Разработка методов и средств реабилитации объектов отравляющих веществ

Каждый опыт проводят минимум два раза, в опыте берут количество колб для культивирования также минимум в двух повторностях.

2.4 Методика контроля роста микроорганизмов

Рост культуры контролируют:

а) по изменению оптической плотности при длине волны 560 нм (ОП₅₆₀) в кювете 1 см. на спектрофотометре. Пересчет оптической плотности на вес сухой биомассы проводили согласно коэффициенту 0,5 (г сухих клеток/ед оптической плотности), полученному экспериментально для бактериальных культур, выделенных из почвы.

б) по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) путем высева из разведений на агаризованную среду LB. Последовательно культуральную жидкость разводят до необходимого разведения (10^-6-10^-8 клеток/мл). Для разведения использовали стерильный физ. раствор. Из пробирки с необходимым разведением берут 100 мкл культуральной жидкости, которую наносят на агаризованную среду LB и тщательно растирают шпателем. Чашки помещают в термальную комнату (t 28-29⁰С) на 2-3 суток. Затем подсчитывали количество колоний.

Состав среды LB: дистиллированная вода -1 литр, бакто-пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, NaCl -5 г, агар-агар - 18г, рН 7.0. Стерилизация: автоклавирование при 0,5 атм, 30 минут.

Для расчета скорости роста строят кривую роста, выраженную в логарифмах. По кривой роста определяли длину лаг-фазы и логарифмическую фазу роста.

Удельную скорость роста рассчитывают по формуле:

= (ln ОП₂ - ln ОП₁)/(t₂ - t₁) час^-1

Экономический коэффициент мг органофосфонатов/г биомассы рассчитывают по формуле:

Q = D/(A/2),

где Q - экономический коэффициент, мг органофосфонатов/г биомассы;

А - оптическая плотность в стационаре;

D - количество метаболизируемой МФК.

2.5 Методика определения концентрации соединений с С-Р связью

Метод определения фосфат-иона основан на образовании окрашенного комплексного соединения между фосфором, молибдатом аммония и малахитовым зеленым в сильно кислой среде. Количество фосфора рассчитывают по результатам измерения поглощения образующегося комплексного соединения при длине волны 645 нм на фотоколориметре.

Содержание соединений с С-Р связью определяют по разнице между количеством общего и неорганического фосфора. Концентрацию фосфора общего определяют на спектрофотометре по образованию комплекса фосфомолибдата с малахитовым зеленым при низких значениях рН после гидролиза с персульфатом аммония, в ходе которого происходит разрыв С-Р связи и высвобождение фосфат-иона. Соотношение предварительно разведенной культуральной жидкости и персульфата аммония было 1:1.

Пробы культуральной жидкости отбирали в эппендорфы для анализа, центрифугировали 10 тыс. об./мин - 2 мин, супернатант хранили в замороженном виде для разрыва С-Р связи ГФ в стеклянных пробирках проводили гидролиз проб с персульфатом аммония. Для приготовления раствора персульфата 8 г персульфата аммония растворяли в 20 мл дистиллированной Н₂О. Смешивали пробу и раствор персульфата аммония в соотношении 1:1 в стеклянных пробирках, которые закрывали фольгой и закрепляли ее резиновыми кольцами. Гидролиз проводили в течение 60 мин. при 90⁰C на водяной бане.

Вносили в эппендорфы компоненты реакции в соотношении: 130 мкл 1н H₂SO_4-, 130 мкл пробы, 1300 мкл раствора С. Смесь тщательно перемешивали. Через 10-15 минут измеряли ОП при длине волны 645 нм (ОП₆₄₅) в кювете 1 см, в линейной области значений ОП от 0,2 до 0,5. В качестве контроля использовали образец культуральной жидкости без добавления персульфата аммония.

Приготовление растворов:

Раствор А: 90 мг малахитового зеленого растворяли в 200 мл дистилированной воды при перемешивании в течение 30 мин. на магнитной мешалке;

Раствор В: 8,4 г молибдата аммония растворяли в 60 мл HСl конц в течение 20 мин. при перемешивании стеклянной палочкой; после растворения молибдата аммония в HCl конц. добавляли полученный раствор к 138 мл дистиллированной Н₂О.

Раствор С: смешивали по 200 мл растворов А и В, перемешивали в пластиковой емкости на магнитной мешалке в течение 30 мин., фильтровали полученный раствор С через плотный бумажный фильтр в пластиковую посуду. Раствор С использовали для анализа. Хранили в холодильнике, в течение надели. Перед каждым употреблением фильтровали через бумажный фильтр.

3. Обсуждение результатов

3.1 Отбор штаммов микроорганизмов-деструкторов

фосфорорганических соединений

Для скрининга использовали коллекцию штаммов Pseudomonas и Alcaligenes лаборатории института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. В качестве субстрата использовали МФК.

Образование зон «просветления» на среде, содержащей МФК, представлено на рисунке 6.

Рисунок 6 - Образование зон «просветления» различными штаммами

1 - KR31; 2 - Sm12; 3 - Km12; 4 - 2-79; 5 - Pf-5; 6 - Q₂ - 87; 7 - CHAQ1;

8 - Sm11; 9 - UC 5; 10 - PCLB 91; 11 - 38а; 12 - 53a; 13 - 54; 14 - 1217;

15 - 7Н; 16 - 90Н; 17 - 70А; 18 - IG1; 19 - OV17; 20 - 1С7; 21 - IIД 5;

22 - VB1; 23 -OV9; 24 - 29; 25 - 19; 26 - 25р; 27 - AS15.

Как видно из рисунка 6, наибольшей способностью к усилению растворения МФК обладают штаммы 2-79, Pf-5, P54, 1C7, относящиеся к роду Pseudomonas fluorescens. Наилучшая способность к растворению метилфосфонатов отмечается у штамма Sm11 , относящегося к роду Alcaligenes sp.

Таким образом, биодоступность МФК можно достичь внесением в почву штамма Sm11 бактерий рода Alcaligenes sp. Поэтому для изучения эффективности биодеструкции фосфорорганических соединений выбран именно этот штамм.

3.2 Биодеструкция метилфосфоновой кислоты и её кислых эфиров

Из литературных данных известно, что неорганический фосфат ингибирует потребление органофосфонатов в качестве источника фосфора разложение МФК [33-35]. При выращивании посевного материала на агаризованной среде, по-видимому, возможна экстракция из агара и накопление в клетках более доступных, чем МФК, источников фосфора, которые могут попадать в экспериментальную среду вместе с посевным материалом. Более доступный фосфор может находиться на поверхности агара, образуясь в процессе жизнедеятельности культуры из МФК при наращивании биомассы. Поэтому, к тому времени, как биомасса на агаризованной среде нарастет до необходимого уровня, в клетках посевного материала могут быть запасные источники фосфора, за счет которых культура будет расти в среде с МФК, не разлагая его. Чтобы исключить все эти факторы необходимо иметь клетки посевного материала, голодные по фосфору. Для решения этой проблемы необходимо суспензию клеток, используемую в качестве посевного материала, инкубировать в среде с глутаматом (источником углерода), но без источника фосфора в течение трех суток. В это время можно считать клетки голодными по фосфору.

Подготовленный посевной материал использовали для засева опытных колб с концентрацией МФК (метилфосфонатов) 0,3 г/л. Рост культур контролировали по изменению оптической плотности и контролировали изменение содержания органического фосфора и значение рН. По данным измерений оптической плотности и концентрации загрязнителя строили кривые роста культур и потребления источника фосфора (рисунок 7 и 8).

Рисунок 7 - Динамика роста штамма Sm11 в среде, содержащей МФК

Рисунок 8 - Изменение концентрации МФК

В рассматриваемых системах различают следующие фазы размножения:

лаг-фаза - период между засевом и началом размножения;

экспоненциальная фаза - период размножения микроорганизмов с постоянной скоростью;

фаза гибели - период, в течение которого популяция погибает.

Как видно из рисунка 7, рост культуры на среде, содержащей МФК, начинался после непродолжительной лаг-фазы - не более 10 часов, затем наблюдался значительный рост микроорганизмов. Концентрация МФК уменьшается в 2 раза в течение 40 -45 часов (рисунок 8). После 58 - 62 часов рост культуры и потребление МФК прекращалось, что обусловлено недостатком в питательной среде источника углерода. При добавлении глутамата натрия рост клеток возобновлялся, и наблюдалось дальнейшее уменьшение концентрации МФК.

Для оценки возможности биодеструкции изопропилового, изобутилового и пинаколилового эфиров использовали отобранный ранее штамм Sm11 рода Alcaligenes sp.

Начальная концентрация кислого эфира составляла 0,2 г/л. Рост культур контролировали по изменению оптической плотности. По данным измерений оптической плотности и концентрации загрязнителя строили кривые роста культур и потребления кислых эфиров.

Динамика роста культуры и потребления изопропилового эфира представлена на рисунке 9 и 10.

Рисунок 9 - Динамика роста штамма Sm11 в среде, содержащей изопропиловый эфир МФК

Рисунок 10 - Изменение концентрации изопропилового эфира МФК

Как видно из рисунка 9, рост культуры на среде, содержащей изопропиловый эфир, начинался практически без лаг-фазы, сразу наблюдался значительный рост микроорганизмов. При этом наблюдается уменьшение концентрации изопропилового эфира в 1,6 раза в течение 42 часов (рисунок 10). После 40-50 часов рост культуры прекращался, что обусловлено недостатком в питательной среде источника углерода. При добавлении глутамата натрия рост культуры возобновлялся.

Аналогичная тенденция выявлена и для изобутилового эфира (рисунок 11 и 12).

Рисунок 11 - Динамика роста штамма Sm11 в среде, содержащей изобутиловый эфир МФК

Как видно из рисунка 11, рост культуры среде, содержащей изобутиловый эфир МФК, начинается практически сразу, без лаг-фазы. После 80 часов рост штамма Sm11 прекращается, что обусловлено отсутствием в среде источника углерода. Затем рост культуры возобновляется. Изменение концентрации изобутилового эфира представлено на рисунке 12.

Рисунок 12 - Изменение концентрации изобутилового эфира МФК

Как показано на рисунке 12, концентрация изобутилового эфира МФК уменьшается в 1,7 раза в течение 70 - 90 часов.

Рост штамма Sm11 рода Alcaligenes sp в среде, содержащей пинаколиловый эфир, и уменьшение концентрации загрязнителя представлены на рисунках 13 и 14 соответственно.

Рисунок 13 - Динамика роста штамма Sm11 бактерий рода Alcaligenes sp

·

Рисунок 14 - Изменение концентрации пинаколилового эфира МФК

Как показано на рисунках 13 и 14, рост культуры на питательной среде, содержащей пинаколиловый эфир МФК, также характеризуется непродолжительной лаг-фазой, однако биодеструкция эфира происходит интенсивнее: концентрация пинаколилового эфира МФК уменьшается в 1,7 раза в течение 50 - 70 часов.

На основании полученных данных определяли вес сухой биомассы, удельная скорость роста, экономический коэффициент. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Основные параметры роста культуры в присутствии метилфосфоновой кислоты и ее кислых эфиров

Как видно из таблицы 6, в присутствии кислых эфиров культура Sm11 характеризуется невысокой скоростью роста 0,04 - 0,06 ч^-1. Причем рост культуры начинается практически сразу, без лаг-фазы. Рост биомассы прекращался спустя 40-50 часов вследствие полного потребления источника углерода. Об этом свидетельствует тот факт, что после добавочного внесения глутамата натрия рост возобновлялся Для культуры Sm11 отмечается и высокая величина потребления метилфосфонатов в расчете на единицу биомассы. Следует отметить, что экономический коэффициент культуры в лаг-фазе и за весь период отличается незначительно: для изопропилового эфира составляет 60,5 и 55,5 мг загрязнителя/г биомассы соответственно. Однако для пинаколилового эфира данный показатель отличается в два раза и составляет

25,5 и 50,0 мг загрязнителя/г биомассы соответственно. Характерным отличием роста культуры на среде, содержащий пинаколиловый эфир, является более продолжительная лаг-фаза, на протяжении которой метабилизируется меньшее количество эфира - 20 мг по сравнению с 46 мг изопропилового эфира, однако количество поглощенного пинаколилового эфира за весь период выше - 105 мг.

По результатам количественной оценки культур - накоплению биомассы, удельной скорости роста и эффективности разложения соединений с С-Р связью был отобран наиболее активный штамм Sm11 рода Alcaligenes sp.

3.3 Пути метаболизма органофосфонатов

Процессы биодеструкции любых соединений не могут быть оценены без изучения путей метаболизма и механизма их регуляции. Применительно к нашей работе проводится сравнительное изучение механизмов деструкции соединений с С-Р связью.

Штаммы-деструкторы МФК осуществляют расщепление С-Р связи посредством ферментной системы с участием С-Р лиазы, доказательством чему служит обнаружение метана в газовой фазе при культивировании в среде с МФК в количествах, эквимолярных потребленному источнику фосфора:

Глифосат метаболизируется через аминометилфосфоновую кислоту (АМФК). Об этом свидетельствует идентификация глиоксилата как продукта расщепления ГФ посредством глифосат-оксидоредуктазы. При реализации этого пути фосфат-ион отщепляется на последующих стадиях при участии фосфонатазы.

МФК и другие фосфонаты выступают в роли прекурсоров фосфат-иона в процессах биодеградации фосфорорганических соединений с участием широкого спектра природных микроорганизмов, находящихся в условиях фосфорного голодания.

Выводы

1 Проведен анализ литературных данных о существующих технологиях реабилитации загрязненных почв. Показано, что биологические методы санации территорий, загрязненных продуктами деструкции фосфорорганических отравляющих веществ, наиболее экологически безопасны, эффективны, экономичны и выгодно отличаются отсутствием вторичных отходов.

2 Проведен скрининг микроорганизмов-деструкторов фосфорорганических соединений. Наилучшая способность к растворению метилфосфонатов отмечается у штамма Sm11, относящегося к роду Alcaligenes sp.

3 Изучена возможность биодеструкции продуктов разложения фосфорорганических отравляющих веществ: метилфосфоновой кислоты и её изопропилового, изобутилового, пинаколилового эфиров. Установлено, что штамм Sm11 рода Alcaligenes sp является активным деструктором метилфосфоновой кислоты и её кислых эфиров: наблюдается уменьшение концентрации метилфосфоновой кислоты в 2 - 2,2 раза в течение 40 -45 часов, кислых эфиров - в 1,6 - 1,7 раза в течение 50 - 70 часов. Показано, что культура характеризуется высокой удельной скоростью роста 0,04 - 0,05 ч^-1 как в присутствии метилфосфоновой кислоты, так и кислых эфиров.

Список использованных источников

1. Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении. ООН, Женева, 1993. - 170 с.

2. Федеральный закон РФ № 76-ФЗ от 2 мая 1997 г. (с изменениями от 29 ноября 2001 г., 10 января 2003 г.) «Об уничтожении химического оружия».

3. Федеральный закон РФ № 136-ФЗ от 7 ноября 2000 г. «О социальной защите граждан, занятых на работах с химическим оружием».

4. Федеральная целевая программа «Уничтожение запасов химического оружия в Российской Федерации». Постановление Правительства РФ от № 969 от 29 декабря 2007 г. - М., 2008. - 28 с.

5. Холстов В.И., Тарасевич Ю.В., Григорьев С.Г. Пути решения проблемы безопасности объектов по уничтожению химического оружия // Ж. росс. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1995. - Т.39. - №4. - С. 65-73.

6. Скоробогатова В.И., Щербаков А.А., Мандыч В.Г. Санация загрязненных территорий в районах хранения и уничтожения химического оружия. - Российский химический журнал им. Д.Менделеева. - 2007. - том LI - выпуск 2. - С.71-74.

7. Маршалл В. Основные опасности химических производств. - М.: Мир, 1989. - 672 с.

8. Горский В.Г., Моткин Г.А., Петрунин В.А. и др. Научно-методические аспекты анализа аварийного риска. - М.: Экономика и информатика, 2002. - 260 с.

9. Организация и осуществление санитарно-эпидемиологического надзора на объектах по уничтожению фосфорорганических отравляющих веществ: Методические указания (временные)// Сборник инструктивно-методических документов по проблеме уничтожения химического оружия: Часть II. Фосфорорганические отравляющие вещества: Том 1 / ФУМБЭП при МЗ РФ. - Москва, 2001. - С. 187-243.

10. Правила безопасности объектов по УХО на основе ФОВ. - М.: Российское агентство по боеприпасам, 2003. - С. 66.

11. Радилов А.С., Шкаева И.Е., Николаев А.И. и др. Экспресс-оценка особо опасных химических соединений в объектах окружающей среды// Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия. Тез. докл. научно-практической конференции. - Москва, 2004. - С. 161-162.

12. Методика определения площади защитных мероприятий, устанавливаемой вокруг объектов по хранению ХО и ОУХО. - М.: МО РФ, 1999. - 98с.

13. Методика расчета концентраций в атмосферном воздухе вредных веществ, содержащихся в выбросах предприятий (ОНД-86). Л.: Гидрометео-издат, 1987. - 111 с.

14. Постановление Правительства РФ «Об утверждении площади ЗЗМ, устанавливаемой вокруг объекта по хранению химического оружия (пос. Марадыковский Кировской области) и перечня населенных пунктов, включаемых в указанную зону от 29.12.2004 № 867. - Москва, 2004. - 5 с.

15. Методика прогнозирования масштабов заражения сильнодейству-ющими ядовитыми веществами при авариях (разрушениях) на химически опасных объектах и транспорте. РД 52.04.253 - 90. Л.: Гидрометеоиздат, 1991. - 56 с.

16. Методика определения площади защитных мероприятий, устанавливаемой вокруг объектов по хранению ХО и ОУХО. - М.: МО РФ, 1999. - 84 с.

1.7 Мурин А.В. Математическое моделирование на параллельных системах последствий химических аварий. - Автореф. Дис. ... канд. физ.-мат. Наук /Ижевск - ИжГТУ, 2002 - 24 с.

18. Тронин С.Я., Мещеряков Е.М., Хромов М.Н. Организация защиты населения при авариях на объектах хранения и уничтожения химического оружия// Ж. росс. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 2002. - т. 36. - № 6. - С. 112-117.

19. Сильнодействующие ядовитые вещества и защита от них. Под ред. В.А. Владимирова. - М.: Воениздат, 1989. - 109 с.

20. Евстафьев И.Б., Холстов В.И., Григорьев С.Г. Методические основы оценки аварийной опасности объектов по хранению и уничтожению химического оружия // Ж. росс. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1993. - Т. 37, №3. С.5 0-59.

21. Скоробогатова В.И, Кобцов С.Н., Щербакова Л.Ф., Мандыч В.Г., Сотников Н.В, Щербаков А.А. Особенности поведения фосфорорганических отравляющих веществ в воде и почве - Сборник №5 научных трудов СВИРХБЗ. - Саратов, 2005.- С.152-155.

22. Александров В.Н., Емельянов В.И. Отравляющие вещества. - М.: Воениздат, 1990. - 271 с.

23. Ашихмина Т.Я. Научно-методологические основы системы комплексного экологического мониторинга объектов хранения и уничтожения химического оружия. - Киров.: Вятка, 2001. - 473 с.

24. Савельева Е.И., Зенкевич И.Г., Кузнецова Т.А. и др. Исследование продуктов превращений фосфорорганических отравляющих веществ методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии //Ж. росс. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 2002. - Т. 46. - №6. - С.89-92.

25. Савельева Е.И., Радилов А.С., Кузнецова Т.А. и др. Определение метилфосфоновой кислоты и ее эфиров как химических маркеров фосфорорганических отравляющих веществ - Журнал прикладной химии. 2001, Т. 74, № 10. - 1677 с.

26. Франке З., Франс П., Варнке В. Химия отравляющих веществ. Т. 1. - М.: Химия, 1973. - 270 с.

27. Скурлатов Ю.И., Дуга Г.Г. Введение в экологическую химию. - Учебное пособие. М.: Высш. Шк., 1994. - 400с.

28. Корте Ф., Бахадир М. и др. Экологическая химия / Пер. с нем. под ред.- Корте. М.: Мир, 1996. - 396 с.

29. Безопасность России: Правовые, социально-экономические и научно-технические аспекты. Региональные проблемы России с учетом риска и возникновения природных и техногенных катастроф// В.И. Осипов, Ю.А. Мамаев, В.А. Королев.- М.: МГФ «Знание», 1999. - 144 с.

30. Орлов Д.С. Химия и охрана почв. М.: Химия, 1996. - 175с.

31. Королёв В.А., Некрасова М.А. Экспериментальные исследования электрохимической миграции ионов металлов в дисперсных породах// Геохимия. 1998. № 12. С. 1277-1283.

32. Small M.J. Compounds formed from the chemical decontamination of HD, GB, and VX and their environmental fate. Tech Rpt8304; AD A149515. Fort Detrick, MD:U.S. Army Medical Bioengineering Research and Development Laboratory - 1984.

33. Schowanek D. and Verstraete W. Phosphonate utilization by bacterial cultures and enrichments from environmental samples / Schowanek D. and Verstraete W. //Appl.Environ.Microbiol - 1990.-V. 56.-P. 895-903.

34. Smith J.D. Metabolism of Phosphonates. - In: The role of phosphonates in living systems (Hilderbrand, R.L., ed.) CRC Press, Boca Raton - 1983.-P. 31-54.

35. Selvapandiyan A. and Bhatnagar Raj K. Isolation of glyphosate-metabolising Pseudomonas: detection, partial purification and localization of carbon-phosphorus lyase / Selvapandiyan A. and Bhatnagar Raj K. // Appl. Microbiol. Biotechnol - 1994.-V 40.-P. 876-882.

36. Shinabarger D.L. and Braymer H.D. Glyphosate catabolism by Pseudomonas sp. strain PG2982. / Shinabarger D.L. and Braymer H.D. // J Bacteriol - 1986.-V. 168.-P. 702-703.

37. Shames S.L. Fragmentative and stereochemical isomerisation probes for homolytic carbon to phosphorus bond scission catalysed by bacterial carbon-phosphorus lyase / Shames S.L., Wackett L.P., LaBarge M.S., Kuczkowski R.L. and Walsh C.T. // Bioorg.Chem. - 1987.-V 15.-P. 366-373.

38. Матыс С.В. Деградация метилфосфоната Е. coli: физиологические и биохимические аспекты / Матыс С.В. // Диссертация - 2003. - С. 56.

39. Нифантьев Э.Е. Химия фосфорганических соединений / Нифантьев Э.Е. - М.: 1971.

40. Кононова С.В. и Несмеянова М.А. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами / Кононова С.В. и Несмеянова М.А. // Биохимия- 2002.- Т. 67.-С. 220-233.

41. Goldstein A.H., Liu S.T. Molecular cloning and regulation of a mineral phosphate solubilizing gene from Erwinia herbicola - Biotechnology, 1987, v.5 - Р. 72-74.

Размещено на Allbest.ru