Сорбционное извлечение и ВЭЖХ-определение фенольных веществ в растительных материалах

1.2 Свойства фенольных соединений и их нахождение в растительных материалах

Фенолкарбоновые кислоты широко распространены в растениях, особенно в составе дубильных веществ. Они содержатся в растительных тканях в связанной форме и высвобождаются после гидролиза. Так, салициловая кислота обнаружена в ромашке, календуле, тысячелистнике, полыни, боярышнике, галловая кислота ? в толокнянке, зверобое, дубе, а ванилиновая кислота содержится в толокнянке. Фенолкарбоновые кислоты обладают общими свойствами гидроксикарбоновых кислот. Их растворимость в воде варьируется в зависимости от температуры, хорошо растворимы в спирте, диэтиловом эфире. Данные кислоты обладают антисептическими и кератолитическими свойства. Особенностью галловой кислоты является способность к самоконденсации с образованием депсидов (сложных эфиров) [2].

Гидроксикоричные кислоты также широко распространены в образцах растительного происхождения в свободном состоянии или в виде производных. Коричная кислота может быть идентифицирована в небольших количествах в качестве промежуточного продукта биосинтеза оксикоричных кислот. Характерными особенностями гидроксикоричных кислот является образование сложных эфиров с ациклическими кислотами и сахарами (главным образом глюкозой), а также существование в виде цис- и транс-изомеров. Все представители гидроксикоричных кислот обладают высокой биологической активностью и оказывают на организм общеукрепляющее, иммуностимулирующее, противовоспалительное и антиоксидантное действие. Кофейная кислота может быть определена в толокнянке и боярышнике [2].

Кумарин представляет собой внутримолекулярный сложный эфир (лактон) орто-гидроксикоричной кислоты, который образуется при попытке выделения кумариновой кислоты. Вещество растворимо в воде (0,3%), этаноле, диэтиловом эфире и других органических растворителях, во многих растениях присутствует в виде гликозидов. Известно, что ферментативный гидролиз «связанного» кумарина приводит к образованию свободного кумарина. Характерным для кумарина является отсутствие свободной фенольной группы, в то время как его производные относятся к типичным фенольным соединениям. Значимым качеством кумарина является способность оказывать разнообразное физиологическое воздействие на организм человека [2].

Катехины - наиболее восстановленная подгруппа флавоноидов. Они распространены в растениях в свободном состоянии и в виде производных галловой кислоты, не встречаются в форме гликозидов. Определяемый (-)-эпикатехин - стереоизомер молекулы катехина. У данного стереоизомера отмечена наибольшая Р-витаминная активность. Также известно, что он хорошо растворим в воде и полярных органических растворителях, легко окисляется кислородом воздуха, особенно при нагревании и на свету, что создавало трудности при его выделении до разработки хроматографических методов. Катехины склонны к полимеризации, а образующиеся полимеры входят в состав дубильных веществ [2].

Представителем флаванонолов является дигидрокверцетин, являющийся лабильным соединением, в связи, с чем не накапливается в растениях в значительных количествах. Чаще находится в свободном состоянии, чем в форме гликозидов, проявляет Р-витаминную активность, в 3-4 раза превосходящую таковую кверцетина [2].

Кверцетин - один из самых распространенных флавонолов. Данное вещество плохо растворимо в воде, при нагревании растворимо в этаноле, в растворах щелочей, в органических аминах. Кверцетин является активным антиоксидантом, особенно в смесях с аскорбиновой кислотой; проявляет свойства витамина Р. Этот флавонол обнаружен в растениях в форме гликозидов и идентифицирован в боярышнике, зверобое, дубе, ромашке, тысячелистнике.

Одним из самых распространенных в растениях гликозидов кверцетина является рутин. Он обладает капилляроукрепляющими свойствами, Р-витаминной активностью и определен в боярышнике, зверобое, ромашке, пустырнике [2].

Большинство флаванонов растворимы в этаноле, горячей воде, растворах щелочей. При дегидрировании флаванонов в положении гетероцикла образуются флавоны, поэтому флавоны сопровождают соответствующие флаваноны. Последние часто встречаются в виде 7-рамногликозидов, причем сахарные остатки могут быть представлены либо рутинозой, либо неогесперидозой. Таковыми являются исследуемые гесперидин и нарингин [2].

Ценными являются антиоксидантные свойства фенольных соединений, обусловленные наличием гидроксильных групп [5]. Установлено, что дубильные вещества взаимодействуют с перекисными радикалами липидов и благодаря этому являются эффективными ингибиторами их перекисного окисления. Также доказано, что фенольные вещества уменьшают образование супероксид-аниона в системе ксантин-ксантин оксидаза [2].

Нахождение фенольных соединений в растительном сырье. В зависимости от вида и рода растения процессы метаболизма и накопления фенольных веществ проходят разными путями, что определяет фенольный состав тех или иных представителей флоры. Так в листьях толокнянки были обнаружены гидрохинон, арбутин, галловая, эллаговая, ванилиновая, кофейная, n-оксибензойная кислоты, флавоноиды.

В траве зверобоя и тысячелистника содержатся те же дубильные вещества и свободные органические кислоты, что и толокнянке, а также керотин, аскорбиновая кислота, гиперицин, витамины К и С. В свою очередь, кора дуба содержит дубильные вещества, образованные в результате окислительной конденсации катехинов, галловую и эллаговую кислоты, а также кверцетин, гесперидин, рутин. В цветках календулы обнаружены каротиноиды, дубильные вещества, флавоноиды, органические кислоты, аскорбиновая кислота и другие БАВ [2].

1.3 Методы извлечения фенольных веществ

Основной стадией пробоподготовки фенольных соединений является выделение из растительной матрицы для последующего анализа в сиситеме ВЭЖХ. Существуют разноообразные способы извлечения и экстракции фенольных компонентов, среди которых извлечение растворителем, Сокслет-экстракция, жидкость-жидкостная экстракция, твердофазная экстракция и другие.

Извлечение растворителем. Полярные антиоксиданты, также как и фенольные кислоты и гликозиды флавоноидов, экстрагируются водой или спиртом или смесью данных растворителей [7]. В большинстве случаев в качестве растворителей в данном способе используются метанол и ацетонитрил [8]. Jessica de Matos Nunes и др. использовали метанольный вариант экстракции в процессе подготовки растительного образца для определения хлорогеновой кислоты и флавоноидов в 13 видах зверобоя, произрастающих в южной Бразилии [7].

Что касается водной экстракции, то в ряде случаев она может оказаться более эффективной по сравнению с экстракцией органическими растворителями. В работе G. S. Cetkovic и др. для оценки антиоксидантных свойств календулы спектрофотометрическими методами сравнили суммарное содержание фенольных веществ в метанольном и водном экстрактах. Оказалось, что большее количество соединений данного класса в последнем варианте [9].

Сокслет-экстракция. Также известна так называемая Сокслет-экстракция, которая не часто используется для извлечения фенольных соединений. Однако в литературе встречаются примеры применения данного вида экстракции, среди которых работа G. Sagratini и др. [10]. Исследователи провели анализ хлорогеновой кислоты и флавоноидов восьми видов зверобоя. Экстракция целевых компонентов осуществлялась в аппарате Сокслета, используя смесь метанола и ацетона в течение 4 часов. Процентный выход в данном случае составил от 19.2% до 34.6%.

1.4 Методы экстракции фенольных веществ

Разнообразие фенольных соединений и их присутствие в растительных материалах наряду с продуктами общего обмена и вторичными метаболитами является основанием для предварительного фракционирования [2].

Наиболее распространенным методом экстракции является метод ЖЖЭ, который до недавнего времени был единственно возможным, когда речь шла об экстракции фенольных соединений. В последнее время развивается новое направление - ТФЭ -, реализуемая на основе полимеров с молекулярными отпечатками, сорбентов из модифицированных силикагелей и сверхсшитого полистирола, которая эффективна как на стадии экстракции, так и на стадии очистки, что также можно использовать для извлечения фенольных веществ из растительных материалов для последующего определения в системе ВЭЖХ-УФ.

Жидкость-жидкостная экстракция. В случае жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) разделение основано на распределении компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями, для чего обычно применяют этилацетат и диэтиловый эфир, возможно добавление небольшого количества кислоты.

Особенно примечательны результаты работ, в которых авторы проводят сравнение методов ТФЭ и ЖЖЭ. Так, G. Zgorka и S. Kawka [11] определяли фенольные кислоты в метанольных экстрактах элеутерококка (корни растения и фармпрепараты). Одновременно были использованы методы жидкость-жидкостной и ТФ экстракции. Как показали результаты исследования, метод ТФЭ является эффективным, особенно при определении хлорогеновой, феруловой, кофейной кислот, и имеет в ряде случаев большие значения степеней извлечения в сравнении с методом ЖЖЭ. Так, например, для хлорогеновой и феруловой кислот относительные степени извлечения (ЖЖЭ/ТФЭ) составляют 2.9 и 2.4 % соответственно.

Другие исследователи, B. Suаrez, A. Picinelli и J. Mangas [12], провели фракционирование фенольных соединений на патронах C18 (Extra-Sep, Sep-Pakclassic, Sep-Cartridge, метанол) из яблочного сусла и сидра. Приведены сравнительные результаты ТФЭ и ЖЖЭ, которые показали, что в случае ТФЭ степени извлечения составили от 111 до 84%, в то время как результаты ЖЖЭ в пределах от 82 до 64% и всего для четырех соединений, а остальные не были обнаружены. На основе полученных данных был сделан вывод о том, метод ТФЭ является достаточно простым и легким и более эффективным для суммарного определения основных представителей фенольных соединений.

Также стоит отметить в качестве недостатка ЖЖЭ по сравнению с методом ТФЭ больший расход растворителя и временные затраты [8].

Полимеры с молекулярными отпечатками. Относительно новой разновидностью ТФЭ является метод с применением полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО). Его отличительная особенность - высокая селективность сорбента по отношению к определяемому аналиту, а также высокая механическая и термическая устойчивость.

Так В. Кудринская, С. Дмитриенко и др. синтезировали полимеры с молекулярными отпечатками кверцетина и соответствующие полимеры сравнения с использованием акриламида и 2-(диметиламино)-метилметакрилата в качестве функциональных мономеров. На примере структурно родственных соединений проведена оценка селективности сорбента. Показано, что полимер на основе акриламида способен к селективной сорбции кверцетина, причем центры связывания кверцетина имеют преимущественно гидрофобный характер [13].

Однако основным недостатком ПМО является то, что полимер должен быть синтезирован для каждого конкретного случая, а также невозможность применения его для других аналитов. Это противоречит основному принципу определения широкого круга веществ в объекте одновременно [8].

1.5 Твердофазная экстракция

Особого рассмотрения требует метод твердофазной экстракции, широко используемый в последние десятилетия и применимый для сорбционного выделения и концентрирования полярных органических соединений, среди которых фенолы и фенолкарбоновые кислоты.

Наиболее распространенным вариантом ТФЭ является метод динамического офф-лайн концентрирования, при котором стадии пробоподготовки и идентификации аппаратно разделены. В этом методе анализируемый раствор пропускается через картридж, заполненный адсорбентом. При правильном подборе условий сорбции целевые компоненты пробы могут быть практически полностью извлечены из раствора в динамическом процессе [14].

В методе ТФЭ жидкость нагнетается в картридж различными способами, среди которых использование насоса (например, перистальтического) и вручную. На первой стадии целевые соединения поглощаются адсорбентом. Такая ситуация обеспечивает значительную гибкость адсорбционного метода подготовки пробы.

Так, адсорбент с целевыми соединениями может быть промыт подходящими растворителями для удаления ряда сопутствующих компонентов. При этом целевые соединения не должны «теряться», то есть элюироваться, или разрушаться в используемых средах [15]. Впоследствии десорбция сконцентрированных в офф-лайн методе аналитов осуществляется обработкой сорбента подходящим растворителем [14].

Использование офф-лайн концентрирования позволяет существенно сократить продолжительность и ресурсозатратность пробоподготовки.

1.5.1 Адсорбенты для твердофазной экстракции и адсорбционной очистки

Характеристика сорбента С18. В настоящее время особенно распространены случаи использования привито-фазных сорбентов, особенно с привитой фазой С18. Можно выделить следующие основные преимущества использования привитых сорбентов на основе силикагеля:

1 механическая устойчивость;

2 риск перехода привитой фазы в растворитель максимально снижен (если не протекают реакции, приводящие к химическому отщеплению привитой фазы);

3 устойчивость к воздействию растворителей, температуры, воды, рН;

4 быстрота установления равновесия при смене элюента, что обеспечивает возможность работы в градиентном режиме [16].

Основной недостаток силикагеля - малая химическая стойкость при рН<2 и рН>9 (кремнезем растворяется в щелочах и кислотах).

Наличие органического радикала -(CH₂)₁₇CH₃ на поверхности химически модифицированного силикагеля делает возможным его применение для разделения широкого круга органических веществ различной природы. Отличительной особенностью сорбента С18 является его высокая селективность по отношению к гомологам [17].

Характеристика сорбента ССПС. Сорбенты на основе сверхсшитого полистирола отличают высокоразвитая удельная поверхность, относительно маленький размер пор и выраженное сродство к полярным органическим соединениям. Также они устойчивы к физическим и химическим воздействиям и легко регенерируются [17].

Особенным свойством сверхсшитых полистиролов является их способность концентрировать аналиты не только из водных сред, но и из органических растворителей. Из метанола и ацетонитрила активно сорбируются неполярные аналиты [14]. Эффективность применения сорбента на основе сверхсшитого полистирола для одновременной экстракции фенольных кислот и флавоноидов подтверждена исследованиями B. S. Inbaraj и др. [18].

1.5.2 Адсорбционная очистка

Процесс пробоподготовки зачастую включает этап снижения содержания компонентов матрицы в пробе, которые могут помешать определению анализируемых веществ или стать источником загрязнения аппаратных узлов.

Стоит заметить, что в большинстве научных публикаций метод ТФЭ используется только на стадии очистки, а концентрирование либо не достигнуто, либо выполняется на последующих стадиях пробоподготовки, таких как выпаривание или сушка в токе азота, в процессе которых происходят дополнительные потери аналитов [6].

B. Inbaraj и др. предложили использовать картриджи Phenomenex Strata-X на полимерной основе именно на стадии очистки экстракта Lycium barbarum (в России- чапыжник, чилига, дереза обыкновенная) и определяли 53 представителя фенольного ряда. В качестве растворителя применяли метанол, определение веществ проводили в системе ВЭЖХ-УФ-ЭСИ-МС. Эффективность стадий экстракции и очистки была подтверждена значениями степеней извлечения кофейной, хлорогеновой, р-кумаровой кислот, рутина и каемфирола-3-O-рутинозида с использованием стандартных растворов этих веществ на уровне 90% для стадии экстракции этанолом и последующей очистки на полимерном картридже [18].

Так X. Lai и др. провели определение четырех фенольных веществ в биологических жидкостях методом ВЭЖХ с предварительной твердофазной экстракцией (Winchem TM C18-SPE картридж, China). Выяснилось, что твердофазная экстракция позволяет получить более чистый экстракт и устраняет большинство проблем при переводе его в состояние эмульсии, с которыми приходится сталкиваться при использовании жидкость-жидкостной экстракции, и твердофазное концентрирование в сочетании с ВЭЖХ является простым и надежным методом. Значения степеней извлечения составили от 75.8 до 111.4 % [19].

С другой стороны, R. Govindarajan, D. Singh, A. Rawat использовали SAMPREP RP18 картриджи также на стадии очистки экстракта «ЧАВАНПРАШ» (уникального натурального продукта, изготовленного из 50 лекарственных трав и природных минералов по старинному рецепту), содержащего ряд веществ фенольной группы (кофейная кислота, кверцетин, галловая кислота, рутин и др.), в качестве растворителя использовали метанол. Анализ проводили в системе ВЭЖХ с диодной матрицей. Значения степеней извлечения составили от 89.79 до 97.86% [20].

1.5.3 Методы оценки эффективности процедуры ТФЭ

Важным понятием, применяемым для оценки эффективности стадии адсорбции на концентрирующих картриджах, является понятие «проскока». График зависимости концентрации исследуемого вещества в фильтрате от объема, пропускаемого через картридж жидкого образца, называется «кривой проскока». Обычно она имеет S-образную форму с достаточно резким подъемом концентрации аналита в области насыщения им картриджа. Объемом «до проскока» принято считать тот объем пропускаемого образца, при котором концентрация аналита в фильтрате достигает 5% от его концентрации в исходном растворе. Значения объемов «проскока» справедливы лишь для тех условий, в которых они определены [14].

На практике, когда через картридж пропускается реальный жидкий образец или первоначальный экстракт со сложной матрицей, наблюдаемые значения объемов пробоя могут оказаться значительно ниже «идеальных», что обусловлено конкуренцией доминирующих компонентов матрицы с адсорбцией аналитов. Другими словами, при повышенных концентрациях сорбируемых соединений насыщение сорбента в картридже наступает раньше, и объем проскока соответственно уменьшается [14].

Эффективность ТФЭ также включает в себя эффективность сорбции интересующего компонента из раствора матрицы и эффективность последующей десорбции данного компонента. Суммарная эффективность экстракции, или степень извлечения (R) i-го компонента пробы по ходу всех проделанных операций, может быть рассчитана по формуле: R = q_i /Q_i , где q_i - количество i-го компонента, извлеченного из матрицы; Q_i - количество i-го компонента в матрице. Эта величина должна быть учтена в первую очередь при проведении количественного определения интересующих компонентов. Для повышения степени очистки и понижения предела обнаружения концентрируемых соединений необходимо стремиться к максимальной эффективности ТФЭ, в связи с чем особое значения приобретают методические аспекты процедуры пробоподготовки [21].

1.5.4 Факторы, влияющие на параметры сорбции

На основе литературного обзора стало ясным, что традиционный подход к подбору оптимальных условий, основанный на варьировании параметров экстракционного процесса, таких как растворитель, рН, время и др., не привел до сих пор к их универсальному сочетанию, и исследования в этом направлении могут быть продолжены. В большинстве случаев применение патронов на этапе пробоподготовки сопровождается понижением рН раствора до 2.00, но авторы не дают обоснования этому, а в редких случаях находят лишь теоретическое объяснение данному действию. Имеются данные об изучении зависимости степени извлечения фенольных веществ от рН в работе Qian Liu и др. [6], которые провели определение семи фенольных веществ в речной воде с помощью ВЭЖХ с предварительным концентрированием на сорбенте XAD-4 (стирол-дивинилбензол). Установили, что наибольшая степень извлечения кофейной кислоты, рутина, кверцетина и др. веществ достигается только в пределах рН от 2.5 до 4.0, после чего значение этого показателя падает. Исследования проводились в статическом режиме. Таким образом, вопрос о влиянии уровня рН раствора на параметры сорбции, в частности десорбцию компонентов и их степени извлечения, в динамическом режиме остается открытым и требует дальнейшего изучения.

1.5.5 Твердофазная экстракция как метод разделения и концентрирования фенольных соединений

Методы анализа фенольных веществ можно классифицировать по двум признакам: определение суммарного содержания фенолов и количественное определение индивидуальных компонентов или групп фенольных соединений, обладающими общими специфическими свойствами. Но независимо от метода анализа, вещества фенольной природы должны быть экстрагированы из их первоначального источника [22]. Процесс экстракции из растительных материалов в этом случае зависит от многих факторов, среди которых метод экстракции, природа фенольного соединения, гранулометрический состав, мешающее влияние и др. Однако экстракты обычно представляют собой смесь различных классов фенольных соединений. Поэтому необходимым является этап отделения нежелательных фенольных компонентов и веществ нефенольной природы (парафины, жиры, хлорофилл). Для этих целей повсеместно используется фракционное разделение с использованием твердофазной экстракции [22].

Основная цель работы Michalkiewicz и др. [23] заключалась в детальном исследовании процесса твердофазной экстракции фенольных кислот (галловой кислоты, p-кумаровой кислоты, кофейной кислоты и др.) и некоторых флавонолов (рутина, кверцетина и др.), содержащихся в меде. Установлено, что сорбент на основе С18 (Bond Elut) менее всего подходит для выделения и концентрирования данных веществ. Однако, некоторые полифенольные соединения, например кверцетин и рутин, имеют в этом случае достаточно высокую степень извлечения. Сорбенты на основе полимерных структур дивинилбензола и N-винилпирролидон (Oasis HLB), а также полистирола-дивинилбензола (Strata-X) показали лучшую способность при извлечении фенольных веществ, что объясняется их ароматической структурой, которая может сорбировать ароматические фенольные кислоты путем р-р взаимодействия. Так, степень извлечения галловой кислоты (более 60%) и 4-гидроксибензойной кислоты (более 80%) была достигнута только с применением полимерной структуры дивинилбензола и N-винилпирролидона.

Boguslaw Buszewski и др. [24] изучили процесс одновременного выделения рутина и эскулина из растительных материалов и препаратов, используя твердофазную экстракцию. Исследователями был выбран подход, при котором варьированию подвергали свойства неподвижной фазы. Для изучения были выбраны твердофазные колонки с различными химически связанными фазами, содержащими полярные и неполярные функциональные группы. В ходе исследования были получены изотермы сорбции, анализ которых показал, что для рутина наибольшая сорбционная способность достигается на неполярных сорбентах, преимущественно на С18, а для эскулина это же наблюдается на сорбентах, содержащих фенольные группы. Для обоих веществ высокая сорбционная способность отмечалась при использовании полярных сорбентов, содержащих NH₂, CN и диольную группы. Также были получены данные процентного извлечения рутина и эскулина с использованием сорбентов различной полярности и установлено, что для обоих соединений высока степень извлечения на всех типах сорбентов (более 90%), только для Ph-сорбентов она чуть ниже и составляет 88.1-89.3 %.

О. Медведева и др. предложили методику динамического сорбционного концентрирования фенолкарбоновых кислот с последующим их определением методом капиллярного зонного электрофореза с предварительным их концентрированием на микроколонке, заполненной ССПС MN-200. Установлено, что степень извлечения кофейной и галловой кислот составляет 60% и 70% соответственно, а также что количественное извлечение фенолкарбоновых кислот, сорбирующихся на ССПС, может быть достигнуто из водных растворов, не превышающих 30 мл, что следует из выходной динамической кривой. Максимальным сродством к поверхности ССПС обладают наиболее гидрофобные коричная и салициловая кислоты [25].

Из приведенных данных видно, что эффективность метода сорбционного извлечения подтверждается многочисленными экспериментальными исследованиями, что позволяет использовать его в процессе пробоподготовки растительных материалов для последующего анализа.

1.6 Методы определения фенольных соединений

Идентификация фенольных соединений. Идентификация данных веществ основана на хроматографических методах (хроматография на бумаге и тонкослойная), спектральных исследованиях, качественных реакциях и масс-спектрометрическом изучении продуктов расщепления. Но для идентификации фенольных соединений в большинстве случаев пользуются спектрами их поглощения в ультрафиолетовой области (220-400 нм). Все фенолы имеют выраженную хромофорную систему, поэтому их спектры информативны и обеспечивают существенную информацию о структуре, дающую возможность определить тип фенола [26]. Например, флавоны и флавонолы обладают примерно равной интенсивностью поглощения в области около 250-350 нм. Наличие заместителей определяет положение УФ-спектра фенольных соединений также, как и наличие кольца В или А [2]. УФ-спектр флавоноидов характеризуется, как правило, двумя максимумами поглощения. Так флавоны и флавонолы обычно имеют сильную полосу поглощения при 320-380 нм (полоса I) и при 240-270 нм (полоса II). Положение и интенсивность максимумов зависят от дальнейших структурных различий. В флаванонах цикл В не сопряжен с карбонильной группой, поэтому они обнаруживают наиболее сильное поглощение в области 270-290 нм (полоса II), тогда как полоса I образует уступ некоторой интенсивности при 320-330 нм. Спектры кумаринов содержат две главных полосы при 278 и 310 нм, а у их гидроксильных производных главный максимум расположен выше 300 нм [27].

ИК-спектроскопия, позволяющая обнаружить ряд характерных группировок, меньше распространена в исследовании фенольных соединений, но может быть применена для изучения строения флавоноидных гликозидов [2].

Полуколичественные методы определения фенольных соединений. Известен ряд методов полуколичественного суммарного определения фенольных соединений. Чаще применяются следующие:

1 спектрофотометрический метод с использованием реактива Фолина-Дениса;

2 весовой метод с применением кожного (гольевого) порошка;

3 титриметрический метод Левенталя.

Включают также потенциометрическое титрование в неводных растворителях (диметилформамид) с применением катоднополяризованного платинового электрода и метод комплексонометрического титрования свинца в осаждаемых соединениях раствором трилона Б в среде ацетатного буфера в присутствии металлиндикатора ксиленолового оранжевого [28].

Флавоноиды способны восстанавливаться на ртутно-капельном катоде, что использовано для полярографического определения их в растительном сырье. Однако потенциалы полуволн различных флавоноидов мало отличаются, в связи с чем этим способом определяют только общее содержание флавоноидов. Чувствительность определения по сравнению с фотоколориметрическими методами недостаточна (2-4 мг в 10 мл раствора). Также имеются указания на отсутствие достаточной воспроизводимости полярографического метода из-за образования различных таутомерных форм флавоноидов [28].

Спектрофотометрические методы. Флавоноиды обладают интенсивностью поглощения в УФ области спектра с наличием максимумов, относящихся к первой (320-380нм) и второй полосе поглощения (240-270 нм). Эти спектральные свойства использованы для разработки спектрофотометрических методов определения флавоноидов. Так, Данилова и Попов осуществили количественное определение дубильных веществ в корнях щавеля конского методом спектрофотометрии в сравнении с методом перманганатометрии и доказали большую точность первого [29]. Однако ввиду близости положения абсорбционных максимумов различных флавоноидов для анализа их смесей, а также при наличии других веществ необходимо предварительное хроматографическое разделение на бумаге или полиамиде [28].

Фотоколориметрические методы. Различают колориметрические методы, основанные на реакциях комплексообразования, восстановления в кислой среде, диазосочетания и др. [28]. Так, Земцова и Дмитриев [30] использовали спектрофотометрическую методику, основанную на измерении оптического поглощения этанольного раствора флавоноидов в максимуме поглощения рутина при длине волны 362,5 нм с использованием в качестве стандартного раствора рутина. Эта же методика была применена для фотоколориметрического определения с использованием светофильтра с максимумом пропускания 364±5. Авторы применили фотоколориметрическое определение с использованием антоцианидиновой реакции. Методика основана на восстановлении флавоноидов магнием в присутствии HCl в спиртовом растворе и последующем фотометрировании полученного раствора. Применение антоцианидиновой реакции несколько повышает точность метода, но при этом увеличиваются ошибка метода и время определения. Важнейшим аспектом является то, что данные методы дают завышенные результаты по сравнению с хроматоспектрофотометрией, вследствие мешающего поглощения сопутствующих экстрактивных веществ.

Методы, основанные на реакциях комплексообразования. Флавоноиды, являясь полифенольными соединениями, способны образовывать с различными катионами металлов, а также с борной кислотой растворимые окрашенные комплексы. Это свойство обусловлено наличием следующих комплексообразующих группировок:

Прочность комплексов зависит от значения pH растворов, растворителя, соотношения компонентов и природа металла. Для определения флавоноидов используются комплексы флавоноидов с хлористым цирконием, хлористой сурьмой, солями титана, ионами хрома, молибдатом аммония, комплексы флавоноидов с борной кислотой и с ионами других металлов [28]. Так, флавоноиды реагируют с хлоридом алюминия с образованием желтого окрашивания или желто-зеленой флюоресценции. Интенсивность окрашивания измеряют спектрофотометрически при 340-420 нм. Известно, что реакция с хлоридом алюминия применялась для определения рутина в растительном сырье. Однако, ввиду близости абсорбционных максимумов комплексов флавоноидов с ионом алюминия реакция недостаточно специфична. Поэтому метод применяется только после бумажно-хроматографического разделения флавоноидов. Реакция непригодна для определения изофлавонов и флаванонов [28].

Капиллярный электрофорез. Капилярный зонный электрофорез в связи с его простотой, экспресностью и эффективностью широко используется наряду с высокоэффективной жидкостной хроматографией [25]. Например, Фернандес де Симон, Эстела и Хернандес провели определение стандартных флавонолов методом высокоэффективного капиллярного электрофореза. Ими были отмечены высокая чувствительность и воспроизводимость, быстрота проведения анализа, экономичность [31]. А также Кристо, Ганзлер и др. провели анализ с помощью капиллярного электрофореза и определили с хорошей точностью содержание флавоноидов в лекарственных растениях [32].

Хроматографические методы. Для анализа фенольных соединений применяется хроматография на бумаге, а также тонкослойная хроматография, имеющая ряд преимуществ, в числе которых высокая скорость процесса разделения и компактность пятен на бумаге. В качестве сорбентов в тонкослойной хроматографии используются силикагель, полиамид и целлюлоза. Для разделения флавоноидных гликозидов на силикагеле с добавкой гипса пригодны полярные смеси растворителей. При тонкослойной хроматографии на полиамиде, используя смесь метанол - ледяная уксусная кислота - вода, становится возможным разделить гликозиды флавонов, флавонолов, флавононов и изофлавонов. Так, А.А.Маркарян и А.А. Абрамов провели анализ сухого экстракта «Нефрофит» методом тонкослойной хроматографии и обнаружили в составе кверцетин, кофейную кислоту, гесперидин, рутин и другие фенольные соединения [2]. Dragant Velikovic и другие исследовали методом тонкослойной хроматографии растения, применяемые в традиционной медицине - Salvia officinalis L. и Salvia glutinosa L., и определили наличие в них флавоноидов [33].

Ионообменная хроматография не имеет широкого применения в изучении фенольных соединений, что связано с их необратимой адсорбирбцией и окислением на анионообменниках. Распределительная хроматография нашла применение при разделении на составляющие компоненты сложных природных комплексов фенольных соединений. Например, Брэдфилдом успешно был осуществлен процесс разделения катехинов цейлонского чая [2]. Распространен метод противоточного распределения, а также в биохимии - метод гель-фильтрации [2]. Перспективной является также адсорбционная хроматография. Появление многочисленных сорбентов определило возможность успешного разделения большинства фенольных соединений.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Потребности химических и естественных наук в 60-80 годах XX века определили появление кардинально нового направления - высокоэффективной жидкостной хроматографии. Важнейшее свойство ВЭЖХ по сравнению с газовой хроматографией - возможность исследования практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам, например, по температурам кипения или молекулярной массе. Изучение существующих способов разделения, определения и анализа фенольных соединений позволило сделать обоснованный вывод о том, что ВЭЖХ - современный метод их определения, позволяющий добиться наилучших результатов [16]. Например, W. Zheng и др. [4] определили содержание фенольных соединений в 27 кулинарных и 12 лекарственных травах методом ВЭЖХ с УФ детектированием. В качестве подвижной фазы использовалась градиентная система ацетонитрил - муравьиная кислота. Детектирование проводилось при 280, 330, 350 нм. Среди определенных соединений - кофейная, ванилиновая кислоты, нарингин, кверцетин.

Для детального изучения компонентного состава фенольных соединений травы шалфея мутовчатого В. Н. Бубенчикова и др. [34] применяли метод ВЭЖХ. Рабочая длина волны 254 нм. Идентификацию разделенных веществ проводили путем сопоставления времен удерживания пиков, полученных на хроматограмме пробы со временами удерживания стандартных растворов (РСО). В результате в траве шалфея мутовчатого обнаружено 27 веществ фенольной природы, из них впервые - умбеллиферон, галловая кислота, хлорогеновая кислота, эпикатехин, кофейная кислота, цикоревая кислота, феруловая кислота, розмариновая кислота, кверцетин, лютеолин, скополетин, кемферол.

Согласно литературному обзору, из известных методов анализа фенольных соединений наиболее часто применяемый, надежный метод ? обращено-фазовая ВЭЖХ с градиентным элюированием с уменьшением полярности. Подвижная фаза обычно содержит водный компонент и менее полярный органический растворитель (ацетонитрил, метанол). Идентификация в ВЭЖХ-анализе обычно базируется на соответствии времени удерживания исследуемого фенольного соединения и подходящего стандарта Чаще всего детектирование в ВЭЖХ основывается на измерении УФ спектра и спектра в видимой области [26]. Из приведенных данных видно, что методы, применяемые для определения фенольных веществ разнообразны, информативны. Но на наш взгляд ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием повышает эффективность за счет предварительного разделения и последующего детектирования одновременно. Это позволяет с достаточной надежностью идентифицировать и количественно определять все фенольные вещества в смеси.

1.7 Сочетание ТФЭ и ВЭЖХ-анализа для определения фенольных соединений

фенольный твердофазный экстракция растительный

Использование эффективной процедуры твердофазной экстракции в сочетании с УФ-детектированием делает метод ТФЭ-ВЭЖХ чувствительным, воспроизводимым. ТФЭ-ВЭЖХ превосходит по своим характеристикам традиционные методики, используемые для определения фенольных соединений в растительных материалах и фармацевтических препаратах, что подтверждается многократными исследованиями [11]. В таблице 9 приведены некоторые примеры использования сочетания ТФЭ и ВЭЖХ для анализа фенольных веществ.

Таблица № 9 -Примеры ТФЭ-ВЭЖХ процедуры определения фенольных соединений

1.8 Выводы к аналитическому обзору и постановка задач исследования

Растительные материалы в своем составе содержат биологически активные вещества различных типов, в частности фенольной и полифенольной природы, которые обладают уникальными свойствами, обеспечивающими широкое применение лекарственных растений в фармакологии. Анализ литературных данных показал, что исследование растительных антиоксидантов не имеет на сегодняшний день достаточной и однозначно определенной базы данных и может быть подвергнуто дальнейшему изучению. Поэтому одной из задач работы является установление фенольного состава лекарственных образцов различного происхождения.

Также на основе литературного обзора становиться ясным, ВЭЖХ-анализ не заменим при определении малых количеств веществ в образцах с комплексной матрицей, таких как неочищенные растительные экстракты и другие образцы природного происхождения. Очевиден тот факт, что обращено-фазовый вариант ВЭЖХ признан эффективным способом разделения веществ фенольной природы. При этом, УФ-детектирование является оптимальным, так как диодная матрица в качестве детектора обеспечивает высокое разрешение и повышает надежность идентификации за счет возможности одновременного получения хроматографических параметров и спектральных характеристик компонентов. На основе данного вывода можно утверждать, что в задачи исследования также входят количественное определение и идентификация фенольных компонентов в составе растительных материалов.

Очищение и концентрирование фенольных веществ является ключевым моментом инструментального анализа и осуществляется на высокоэффективных сорбентах. В то же время, это связано с рядом сложностей в виду того, что экстракция фенольных веществ из растительных материалов зависит от большого числа факторов, среди которых, природа веществ, размер молекул, условия и время процессов сорбции-десорбции, а также матричный состав образца. Поэтому для определения их низких содержаний и увеличения селективности на стадии пробоподготовки применяют предварительное сорбционное извлечение, в частности метод твердофазной экстракции. Успешное использование ТФЭ связано с появлением коммерчески доступных полимерных адсорбционных материалов нового типа, сочетающих высокую емкость, механическую прочность, химическую стабильность.

Важным преимуществом ТФЭ является снижение содержания компонентов матрицы в пробе, что особенно актуально для растительных материалов, в составе которых, наряду с фенольными соединениями, присутствуют смолы, воски, каротиноиды, хлорофилл, липиды, терпены, алколоиды, сапонины и другие вторичные метаболиты.

Задачей данной работы является оптимизация условий твердофазного извлечения фенольных веществ из объектов растительного происхождения.

2. Экспериментальная часть и обсуждение результатов

2.1 Исходные реактивы, материалы и используемая аппаратура

Для выполнения экспериментальных исследований использовались следующие средства измерений, устройства, реактивы, материалы:

Хроматограф Shimadzu LC 20 Prominence c диодной матрицей;

Колонка Zorbax SB C18, 1502,1 мм, 5 мкм (Agilent);

Перистальтический насос ЛАБ-НП-1-20М по ТУ-4211-001-44330709-2000;

Концентрирующие патроны ДИАПАК С18, ДИАПАК П;