Сорбционное извлечение и ВЭЖХ-определение фенольных веществ в растительных материалах

Весы аналитические «Adventurer» по ГОСТ 16474-74;

Баня водяная;

Электроплитка бытовая «Искорка,Вятка» по ГОСТ 14919-83;

Колбы мерные вместимостью 50, 100, 250, 500 см³ по ГОСТ 1770-74;

Стаканы химические вместимостью 50 см3 по ГОСТ 1770-74;

Воронки конические стеклянные;

Цилиндры мерные с носиком вместимостью 10,25 см3по ГОСТ 1770-74;

Стаканчики для взвешивания (бюксы) по ГОСТ 25336--82;

Фильтр Millipore, 0,22 мкм;

Фильтр Corning SFCA 0.45 мкм;

Одноканальные механические дозаторы «Biohitproline» с варьируемым объемом дозирования 5-50 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл, 1-5 мл;

Вата медицинская по ГОСТ 5556-75;

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

Азот, осч.

Ацетонитрил, сорт 0, « Криохром»

Дигидрофосфат калия по ГОСТ 4198-75;

Ортофосфорная кислота по ГОСТ 6552-80;

Галловая кислота («Сигмабиосинтез») 99%;

Кофейная кислота («Сигмабиосинтез») 99%;

Кверцетин («Сигмабиосинтез») 99%;

Рутин («Сигмабиосинтез») 99%;

Зверобой продырявленный, тысячелистник обыкновенный, календула аптечная, кора дуба («Фитофарм», Анапа).

Условия проведения анализа были подобраны ранее [44]:

С помощью программного обеспечения LC Shimadzu для хроматографа устанавливают параметры инструмента для градиентного элюирования: подвижная фаза А - ацетонитрил, подвижная фаза В - фосфатный буфер; система элюирования имеет следующий вид:

1 ступень - 3 минуты ацетонитрил 3%;

2 ступень - 1 минута ацетонитрил 3-10%, 4 минуты 10% ацетонитрил;

3 ступень - 2 минута ацетонитрил 10-20%, 3 минуты 20% ацетонитрил;

4 ступень - 1 минута ацетонитрил 20-40%, 11 минут 40% ацетонитрил.

ВЭЖХ временная программа представлена в таблице 10.

Таблица 10 - ВЭЖХ временная программа

	Время	Модуль	Действие	Объем В
	0.01	Controller	Start
	0.02	Pumps	B.Conc	97
	0.02	Autosampler	Inject
	3.00	Pumps	B.Conc	97
	4.00	Pumps	B.Conc	95
	8.00	Pumps	B.Conc	95
	15.00	Pumps	B.Conc	80
	18.00	Pumps	B.Conc	80
	25.00	Pumps	B.Conc	60
0	28.00	Pumps	B.Conc	60
1	28.01	Pumps	B.Conc	97
2	40.00	Controller	Stop

Устанавливают:

1 параметры получения данных: - Частота сбора данных - 6,25 Гц

2 Параметры насоса:

- режим - Low pressure gradient

- соленоидный кран насоса А - LPGE

- насос А общий - 0,25 мл/мин

- раствор В 97,0%

- предельное давление (насос А) максимум - 20 МПа;

- предельное давление (насос А) минимум - 0 МПа.

3 параметры диодной матрицы:

- лампа D2;

- ширина щели - 1,2 нм;

- начальная длина волны - 190 нм;

- конечная длина волны - 390 нм;

- температура ячейки - 30° С.

4 параметры термостата колонок:

- температура - 30° С.

5 параметры автодозатора:

- модель - SIL-20A

- держатель - Rack 1.5ml Standart

- объем: 30 мкл

- глубина погружения иглы(N) - 52 мм

- глубина погружения иглы в виалу - 52 мм

- скорость - 35 мкл/сек

- скорость ввода - 15 мкл/сек

- время промывки (Т) - 3 мин

- режим промывки (А) -« Before aspiration»

- время быстрой промывки - 8 сек

6 автопромывка:

- очистка насоса - PUMPA: LC-20AD

- промывка автодозатора - 25 мин

- время ожидания - 0 мин

- насос А общий - 1.0000 мл/мин

Обработка первичных данных и расчеты проводились в среде программы LC Solution.

2.2 Приготовление рабочих растворов

Приготовление фосфатного буфера (элюента В). Для приготовления 0,04 М раствора дигидрофосфата калия на аналитических весах взвешивают 2,7000г дигидрофосфата калия, переносят в колбу вместимостью 500 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят ортофосфорной кислотой до рН 2,80±0, 01. Раствор фильтруют через фильтр Millipore. Раствор перемешивают.

Приготовление стандартного раствора галловой кислоты с концентрацией 0,1 г/л. Навеску 5 мг галловой кислоты помещают в колбу объемом 50 мл, приливают ацетонитрил и доводят до метки. Затем раствор помещают в емкость для хранения кислоты.

Приготовление стандартного раствора кофейной кислоты с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1 г/л навеску 10 мг кофейной кислоты помещают в колбу объемом 100 мл, приливают ацетонитрил и доводят до метки. Затем раствор помещают в емкость для хранения кислоты.

Приготовление стандартного раствора кверцетина с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1г/л навеску 10 мг кверцетина помещают в колбу объемом 100 мл, приливают ацетонитрил и доводят до метки. Затем раствор помещают в емкость для хранения кислоты.

Приготовление стандартного раствора рутина с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1г/л навеску 10 мг рутина помещают в колбу объемом 100 мл, приливают ацетонитрил и доводят до метки. Затем раствор помещают в емкость для хранения кислоты.

Приготовление водного раствора галловой кислоты с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1 г/л навеску 20 мг галловой кислоты помещают в колбу объемом 200 мл, приливают дистиллированную воду и доводят до метки.

Приготовление водного раствора кофейной кислоты с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1 г/л навеску 20 мг кофейной кислоты помещают в колбу объемом 200 мл, приливают дистиллированную воду и доводят до метки.

Приготовление водного раствора рутина с концентрацией 0,05 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,05 г/л навеску 12,5 мг кверцетина помещают в колбу объемом 250 мл, приливают дистиллированную воду и доводят до метки.

Приготовление отвара лекарственного сырья. Навеску сырья («Фитофарм», Анапа) 2,0000г помещают в коническую колбу (500 мл), заливают горячей дистиллированной водой, накрывают воронкой и ставят на кипящую водяную баню на 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры раствор фильтруют через вату в мерную колбу на 250 мл, сырье промывают водой несколько раз, доводят водой до метки. Затем раствор перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр Corning SFCA с диаметром 0.45 мкм.

2.3 Оптимизация условий пробоподготовки отвара лекарственного растительного сырья для ВЭЖХ-анализа

В зависимости от метода к качеству пробы предъявляют следующие требования:

1 концентрация определяемых компонентов в пробе должна быть достаточной для их надежной идентификации и количественного определения;

2 концентрации в пробе веществ, мешающих определению и приводящих к загрязнению узлов оборудования, должны быть снижены до приемлемого уровня [14].

Чтобы проба отвара лекарственного сырья соответствовала данным требованиям, решено было на стадии пробоподготовки использовать патроны, заполненные сорбентами двух типов: на основе силикагеля с привитой фазой С18 и ССПС (таблица 11).

Таблица 11 - Параметры сорбентов

Марка патрона	Размер частиц, мкм	Диаметр пор, Е	Краткая характеристика сорбента
ДИАПАК С18	40-63	60	Гидрофобный сорбент с привитыми октадецильными группами
ДИАПАК П	50-100	10-1000	Гидрофобный сорбент на основе сверхсшитого полистирола

Исходя из того, что чаще всего для извлечения фенольных веществ используются метанол и ацетонитрил в качестве растворителей [45,8], последний был выбран нами на стадии пробоподготовки. Это обеспечит максимальную эффективность последующего ВЭЖХ-анализа пробы.

Адсорбционная очистка с помощью твердофазной экстракции. Важным преимуществом ТФЭ является снижение содержания компонентов матрицы в пробе, что особенно актуально для растительных материалов, в составе которых, наряду с фенольными соединениями, присутствуют смолы, воски, каротиноиды, хлорофилл, липиды, терпены, алкалоиды, сапонины и другие вторичные метаболиты.

В ходе наших исследований также была показана эффективность использования патронов на стадии очистки, что иллюстрирует хроматограмма, полученная методом ГХ-МС (рисунок 1-2). Полученный водный отвар тысячелистника обыкновенного пропускали через патрон Диапак С18, десорбировали компоненты 30 мл ацетонитрила, затем элюат сушили в токе азота и растворяли сухой остаток в 1 мл ацетонитрила.

(Колонка HP-Ultra 2 25 м х 0.32 мм, 0.52 мкм; Газ-носитель - гелий; Деление потока 1:5; Скорость потока 2.13 мл/мин)

Рисунок 1 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного

(Колонка HP-Ultra 2 25 м х 0.32 мм, 0.52 мкм; Газ-носитель - гелий; Деление потока 1:5; Скорость потока 2.13 мл/мин)

Рисунок 2 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного после очистки на патроне С18

Видно, что после пропускания отвара через сорбент С18 большая часть сопутствующих веществ, например, сахаров, удерживается на патроне. Это позволяет улучшить хроматографический профиль.

Установление параметров сорбционного процесса. Сорбцию фенольных соединений изучали на примере галловой и кофейной кислот, как основных представителей бензойных и коричных кислот соответственно, и кверцетина - представителя флавоноидов. Параметры градуировочных зависимостей были установлены ранее [46]. Для оптимизации количественного извлечения определяемых компонентов при минимальном объеме элюента была изучена десорбция тех же 3-х веществ. Предварительно через патрон пропускали по 1 мл растворов галловой и кофейной кислот и кверцетина в ацетонитриле с концентрацией 100 мкг/мл. Вещества элюировали из патрона ацетонитрилом со скоростью 1 мл/мин. Эффективность десорбции контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, анализируя содержание определяемого компонента в каждой фракции десорбата. В результате были получены величины степеней извлечения каждого компонента (таблица 12). Из полученных результатов видно, что галловая и кофейная кислоты достаточно хорошо извлекаются как одним, так и на другим сорбентом. В то же время для извлечения кверцетина более приемлемым является сорбент С18.

Таблица 12 -Степени извлечения фенольных веществ

Соединение	Диапак С18	Диапак П (ССПС)
	R, %	R, %
Галловая кислота	82.8±5.0	80.6±6.0
Кофейная кислота	71.2±7.0	67.0±6.0
Кверцетин	98.9±1.7	63.7±7.0

Различное поведение веществ на сорбентах, модифицированных С18, наблюдается из-за отличий во взаимодействиях между сорбирующим материалом и аналитами. Механизм их десорбции вероятно зависит от взаимодействия между остаточными силанольными группами Si-OH на поверхности силикагеля и адсорбированными компонентами. Остаточные полярные группы нейтрализуются, что снижает десорбируемость компонентов и, как следствие, приводит к уменьшению значений степеней извлечения [47].

С другой стороны, неудовлетворительная степень извлечения кверцетина с сорбента на основе ССПС по сравнению с сорбентом С18, по-видимому, связана с наличием дополнительных индукционных взаимодействий между матрицей сорбента и сорбируемым компонентом, что обусловлено подобием их химической природы.

Сравнительная характеристика способов извлечения фенольных веществ. Изучив характер поведения основных представителей фенольного ряда на данных сорбентах, перешли к сравнительному анализу способов пробоподготовки: с использованием патронов С18, ССПС и традиционной экстракции этилацетатом из водных отваров тысячелистника обыкновенного и зверобоя продырявленного.. Полученные водные отвары пропускали через соответствующие патроны, десорбировали компоненты 5 мл ацетонитрила, затем элюат сушили в токе азота и растворяли сухой остаток в 1 мл ацетонитрила. Одновременно проводили жидкость-жидкостную экстракцию этилацетатом. Результаты хроматографирования представлены на рисунках 1-8 Приложения А. Оценку эффективности методов пробоподготовки проводили для зверобоя продырявленного по трем основным компонентам: рутин, (-)-эпикатехин, протокатеховая кислота; и по шести компонентам для тысячелистника обыкновенного: кофейная кислота и пять соединений группы коффеоилхинных кислот. Количественное содержание вышеуказанных соединений определяли по внешнему стандарту - феруловой кислоте (таблица 13,14).

Таблица 13 -Содержание фенольных соединений в зверобое продырявленном

Название вещества	Отвар	С 18	ССПС	Этилацетатная экстракция
	m, мг/г	m, мг/г	R, %	m, мг/г	R, %	m, мг/г	R, %
Рутин	5.09±0.07	2.50±0.02	49.1	0.09±0.01	1.8	0.41±0.02	8.1
(-)-Эпикатехин	0.78±0.02	0.66±0.02	85	?	?	0.30±0.04	38.5
Протокатеховая кислота	0.29±0.04	0.31±0.06	104	?	?	0.30±0.04	103

Таблица 14 -Содержание фенольных соединений в тысячелистнике обыкновенном

Название вещества	Отвар	С 18	ССПС	Этилацетатная экстракция
	m, мг/г	m, мг/г	R, %	m, мг/г	R, %	m, мг/г	R, %
Кофейная кислота	0.108±0.004	0.10±0.03	92.6	0.075±0.006	69.4	0.098±0.002	90.7
5-О-кофеоилхинная кислота	0.27±0.02	0.22±0.01	81.5	0.11±0.03	40.7	?	?
3-О-кофеоилхинная кислота	2.7±0.3	2.03±0.01	76.3	0.9±0.1	32.7	0.010±0.002	0.4
3,4-О-дикофеоилхинная кислота	0.83±0.06	0.67±0.05	80.7	0.31±0.01	37.3	0.08±0.01	9.6
Лютеолин	1.5±0.1	1.0±0.1	66.7	0.43±0.02	28.7	0.53±0.06	35.3
Неидентифициро-ванное соединение	1.22±0.05	0.8±0.2	63.1	0.31±0.01	25.4	0.26±0.01	21.3

Из полученных данных можно сделать вывод, что применение сорбента С18 для пробоподготовки является оптимальным и может быть реализовано в рамках ВЭЖХ-анализа. Сорбент Диапак С18 был выбран в качестве объекта дальнейших исследований.

Величина рН как основной параметр сорбционного процесса. Одним из важнейших факторов, влияющих на процессы сорбции-десорбции является уровень рН среды. Нахождение фенольных веществ в молекулярной или ионной форме определяет их поведение на октодецилсилане. Таким образом, необходимым представлялось изучить влияние рН на степень извлечения фенольных компонентов. Предварительно готовились водные растворы галловой, кофейной кислот и рутина с концентрацией 25 мкг/мл, рН варьировали в пределах от 4.00 до 2.00 с шагом 0.5. Затем 1 мл раствора с заданным значением рН пропускали через патрон, заполненный сорбентом С18. Вещества элюировали из патрона ацетонитрилом со скоростью 1 мл/мин. Эффективность десорбции контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. На основании полученных данных были определены степени извлечения обеих кислот и рутина в зависимости от величины рН. Как видно из полученных диаграмм (рисунок 3-5), оптимальным для галловой, кофейной кислот и рутина является значение рН, равное 3. При этом значении для всех трех веществ наблюдаются максимальные степени извлечения: 99,5±6, 106±7, 103±7 % соответственно.

Рисунок 3 - Зависимость степени извлечения от рН для галловой кислоты



Рисунок 4 - Зависимость степени извлечения от рН для кофейной кислоты

Рисунок 5 - Зависимость степени извлечения от рН для рутина

Высокие значения степеней извлечения при пониженном уровне рН свидетельствует о подавлении диссоциации фенольных соединений, что повышает их сродство к неполярному сорбенту. Однако при рН<2.5 наблюдается снижение количества извлекаемого аналита, что объясняется малой химической стойкостью силикагеля при низких величинах рН.

Кривые десорбции фенольных соединений. Для оптимизации количественного извлечения определяемых компонентов при минимальном объеме элюента была изучена десорбция тех же 3-х веществ при варьировании рН растворов (рисунок 6).



а в

с

Рисунок 6 - Кривые десорбции галловой кислоты (а), кофейной кислоты (в) и рутина (с) при различных значениях рН

На основании полученных кривых десорбции установлены величины объемов ацетонитрила, необходимые для десорбции каждого компонента при оптимальном значении рН=3 (таблица 15). По результатам можно заключить, что при осуществлении метода ТФЭ необходимы малые количества элюента, что значительно снижает стоимость процесса пробоподготовки и является безусловным преимуществом по сравнению с другими методами.

Таблица 15 -Параметры кривых сорбционного извлечения при рН=3

Фенольное соединение	V элюента, мл
Галловая кислота	3.0
Кофейная кислота	4.0
Рутин	4.0

Динамические кривые процесса твердофазной экстракции. Для оценки эффективности сорбционных процессов на патроне С18 были получены динамические кривые на модельных водных растворах галловой и кофейной кислот с концентрацией 100 мкг/мл и рутина с концентрацией 50 мкг/мл (рисунок 7-9). Получение динамических кривых для кверцетина не представлялось возможным, так как его растворимость в воде мала и чувствительность методики не достаточна для его количественного определения. Для получения динамических кривых водный раствор вещества прогоняли через патрон со скоростью 1 мл/мин. Процесс контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии по содержанию аналита в каждой порции элюата. Из полученных зависимостей установлены объемы «до проскока» для галловой и кофейной кислот и рутина, которые составляют 0.25 мл, 0.75 мл и 28 мл соответственно.

Рисунок 7 - Динамическая кривая сорбции галловой кислоты с концентрацией 100 мкг/мл на патроне С18 при скорости подачи раствора 1 мл/мин

Рисунок 8 - Динамическая кривая сорбции кофейной кислоты с концентрацией 100 мкг/мл на патроне С18 при скорости подачи раствора 1 мл/мин



Рисунок 9 - Динамическая кривая сорбции рутина с концентрацией 50 мкг/мл на патроне С18 при скорости подачи раствора 1 мл/мин

Однако в реальных объектах содержание галловой кислоты находится в пределах 10 мкг/мл, для кофейной кислоты в пределах 20 мкг/мл, а для рутина -25 мкг/мл, что также зависит от вида и рода лекарственного растения и может варьироваться в широком диапазоне [48]. Поэтому представлялось необходимым для галловой и кофейной кислот и рутина получить динамические кривые при более низких концентрациях (рисунок 10-12). Условия оставались неизменными на фоне уменьшения концентрации фенольного соединения.

Рисунок 10 - Динамическая кривая сорбции галловой кислоты с концентрацией 10 мкг/мл на патроне С18 при скорости подачи раствора 1 мл/мин



Рисунок 11 - Динамическая кривая сорбции кофейной кислоты с концентрацией 20 мкг/мл на патроне С18

Рисунок 12 - Динамическая кривая сорбции рутина с концентрацией 25 мкг/мл на патроне С18

Сравнительный анализ динамических кривых при различных концентрациях привел к выводу, что сорбционная форма кривой при переходе к растворам с меньшей концентрацией веществ остается неизменной.

Отличительной чертой динамической кривой кофейной кислоты является наличие двух сорбционных емкостей, что можно объяснить влиянием энергии взаимодействия в системе адсорбат-адсорбат. Дисперсионное и электростатическое притяжения между молекулами кофейной кислоты может увеличиваться с ростом заполнения монослоя, поскольку среднее расстояние между ними при этом уменьшается. Однако притяжение увеличивается до некоторого предела и при плотном заполнении монослоя сменяется отталкиванием [49].

Важной особенностью применения ТФЭ является возможность концентрирования определяемых веществ. Но на основании динамических кривых на данном этапе работы можно было утверждать, что концентрированию подвергается только рутин, т.к. его объем «до проскока» составляет 28 мл. Поэтому для определения возможности концентрирования фенольных веществ на патроне, были получены динамические кривые галловой кислоты с концентрацией 10 мкг/мл и кофейной кислоты с концентрацией 20 мкг/мл при различных скоростях подачи раствора через патрон (рисунок 13-15). Предполагалось, что варьирование данного параметра повлияет на значения объемов «до проскока», так как уменьшение скорости может увеличить время для установления равновесия в системе «сорбент - сорбат».

а в

Рисунок 13 - Динамические кривые сорбции галловой (а) и кофейной (в) кислот на патроне С18 при скорости потока 0.5 мл/мин



а в

Рисунок 14 - Динамические кривые сорбции галловой (а) и кофейной (в) кислот на патроне С18 при скорости потока 1.5 мл/мин

а в

Рисунок 15 - Динамические кривые сорбции галловой (а) и кофейной (в) кислот на патроне С18 при скорости потока 2.0 мл/мин

В результате было выявлено, что при изменении скорости сорбционный профиль галловой кислоты (10 мкг/мл) не изменяется, в то время как для кофейной кислоты (20 мкг/мл) при скорости 0,5 мл/мин, также как и при 1 мл/мин, наблюдается наличие двух сорбционных емкостей, а при скорости 1,5 мл/мин и 2 мл/мин - только одной. По-видимому, при малой скорости потока сначала преобладает мономолекулярная адсорбция, а затем образование полимолекулярных слоев за счет межмолекулярного взаимодействия с последующей десорбцией [50]. С увеличением скорости пропускания раствора этот эффект не проявляется.

На основе полученных динамических кривых галловой и кофейной кислот установлены объемы «до проскока» (таблица 16).

Таблица 16 - Параметры сорбционных процессов

Вещество	Скорость подачи раствора, мл/мин	Содержание на уровне «проскока», мкг/мл	Объем до проскока на уровне 5 %, мл
Галловая кислота	0,5	0,893	0,25
	1	1,718	0,25
	1,5	3,028	0,5
	2,0	0,831	0,25
Кофейная кислота	0,5	1,440	0,25
	1	0,471	0,75
	1,5	0,413	4
	2,0	0,374	5

Столь низкие значения объемов «до проскока» значительно затрудняют концентрирование гидрофильной галловой кислоты из водных растворов с применением сорбента С18, а концентрирование кофейной кислоты при скорости пропускания раствора 2,0 мл/мин возможно из объема не более 4,0 мл.

Концентрирование галловой кислоты на октадецилсилане. Определив основные параметры сорбционного извлечения, изучили возможность концентрирования галловой кислоты из водного отвара коры дуба. Миллилитр полученного водного отвара коры дуба, рН которого доводили раствором 2М НСl до значения 3, пропускали через патрон С18 со скоростью 1 мл/мин, десорбировали компоненты ацетонитрилом, отбирая фракции 0,5, 1-3 мл, которые анализировали в системе ВЭЖХ. Как показали исследования, концентрирование галловой кислоты из реального образца невозможно, что подтверждалось ранее параметрами динамических кривых сорбции. Наличие в молекуле галловой кислоты трех гидроксильных групп обеспечивает высокое сродство к полярному растворителю, что значительно снижает удерживание на поверхности силикагеля с привитыми фазами С18.

Концентрирование кофейной кислоты на октадецилсилане. Концентрирование кофейной кислоты из растительного материала изучали на примере календулы аптечной. 4 миллилитра полученного водного отвара календулы аптечной, рН которого доводили раствором 2М НСl до значения 3, пропускали через патрон С18 со скоростью 2 мл/мин. Десорбировали компоненты ацетонитрилом, отбирая фракции 1-4 мл с шагом 1 мл, которые анализировали в системе ВЭЖХ. В результате было установлено, что кофейная кислота не подвергается концентрированию в условиях анализа реального объекта, так как смывается исходным водным отваром при попытке концентрирования на патроне С18. Сродство кофейной кислоты к сорбенту не достаточно велико из-за двух гидроксильных групп в ароматическом кольце. Также, в отличие от стандартного раствора, при концентрировании из отвара календулы аптечной на сорбционную емкость кофейной кислоты влияют многочисленные компоненты матрицы растительного образца.

Концентрирование рутина на октадецилсилане. Возможность концентрирования рутина была подтверждена с применением отвара травы подорожника (рисунок 16).

Рисунок 16 - Хроматограмма отвара подорожника до (-) и после (-) концентрирования на патроне С18

рН отвара также доводили раствором 2М НСl от до значения 3. 28 мл полученного водного отвара пропускали через патрон С18 со скоростью 1 мл/мин, десорбировали компоненты ацетонитрилом, отбирая фракции 1-5 мл с шагом 1 мл, затем анализировали в системе ВЭЖХ. Обнаружено, что рутин можно сконцентрировать примерно в 30 раз (таблица 17). Возможность концентрирования рутина определяется его сравнительно высоким сродством к поверхности модифицированного силикагеля.

Таблица № 17 - Концентрирование рутина из отвара подорожника на патроне С18

Вещество	Концентрация вещества в отваре, мкг/мл	Концентрация вещества в элюате, мкг/мл	Коэффициент концентрирования
Рутин	2.06	62.80	30.50

Концентрирование (-)-эпикатехина на октадецилсилане. Одновременно был проведен анализ отвара зверобоя продырявленного (рисунок 17), в котором представлялось возможным подвергнуть концентрированию (-)-эпикатехин.

Рисунок 17 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного до (-) и после (-) концентрирования на патроне С18

рН водного отвара довели раствором 2М НСl до значения 3. 25 мл полученного водного отвара пропускали через патрон С18 со скоростью 1 мл/мин, десорбировали компоненты ацетонитрилом, отбирая фракции 1-6 мл с шагом 1 мл, затем анализировали в системе ВЭЖХ. (-)-эпикатехин удалось сконцентрировать в 12 раз (таблица 18), что объясняется его принадлежностью к классу флавоноидов.

Таблица № 18 - Концентрирование (-)-эпикатехина из отвара зверобоя продырявленного на патроне С18

Вещество	Концентрация вещества в отваре, мкг/мл	Концентрация вещества в элюате, мкг/мл	Коэффициент концентрирования
(-)-эпикатехин	0.79	9.62	12.20

Заключение

1 На основании величин степеней извлечения галловой и кофейной кислот и кверцетина на сорбентах С18 и ССПС установлено, что галловая и кофейная кислоты достаточно хорошо извлекаются обоими сорбентами, в то как время для извлечения кверцетина более приемлемым является сорбент Диапак С18.

2 Проведен сравнительный анализ 2-х способов пробоподготовки растительных отваров тысячелистника обыкновенного и зверобоя продырявленного: с использованием ТФЭ и традиционной жидкость-жидкостной экстракции этилацетатом. Применение сорбента Диапак С18 для извлечения целевых компонентов является наиболее оптимальным.

3 На основании кривых десорбции определены степени извлечения обеих кислот и рутина в зависимости от величины рН. Установлено, что оптимальным для галловой, кофейной кислот и рутина является значение рН, равное 3. При этом установлены величины объемов ацетонитрила, необходимые для десорбции каждого компонента при оптимальном значении рН=3.

4 Получены динамические кривые сорбции для различных концентраций галловой и кофейной кислот и рутина, сравнительный анализ которых привел к выводу, что сорбционная форма кривой при переходе к растворам с меньшей концентрацией веществ остается неизменной.

5 Получены динамические кривые галловой кислоты с концентрацией 10 мкг/мл и кофейной кислоты с концентрацией 20 мкг/мл при различных скоростях подачи раствора через патрон. На основе полученных динамических кривых галловой и кофейной кислот установлены объемы «до проскока» каждого соединения при варьировании скорости подачи раствора.

6 Показана возможность концентрирования на сорбенте Диапак С18 галловой кислоты из отвара коры дуба, кофейной кислоты из отвара календулы аптечной, рутина из отвара подорожника большого, (-)-эпикатехина из отвара зверобоя продырявленного. Установлено, что концентрирование галловой и кофейной кислот из реального объекта является невозможным. В то же время, удалось достигнуть концентрирования рутина и (-)-эпикатехина из растительного образца.

Cписок использованных источников

1 Aaby, K. Сharacterization of phenolic compounds in strawberry (fragaria ananassa) fruits by different HPLC detectors and contribution of individual compounds to total antioxidant capacity / K. Aaby, D. Ekeberg, G. Ksrede // J. Agric. Food Chem. ? 2007. ? № 55. ? P. 4395-4406.

2 О влиянии биологически активных веществ на антиоксидантную активность фитопрепаратов / Шкарина Е.И и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2001. - т.35. - № 6. - С. 41-47.

3 Определение качественного состава коньячных изделий методом ВЭЖХ / Кочетова М.В. и др. // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т.8. - Вып.4. - С. 658- 667.

4 Zheng, W. Antioxidant Activity and Phenolic Compounds in Selected Herbs / W. Zheng, S. Y. Wang // J. Agric. Food Chem. - 2001. - Vol. 49. - № 11. - P. 5165 - 5170.

5 Evaluation of the antioxidant properties of fruits / M. Garcэa-Alonso и др. // Food Chemistry. ? 2004. ? № 84. ? P. 13-18.

6 Liu, Q. Determination of seven polyphenols in water by high performance liquid chromatography combined with preconcentration / Q. Liu, W. Cai, X. Shao // Talanta. - 2008. - № 77. - P. 679-683.

7 Tsao, R. Separation procedures for naturally occurring antioxidant phytochemicals / R. Tsao, Z. Deng // Journal of Chromatography B. - 2004. - № 812. - P. 85-99.

8 Analytical separation and detection methods for flavonoids / E. de Rijke и др. // Journal of Chromatography A. - 2006. - № 1112. - P. 31-63.

9 Antioxidant properties of marigold extracts / G. S. Cetkovic и др. // Food Research International. - 2004. - № 37. - P. 643-650.

10 Phytochemical and antioxidant analysis of eight Hypericum tax from Central Italy / G. Sagratini и др. // Fitoterapia. - 2008. - № 79. - P. 210-213.

11 Zgorka, G. Application of conventional UV, photodiode array (PDA) and fluorescence (FL) detection to analysis of phenolic acids in plant material and pharmaceutical preparations / G. Zgorka, S. Kawka // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2001. - № 24. - P. 1065-1072.

12 Suarez, B. Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic determination of polyphenols in apple musts and ciders / B. Suarez, A. Picinelli, J.Mangas // Journal of Chromatography A. - 1996. - № 727. - P. 203-209.

13 Кудринская, В. Синтез и исследование сорбционных свойств полимеров с молекулярными отпечатками кверцетина / В. Кудринская, С. Дмитриенко, Ю. Золотов // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. - 2009. - V. 50. - № 3. - P. 156-163.

14 Сычев, К.С. Материалы и методы пробоподготовки в хроматографии: твердофазное концентрирование и адсорбционная очистка / К.С. Сычев, В.А. Даванков // 2004. - т.4. -Вып.1.

15 Сычов К.С. Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и твердофазной экстракции При информационной поддержке: Портал ANCHEM.RU «Аналитика - Мир Профессионалов» ЗАО «Найтек Инструментс» Москва.

16 Стыскин, Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Е.Л. Стыскин, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде // Москва, 1986.

17 Шатц, В. Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии / В. Д. Шатц, О. В. Сахартова // Рига: Зинатне. - 1988. - 390 с.

18 Simultaneous determination of phenolic acids and flavonoids in Lyciumbarbarum Linnaeus by HPLC-DAD-ESI-MS / B. S. Inbaraj и др. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2010. - № 51. - P. 549-556.

19 SPE-HPLC method for the determination of four flavonols in rat plasma and urine after oral administration of Abelmoschusmanihot extract / X. Lai и др. // Journal of Chromatography B. - 2007. ? № 852. - P. 108-11.

20 Govindarajan, R. High-performance liquid chromatographic method for the quantification of phenolics in `Chyavanprash' a potent Ayurvedic drug / R. Govindarajan, D.Singh, A. Rawat // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2007. - №43. - P.527-532.

21 Васияров, Г.Г. Концентрирующие патроны Диапак / Г.Г. Васияров, Г.С.Алексеева // Выпуск 2.

22 Naczk, M. Extraction and analysis of phenolics in food / M. Naczk, F. Shahidi // Journal of Chromatography A. - 2004. - № 1054. - P. 95-111.

23 Michalkiewicz, A. Solid-phase extraction procedure for determination of phenolic acids and some flavonols in honey / A. Michalkiewicz, M. Biesaga, Kr. Pyrzynska // Journal of Chromatography A. - 2008. ? № 1187. - P. 18-24.

24 Simultaneous isolation of Rutin and Esculin from plant material and drugs using solid-phase extraction / B. Buszewski и др. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. ? 1993. ? Vol. 11. ? № 3. - P. 211-215.

25 Разделение и определение фенолкарбоновых кислот методом капиллярного зонного электрофореза с предварительным динамическим концентрированием на сверхсшитом полистироле / О. Медведева и др. // Журнал аналитической химии. - 2004. - Т. 59. - № 7. - С.752-759.

26 Сычов С. Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроволновочных хроматографах серии «Милихром». Орел, 2002.

27 Блажей, А. Фенольные соединения растительного происхождения / А. Блажей, Л. Шутый // Перевод с английского. Изд.:Мир, Москва,1977.

28 Беликов, В. В. Методы анализа флавоноидных соединений / В. В. Беликов, М. С. Шрайбер // М.: Фармация, 1970. - №1 - С. 66-71.

29 Данилова, Н. А. Определение дубильных веществ в корнях щавеля конского методом спектрофотометрии / Н. А. Данилова, Д. М Попов // НИИ фармации ММА им. Сеченова. - 2004. - № 2. - С. 179-182.

30 Земцова, Г. Н. Сравнительная оценка методов определения суммы флавоноидов в Р-витаминном комплексе / Г. Н. Земцова, А. Б. Дмитриев // М.: Фармация. - 1985. - С. 754-757.

31 Flavonoids separations by capillary electrophoresis. Effect of temperature and pH / B. F. de Simon и др. // Chromatographia. ? 1995. - V.41. ? № 7/8. - P. 389-392.

32 Analysis of antioxidant flavonoids from Asteraceae and Moraceae plants by capillary electrophoresis/ Sz. T. Kristo и др. // Chromatographia Supplement. - 2002. - V. 56. - Р. 121-126.

33 Extraction of flavonoids from garden (Salvia officinalis L.) and glutinous (Salvia glutinosa L.) sage by ultrasonic and classical maceration / D.Velicovic и др. // J. Serb. Chem. Soc.? 2007. ? № 72.? P.73 ? 80.

34 БубенчиковаВ. Н. Изучение фенольных соединений шалфея мутовчатого./В. Н. Бубенчикова, Ю. А. Кондратова// Башкирский химический журнал. - 2008. -Т. 15. - № 2. - С. 102 - 104.

35 Chen, H. Separation and determination of flavonoids and other phenolic compounds in cranberry juice by high-performance liquid chromatography / H. Chen, Y.Zuo, Y. Deng // Journal of Chromatography A. - 2001. - № 913. - P. 387-395.

36 Determination of free molecular phenolics and catechins in wine by solid phase extraction on polymeric cartridges and liquid chromatography with diode array detection/ M. del Alamo и др. // Journal of Chromatography A. - 2004. - № 1049. - P. 97-105.

37 Fractionation of polyphenols in hawthorn into polymeric procyanidins, phenolic acids and flavonoids prior to high-performance liquid chromatographic analysis / U. Svedstrom и др. // Journal of Chromatography A. - 2006. - № 1112. - P. 103-111.

38 The occurrence and characterisation of phenolic compounds in Camelina sativa seed, cake and oil / P. Terpinc и др. // Food Chemistry. - 2012. - № 131. - P. 580-589.

39 Simonetti, P. Caffeic Acid as Biomarker o f Red Wine Intake / P. Simonetti, C.Gardana, P. Pietta // Мethods in enzymology. - vol. - 335.

40 Separation of flavonol-3-0-glycosides from Calendula oficinalis and Sambucusnigra by high-performance liquid chromatography and miceller electrokinetic capillary chromatography / P. Pietta и др. //Journal of Chromatography. -1992. - № 593.

41 Determination of selected flavonoids in hop extract by HPLC / J. Kovacova и др. // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. - 2011. - № 34. - P. 329-340.

42 Preparative Purification of the Major Flavonoid Glabridin from Licorice Roots by Solid Phase Extraction and Preparative High Performance Liquid Chromatography / Jiao Lv и др. // Separation Science and Technology. - 2010. - № 45. - P. 1104-1111.

43. Mothibedi, K. Determination of flavonoids in Ginkgo Biloba using Bond Elute Plexa solid phase extraction sorbent for cleanup and HPLC-DAD analysis / K. Mothibedi, J. Mokgadi, N. Torto // Agilent Technologies, Inc., 2011.

44 Цюпко, Т. Г. Оценка сумы биологически активных веществ фитоматериалов по величине антиоксидантной активности / Т.Г. Цюпко, З.А. Темердашев, О.Б. Воронова // Вестник Казахского национального университета. Серия Химия. - 2010. - Т. 60. - № 4. - С. 343-345

45 Determination of synthetic phenolic antioxidants in food items using reversed-phase HPL / B. Saad и др. // Food Chemistry. - 2007. - № 105. - P. 389-394.

46 Темердашев, З. А. Определение фенольных соединений и флавоноидов в водных экстрактах лекарственных растений / З. А. Темердашев, И. А. Колычев, Т. Г. Цюпко // Заводская лаборатория. - 2011. - № 6.

47 Solid-phase extractionand gas chromatographic analysis of phenolic compounds in virgin olive oil / L. Liberatore и др. // Food Chemistry. - 2001. - № 73. - P. 119-124.

48 Определение фенольных соединений и флавоноидов в водных экстрактах лекарственных растений / Темердашев З.А. и др. // Заводская лаборатория. - 2011. - № 11. - С. 18-22.

49 Курс физической химии / Под ред. Я. И. Герасимова. - М.: Химия, 1964. - 624 с.

50 Смирнова, О. В. Исследование адсорбции и десорбции феноксикарбоновых кислот на поверхности кремнезема / О. В. Смирнова // Наносистемы, наноматериалы, нанотехнологии. - 2008. - Т. 6. - № 1. - С. 291-302.

Приложения

Рисунок 1 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного



Рисунок 2 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного, пропущенного через сорбент С18



Рисунок 3 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного, пропущенного через сорбент ССПС



Рисунок 4 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного после этилацетатной экстракции



Рисунок 5 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного



Рисунок 6 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного, пропущенного через сорбент С18



Рисунок 7 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного, пропущенного через сорбент ССПС



Рисунок 8 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного после этилацетатной экстракции

Размещено на Allbest.ru