолжительность выделения может достигать одного года. В [198] показана возможность увеличения продолжительности выделения в 2-3 раза лекарственного препарата посредством покрытия ГА гранул полилактидами. Время выделения контролировалось пористостью гранул и толщиной покрытия.

Системы доставки препаратов с применением керамики можно классифицировать следующим образом: гомогенные и гетерогенные. Гомогенные системы подразумевают использование отпрессованной смеси порошка лекарства и порошка, микрогранул ГА или гранул ГА непосредственно пропитанных раствором лекарственного препарата. Гетерогенными системами являются керамические резервуары, заполненные порошком.

Эффективность и кинетика выделения препарата зависит от биологической активности керамического материала и его структуры. В работе [214] разработана математическая модель, позволяющая рассчитать процесс выделения лекарственных веществ из пористых матричных систем с постоянным градиентом содержания. Для моделирования выделения использован метод интегральных соотношений, который является приближенным методом решения задач массопереноса. Метод заключается в составлении приближенного балансового соотношения массы вещества. Балансовое соотношение определяется данными о начальном распределении вещества в системе и о его переносе, который описывается первым законам диффузии Фика. В результате решения определяется параметрическая зависимость общего вида:

(₀) = f₁ (₀), (56)

где - безразмерное время процесса высвобождения;

₀ - относительная координата положения фронта растворения вещества.

Параметр определяется следующим образом:

= Dt/R², (57)

где t - время высвобождения;

R - радиус матрицы.

Нами проведены исследования совместно с Институтом нормальной физиологии РАМН in vivo на крысах серии Вистар, которое продемонстрировало пролонгированную кинетику выделения препарата, моделирующее лекарственное средство (метиленовый синий), из пористых сферических гранул ГА диаметром 2 мм. Содержание препарата в крови животных достигает максимума 0,98 мг/мл после 2-3 часов и находится на этом уровне 40 часов, затем происходит постепенное уменьшение содержания препарата в течение 100 часов (рис. 45). Этот результат можно объяснить наличием тонких пор, большим их содержанием и степенью взаимосвязанности, а также низким коэффициентом диффузии препарата в пористой матрице за счет действия капиллярных сил [203]. Аналогичный результат по выделению гентамицына (пролонгированность фармокинетики до 84 часов) приведены в работе [215] при использовании композиционных гранул ГА - хитозан.

4.2 керамика

Керамика на основе фосфата кальция может быть изготовлена с применением различных технологий, выбор которых зависит от требований к микроструктуре и свойствам материала. Для имплантатов, несущих механическую нагрузку, целесообразно использовать плотно спеченную керамику, обладающую большей прочностью по сравнению с пористой керамикой. Микроструктура такой керамики должна быть тонкодисперсной, поскольку прочность возрастает с уменьшением размера зерна согласно известной зависимости Холла-Петча [216]:

= ₀ + bd^-1/2, (58)

где ₀ и b - постоянные, d - размер зерна.

Плотная керамика может быть получена прессованием или шликерным литьем с последующим спеканием без приложения давления, горячим одноосным или изостатическим прессованием [217-219]. Могут быть использованы другие методы формования, применяемые в керамической технологии. Для интенсификации процесса уплотнения могут быть использованы активирующие спекание добавки, в частности формирующие жидкую фазу в процессе спекания [184] или проводят спекание в различных атмосферах (с различным парциальным давлением паров воды, с различным парциальным давлением СО₂ [21]). При этом плотность керамики стремятся довести до теоретически рассчитанного значения, составляющего 3,156 г/см³.

Для плотной керамики общепринятыми являются такие характеристики, как прочность при изгибе и растяжении, трещиностойкость. Предел прочности при изгибе, сжатии и растяжении ГА-керамики находится в диапазоне 38 - 250, 120 - 150 и 38-300 МПа [21,220], соответственно. Разброс данных вызван статистическим характером распределения прочности, влиянием остаточной микропористости, размером зерна, примесями и т.д. С увеличением отношения Ca/P, прочность увеличивается, достигая пиковой величины около Са/P=1,67, и резко уменьшаясь при Ca/P>1,67 [21].

Модуль функции Вейбулла статистического распределения прочности плотной керамики находится между 5 и 18, это означает, что она ведет себя как типичный хрупкий материал.

Важной характеристикой керамики является ее устойчивость к замедленному разрушению в коррозионно-активных средах. Под действием таких сред и механических напряжений в керамике происходит подрастание существующих микроструктурных дефектов. Скорость этого процесса, V = AKⁿ (А - постоянная, К - коэффициент интенсивности приложенных напряжений), зависит от величины показателя степени n. Чем больше значение n, тем выше устойчивость материала к замедленному разрушению. Для определения значения n может быть использован метод динамической усталости, заключающийся в нахождении зависимости прочности от скорости деформирования образца [24]. Коэффициент n может изменятся в широких пределах, например от 26 до 80 при испытаниях в сухих условиях (по сравнению с n=30 для керамики из оксида алюминия). Однако, он снижается до величины 12-49 во влажной среде, показывая высокую чувствительность ГА-керамики к замедленному росту трещины [21].

Модуль Юнга плотной керамики находится на уровне 35 - 120 ГПа [21]. Его величина зависит от остаточной пористости и присутствия примесей. Модуль Юнга, измеряемый при изгибе, равен 44 - 88 ГПа. Твёрдость по Виккерсу плотной керамики равна 3 - 7 ГПа. Плотная ГА-керамика проявляет сверхрпластичность при температуре от 1000 до 1100 ^оС, с механизмом деформации, основанном на проскальзывании по границам зёрен. Сопротивление износу и коэффициент трения плотной ГА-керамики сравнимы с таковым у зубной эмали. Значения трещиностойкости (К_1с) находится на уровне 0,8 - 1,2 МПам^1/2 причём она уменьшается почти линейно с увеличением пористости. Удельная работа разрушения составляет от 2,3 до 20,0 Дж/м².

Низкие значения трещиностойкости К_1с и модуля Вейбулла вместе с высокой восприимчивостью к замедленному росту трещины указывают на низкую надёжность изделий из плотной ГА-керамики.

Нами проведены сравнительные исследования влияния среды на замедленное разрушение и прочность ГА- и ФГА-керамики. На рис. 46а. показаны графики динамической усталости для ГА-керамики, на рис. 46б. - аналогичные данные для ФГА-керамики, образцы которых были испытаны в различных средах. Как можно видеть, прочность керамики снижается с уменьшением скорости деформирования, что обусловлено увеличением времени пребывания образца материала под нагрузкой в коррозионно-активной среде, приводящим к субкритическому подрастанию трещины в процессе нагружения до критического ее размера l_c. Этот размер соответствует критерию Гриффитса (59) для перехода трещины к самопроизвольному, неконтролируемому распространению [221]:

у = л (Ег/l_c)^1/2, (59)

где ? - коэффициент, зависящий от напряженного состояния; E - модуль нормальной упругости; г - поверхностная энергия разрушения; l_c - критический размер трещины.

Средние значения прочности зависели как от состава керамики, так и от среды проведения испытаний. На рис. 47 приведены примеры графиков статистического распределения прочности для ГА образцов. Использовали двухпараметрическое представление функции Вейбулла [24].

P = 1 - exp [-(V/V₀)(у/у₀)^m] (60)

и эстиматор вида Pi = i/(N + 1), (61)

где Pi - вероятность разрушения i-го образца из выборки размером N; V/V₀ - относительный напряженный объем в образце; у₀ - нормирующий множитель; m - модуль функции Вейбулла, характеризующий степень однородности распределения прочности. Графики для ФГА образцов имеют сходный характер.

Данные, полученные по результатам механических испытаний, представлены в табл. 14. Можно отметить следующие особенности влияния состава керамики и среды на механические свойства образцов. Во-первых, прочность ФГА-керамики существенно выше прочности керамики из чистого гидроксиапатита. Это может быть обусловлено меньшей ее пористостью (открытая пористость образцов, измеренная гидростатическим взвешиванием, составила 0,4 и 0,2% для ГА и ФГА, соответственно), поскольку прочность керамики, как известно [222], снижается с увеличением содержания пор по экспоненциальному закону. Введение фтора в состав материала при синтезе не снижает его прочности, в отличие от керамики, в которую фтор вводился в результате твердофазного взаимодействия ГА с фторапатитом (ФА) [4]. Физико-химическая среда оказывает существенно большее влияние на среднюю прочность ГА-керамики, по сравнению с ФГА-керамикой. Вода и синтетическая слюна снижают прочность ГА примерно на 30%, тогда как прочность ФГА-материала снижается лишь на 7 и 15%, соответственно. Это может быть объяснено снижением растворимости при замещении гидрокси-групп ионами фтора.

Значения показателя n, характеризующего устойчивость керамики к замедленному разрушения в процессе коррозии под напряжением, хорошо согласуются с известными данными для пористой ГА-керамики (пористость до 40%) при испытаниях на воздухе (n = 20) и в 0,9%-ном физиологическом растворе NaCl для инъекций (n = 12) [4]. В нашем случае получены примерно те же самые значения n, в диапазоне от 11 до 23. Можно отметить, что ГА керамика несколько более чувствительна к коррозии под напряжением в воде и синтетической слюне по сравнению с ФГА-керамикой, что объясняется меньшей ее растворимостью в водных растворах. Определенного вывода о механизме коррозии под напряжением сделать нельзя из-за того, что n имеет промежуточные по величине значения от характерных для механизма диссоциативной хемосорбции (n > 20) до «химического разрыва ионных связей с учетом экранирующего действия среды на напряженность электростатического поля» (n < 20) [222]. Из приведенных в табл. 14 данных следует, что наличие щелочных ионов, ионов хлора и НСО₃^? групп в растворе, моделирующем слюну, не оказывает значительного влияния на коррозию под напряжением.

Изменение модуля функции Вейбулла при испытаниях в коррозионно-активных средах по сравнению с его значением в «инертной» среде проведения испытаний обычно связывают с субкритическим подрастанием трещиноподобных дефектов микроструктуры материала. Снижение модуля Вейбулла или трансформация функции статистического распределения прочности из одномодальной в бимодальную, с областью пониженного значения модуля Вейбулла при малых значениях прочности, указывает на то, что наиболее опасные дефекты микроструктуры подрастают в процессе нагружения и, следовательно, происходит процесс коррозии под напряжением. Приведенные в табл. 14 данные по значениям модуля Вейбулла вполне согласуются с этими положениями, подтверждая, что образцы как ГА - так и ФГА-керамики подвержены коррозии под напряжением.

Таким образом, частичное замещение гидрокси-групп на ионы фтора позволяет повысить прочность и сопротивление замедленному разрушению керамики на основе ГА, приводя к большей ее надежности и долговечности при имплантации.

Одно из наиболее важных применений плотной керамики - подкожные устройства для продолжительного амбулаторного брюшного диализа, мониторинг давления и сахара в крови, или оптическое наблюдение за внутренними тканями тела [21]. Плотная ГА-керамика проявляет превосходную биосовместимость с тканью кожи, намного лучше, чем силиконовая смола, широко используемая для той же самой цели.

Искусственные корни зубов, изготовленные из плотной ГА-керамики, изучались in vivo и в клинических условиях. Присоединение десны к имплантату из ГА было сравнимо с фиксацией корня естественным связующим веществом. Также наблюдались положительные результаты в связывании кости с имплантатом. Это важно, поскольку неадекватное уплотнение приводит к чрезмерной подвижности зуба и в результате к его потере. К сожалению, большая часть из нагруженных зубных имплантатов были разрушены в течение года после внедрения из-за недостаточных механических свойств керамики [21].

В настоящие время основные усилия направлены на разработку в области технологии пористой керамики, содержащей взаимопроникающие канальные поры. Такая керамика может быть использована для заполнения костных дефектов, например, верхней суставной поверхности большеберцовой кости [176], как матрикс для клеточных культур или в системе доставки лекарственных препаратов [223-227]. Взаимопроникающие поры должны иметь диаметр не менее 100-135 мкм, чтобы обеспечивать доступ крови к контактным поверхностям [228,229], а также прорастание и фиксацию костной ткани [226-228]. Поры меньшего размера также необходимы, поскольку они способствуют повышению адсорбции протеинов и адгезии остеогенных клеток. Таким образом, желательно, чтобы пористая керамика имела бимодальное распределение пор по размерам (крупные и тонкие поры).

Известно большое число исследований по технологии пористой керамики на основе ГА. Пористую керамику получают, в основном, методом выгорающих добавок; пропиткой и последующим обжигом органических (полиуретановых) губок, либо вспениванием, например при введении пероксида водорода [229-236]. При этом пористость, например, при использовании додецилбензолсульфоната натрия, достигает до 50-60 %, а в случае глицина или агар-агара - порядка 80 % [1]. С использованием выгорающей добавки (например муки) с размером частиц 40 - 200 мкм, вводимой в количестве 37 масс. %, удалось получить ГА керамику с объемным содержанием пор до 46 % [230]. В качестве выгорающих добавок используют также полимеры - желатин, коллаген, хитозан и др., при этом открытая пористость достигает 85%. Также используют коралл (основное вещество СаСО₃), который в ходе гидротермальной обработки переходит в ГА (250 ^оС, 24-48 ч), сохраняя исходную микроструктуру и открытую пористость [21].

Нами разработан способ получения пористой керамики, содержащей тонкие и крупные взаимопроникающие поры в количестве до 70 об.% [229,236]. Для изготовления пористой керамики с бимодальным распределением пор получали композиционные гранулы ГА-биополимер, которые подвергали одноосному прессованию и последующему обжигу. Выжигание биополимера из гранул приводило к формированию тонких пор в гранулах (интрапоры), укладка гранул обусловливала формирование межгранульных взаимосвязанных пор (интерпоры) (рис. 48).

В качестве исходного использовали порошок ГА, полученный методом осаждения из водного раствора двухзамещенного фосфата аммония и хлорида кальция аммиаком. Порошок имел размер агломератов менее 1 мкм и удельную поверхность по БЭТ 5,5 м²/г. Гранулы ГА-биополимер изготавливали с использованием эффекта несмешивающихся жидкостей. Суспензию ГА в водном растворе биополимера диспергировали лопастной мешалкой при скорости ее оборотов 200-500 мин^-1 в диспергирующей жидкой среде, не смешивающейся с водным раствором биополимера. Под действием сил поверхностного натяжения образовывались гранулы практически идеальной сферической формы. Размеры гранул зависели от концентрации суспензии, температуры диспергирующей жидкости и скорости вращения лопасти мешалки. Гранулы осаждали на воронке Бюхнера, промывали и подвергали сушке. Рассевом на наборе сит выделяли фракцию 400-600 мкм, которую и использовали в последующих экспериментах.

Высушенные гранулы засыпали в металлические пресс-формы и подвергали одноосному прессованию под давлением от 10 до 100 МПа с получением сырых образцов диаметром 10 и высотой 4 мм. Эти дисковые образцы затем сушили на воздухе 24 ч и обжигали при температуре 1200⁰С с выдержкой при этой температуре 1 ч в атмосфере воздуха. Измеряли содержание и распределение по размерам открытых пор в образцах, исследовали их микроструктуру, измеряли прочность при диаметральном сжатии при скорости нагружения 1,0 мм/мин. По результатам испытаний на диаметральное сжатие рассчитывали прочность материалов при растяжении

?= 2P/?dh (62)

где ? - прочность при растяжении; Р - разрушающая нагрузка; d и h - диаметр и высота образца, соответственно.

На рис. 49 показаны гранулы ГА-биополимер. Как видно, гранулы имеют правильную сферическую форму. При выбранном соотношении ГА/биополимер, обжиг гранул при 1200⁰С приводит к содержанию в них открытых пор до 60 об.%. Ртутная порометрия показала, что основной является популяция пор размером 4-10 нм (до 68% от общего содержания пор), однако имеются также более крупные поры, размером 1-14 мкм. Микроскопические исследования также подтверждают наличие таких, более крупных пор. Возможно, что эти поры соединены между собой щелевидными каналами, размеры которых и регистрирует ртутная порометрия, поскольку они являются критическими для проникновения в образец ртути под давлением [237]. На рис. 50 показана микроструктура поверхности керамики.

Межгранульная пористость обусловливается упаковкой сферических гранул. Монодисперсные гранулы могут быть упакованы в свободной засыпке в сырую заготовку, содержащую 30-40 об.% межгранульных пор [238]. Такая укладка гранул соответствует координационному числу примерно 7:

N = 11,6(1 - Р) (63)

где Р - объемная доля открытых пор [239].Это значение близко к координационному числу упаковки атомов в объемно-центрированной кубической (о.ц.к.) решетке. Минимальное сечение порового пространства в укладке монодисперсных сферических гранул может быть оценено как соответствующее плоскости (100) о.ц.к. структуры. Согласно этому, укладка монодисперсных гранул размером 500 мкм обеспечивает минимальное сечение порового пространства примерно 100 х 200 мкм², что соответствует требованию минимального размера пор 100-135 мкм, необходимого для остеоинтеграции.

Ситуация становится более сложной при использовании полифракций гранул. Модель укладки бифракционных гранул предложена в [240]. Показано, что содержание открытых пор в укладке зависит от соотношения содержания и размеров гранул во фракциях. При свободной укладке сферических гранул с соотношением диаметров >5:1 интервал значений открытой пористости составляет от 12,5 до 35 об.%.

Приложение давления при формовании монодисперсных укладок гранул влияет на пористость. На рис. 51 и рис. 52 показана зависимость открытой пористости спеченных образцов от давления прессования и их микроструктура. Снижение пористости с увеличением давления обусловлено как деформацией сырых гранул, так и уплотнением их упаковки.

На рис. 53 приведена зависимость прочности при растяжении спеченных образцов от содержания открытых пор. Прочность резко снижается с увеличением пористости. Обычно для описания зависимости прочности от пористости используют соотношением Рышкевича: ? = ?₀ exp (-qР) (64), где ?₀ - прочность материала без пор, q = 7-8, либо показательную зависимость ? = ?₀(1 - Р)^m (65), где m = 3-10 для керамических материалов [241,242]. Оценки по этим соотношениям показывают, что при содержании пор примерно 30 об.% прочность снижается в 8-12 раз по сравнению с прочностью материала без пор. Это указывает на непротиворечивость сделанных оценок прочности, учитывая экспериментальные данные по прочности при растяжении гидроксиапатитовой керамики [21].

Таким образом, разработан способ изготовления керамики, содержащей тонкие внутригранульные и относительно крупные взаимопроникающие межгранульные поры, основанный на изготовлении и спекании заготовок из сферических гранул ГА/биополимер. Очевидным недостатком таких матриксов является низкая их прочность, менее 1 МПа при растяжении при пористости около 60%.

Совместно с МНИОИ им П.А. Герцена проведены их испытания in vitro на модели фибробластов человека и in vivo на животных, изготовлены композиты керамический матрикс - мезенхимальные стволовые клетки, которые имплантированы животным (крысам) для изучения регенерации костной ткани in vivo на модели дефекта теменной кости крысы. В результате проведенных исследований установлена высокая биосовместимость и биоактивность ГА- матриксов; доказана регенерация костной ткани животных при имплантировании матриксов с культивированными в них мезенхимальными стволовыми клетками, отмечена упорядоченность и интегрированность структур в области закрытия дефекта при использовании разработанных биокомпозитов.

Было выполнено исследование (совестно с Университетом Мио, Япония) по степени иммобилизации антибиотиков в пористые керамические матриксы [243]. Материалы пропитывали тремя различными антибиотиками: изепамицин сульфат (isepamicin sulphate) - аминоглюкосидный антибиотик, ванкомицин гидрохлорид (vancomycin hydrochloride) - глюкопептидный антибиотик и фломоксеф натрия (flomoxef sodium) - цепемовый (cephem) антибиотик. Минимальная необходимая концентрация для подавления активности стафилококка составляет 0,4 мкг/мл для изепамицина или 0,2 мкг/мл - для цепемового антибиотика.

Матриксы помещали в емкость миксера, заполненную растворами антибиотиков концентрации 100 мг/мл. С помощью форвакуумного насоса в емкости создавали разрежение 500 мм рт. ст. и выдерживали образцы в течение 10 мин. Для оценки степени иммобилизации рассчитывали отношение разности масс образцов после и до пропитки к массе исходных образцов.

Установлено, что степень иммобилизации антибиотиков возрастает с повышением пористости образцов. Максимально достигнутая степень пропитки составила 46?5 % по массе. Степень пропитки показана на диаграмме рис. 54. Экспериментами in vitro доказана пролонгированность до 40 суток фармокинетики выделения лекарственных препаратов из матриксов, что может быть использовано в терапии остеомиелитов. Исследованиями in vivo продемонстрирована превосходная биоактивность матриксов при имплантировании в берцовую кость кроликов (рис. 55).

Для регулирования биологического поведения пористой керамики, поверхность пор может быть покрыта слоем трехкальциевого фосфата. Для этой цели исходные заготовки керамики пропитывают раствором двузамещенного фосфата аммония с последующей термообработкой при температуре 900 ⁰С [244].

Большое значение для процесса остеоинтеграции имеет форма пор. В работе [21] было отмечена возможность получения методом выгорающих добавок канальных пор цилиндрической формы диаметром до 500 мкм и длиной более 5 мм.

Пористая керамика может быть получена при физиологической температуре, минуя стадию спекания [28]. Прочность такого материала может рассматриваться как некоторый нижний ее предел. Процесс получения материала моделирует формирование ГА в организме, в условиях in vivo. Исследовали образцы кальций-дефицитного гидроксиапатита (КДГА) и карбонат замещенного гидроксиапатита (КА), полученных в соответствие со следующими реакциями:

6СаНРО₄ + 3Са₄(РО₄)₂О = 2Са₉НРО₄(РО₄)₅ОН + Н₂О (66)

(5/8)NaHCO₃ + 2CaHPO₄ + 2Ca₄(PO₄)₂O

= 1,067Ca_9,375Na_0,586(PO₄)_5,375(CO₃)_0,586(OH)_1,961 +5/16(H₂O) (67)

Синтезированный порошок прессовали под давлением 70 МПа и выдерживали во влажной среде при 38 ⁰С. Объемное содержание пор в материалах было 27-39 %. Получены следующие средние значения прочности материалов: при растяжении - 12-18 МПа для КДГА и 9-14 МПа для КА; при сжатии - 83-172 для КДГА и 57-80 для КА. Различие свойств материалов объяснено особенностями формирования их микроструктуры при физиологических температурах. Уровень прочности высок, несмотря на значительное содержание пор, форма и концентрация которых существенно влияют на механические свойства [241].

Пористая керамика, хотя и обладает достаточной прочностью на сжатие (2-100 МПа), но имеет предел прочности при изгибе 2-11 МПа, что в два-три раза меньше необходимых значений, причем, с увеличением пористости прочность материала резко снижается (рис. 56) [21]. В работах [245-247] исследовано влияние пористости на прочность при сжатии и модуль Юнга спеченной при 1100 ⁰С керамики на основе ГА и ТКФ. Установлено, что прочность и модуль Е снижаются с увеличением содержания пор Р, согласно соотношениям ln = 6,4 - 3,9P для ГА и ln = 6,6 - 6,2P для ТКФ, и ln Е = 4,6 - 4,0P для ГА. Экстраполированные значения прочности и модуля упругости при нулевой пористости равны, соответственно, 70 МПа и 9,2 ГПа - для ГА, и 135 МПа и 21 ГПа - для ТКФ. Приведенные значения прочности ГА существенно ниже, чем данные из других источников.

Прочность постепенно увеличивается, когда кость прорастает во внутрь сети пор имплантанта. По данным [51], прочность при изгибе для пористого имплантанта, заполненного на 50-60 % костной тканью, составляет 40-60 МПа.

Зависимость трещиностойкости ГА керамики от размера зерна немонотонная, имеется максимум, соответствующий размеру зерна керамики около 0,4 мкм [248]. Максимальное значение прочности и трещиностойкости керамики, спеченной с введением Na₃PO₄, составляют, соответственно, 135 МПа и 1,25 МПам^1/2. Добавка фосфата натрия приводит к росту зерна и снижению трещиностойкости до 0,95 МПам^1/2.

Пористую керамику с улучшенными прочностными свойствами можно изготовить с применением волокон. Волокнистый пористый материал, как известно, показывает повышенную прочность благодаря сцеплению (соединению) волокон, изменению траектории трещин и вытягивания волокон. Кроме того, волоконный ГА каркас может быть укреплён ГА - полимерным биодеградирующим костным веществом. Существует много работ по изготовлению волокнистой, пористой кальций-фосфатной керамики. Волокнистая пористая структура может быть приготовлена несколькими способами [21,249-250]:

- спекание в-ТКФ волокон, с последующим преобразованием в пористый каркас ГА путём обработки в расплавах солей;

- спекание нитевидных кристаллов ГА или преобразование б-ТКФ при гидротермальных условиях;

- динамическое уплотнение ОКФ и в-кальций метафосфатных волокон.

К сожалению, механические свойства не достигают требуемого уровня в любом случае.

4.3 Композиционные материалы

Применение ГА керамики в качестве материала для имплантатов, несущих механические нагрузки, часто невозможно из-за недостаточности прочностных характеристик и трещиностойкости. Поскольку естественная костная ткань является композиционным материалом, состоящим из ГА, коллагена и других белков, то значительные перспективы для повышения механических свойств ГА-керамики, предназначенной для изготовления костных имплантатов, имеет принцип формирования композиционных структур. Введением соответствующих добавок в керамику можно улучшить механические характеристики, но при этом должны сохраняться ее биологические свойства и, в первую очередь, биосовместимость с тканью живого организма.

Композиционные материалы содержащие ГА могут быть подразделены на две основные группы [181]:

· Керамика, армированная дисперсными частицами, дискретными и непрерывными волокнами [251-254];

· Наполненные дисперсными частицами керамики биосовместимые полимеры [255-263].

Для упрочнения оксидных керамик в них вводят дисперсные частицы частично стабилизированного диоксида циркония (ZrO₂ (Y₂O₃)), претерпевающего полиморфное превращение из тетрагональной в моноклинную модификацию под действием механических напряжений. В работах [251,252] изучали взаимодействие ГА с ZrO₂ и определяли прочность на изгиб и тещиностойкость при различном соотношении ГА и ZrO₂ (Y₂O₃). Было установлено, что прочность на изгиб и трещиностойкость возрастают с увеличением количества ZrO₂. Материалы, содержащие 50 % ZrO₂ и обожженные при 1400 ⁰С, показали значения прочности на изгиб, в два-три раза превышающие прочность ГА без добавок. Однако использование диоксида циркония для упрочнения ГА керамики, как показано, ограничено из-за стабилизации диоксида циркония кальцием из ГА при температуре спекания [251]. Возможности армирования ГА-матрицы неорганическими волокнами, например Al₂O₃ или SiC, также лимитированы рассогласованием коэффициентов термического расширения матрицы и волокна, приводящего к образованию растягивающих напряжений в матрице, которые снижают прочность. В [181] показана возможность повышения прочности в 2 раза и трещиностойкости в 6 раз горячепрессованной ГА-керамики в результате ее армирования дискретными металлическими волокнами (нержавеющая сталь, сплав хастеллой), вводимыми в керамическую матрицу в количестве до 20 об.%. Полученные композиционные материалы имеют прочность до 224 МПа, трещиностойкость 6,0-7,4 МПаm^1/2 и модуль нормальной упругости до 142 ГПа. Однако, для керамико-металлических имплантатов характерна коррозия и негативные реакции с тканями.