Существует различный подход к классификации АОС. Компоненты антиоксидантной защиты (АОЗ) в зависимости от их химического строения разделяют на высокомолекулярные, в основном, белкового происхождения, и низкомолекулярные соединения. Последние, исходя из растворимости, подразделяют на гидрофобные и гидрофильные. С позиций механизма действия АОС можно рассматривать как систему, проявляющую специфическую и неспецифическую антиоксидантную активность. Действие специфической АОС направлено непосредственно на снижение уровня оксидантов в тканях путём прямого разрушения и связывания активных форм кислорода или образующихся радикалов, что приводит к обрыву цепей свободно-радикальных реакций [13]. В свою очередь, в зависимости от характера действия выделяют ферментативные и неферментативные компоненты специфической АОС (Рисунок 3).

Рисунок 3 - Компоненты антиоксидантной защиты (АОЗ)

Действие неспецифической АОЗ связано со снижением возможности дополнительной генерации свободных радикалов. Одним из проявлений неспецифической АОЗ является устранение пула металлов переменной валентности (железо, медь) за счёт их связывания, в частности, с высокомолекулярными соединениями (трансферрин, ферритин, лактоферрин, церулоплазмин) и предотвращение возможности их участия в свободно-радикальных реакциях [63]. Так, при физиологической концентрации ионов меди в плазме крови основная их масса связывается с белками и только 6% с низкомолекулярными соединениями [13].

Разделение АОЗ на специфическую и неспецифическую достаточно условно. Так, ряд образующихся комплексных соединений металлов с белками (к примеру, церулоплазмин) могут проявлять и специфическую антиоксидантную активность (АОА) [62]. Специфическую АОА проявляют ферментативные и неферментативные её компоненты, а неспецифическая АОА связана, в основном, с неферментативными компонентами [9].

К ферментативным элементам относят супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионпероксидазу, фосфолипид-гидропероксид глутатионпероксидазу (КФ 1.11.1.12), селен-независимую глутатион-S-трансферазу (КФ 2.5.1.18), тиол-специфическую пероксидазу (КФ 1.11.1.7), сульфитоксидазу (КФ1.8.3.1), тиоредоксинредуктазу (КФ 1.6.4.5), глутатионредуктазу (КФ 1.6.4.2), гемоксигеназу 1 (КФ 1.14.99.3), хинонредуктазу (КФ 1.6.99.2) [15].

Неферментативная АОС представлена большой, очень разнообразной по своему химическому строению группой соединений, которые непосредственно нейтрализуют АФК или косвенно препятствуют их генерации [13].

1.6.1 Супероксиддисмутаза

Супероксиддисмутаза (СОД) (супероксид-оксидоредуктаза, КФ 1.15.1.1) -это ключевой фермент АОЗ, так как при её участии прерывается цепь свободно-радикальных процессов в начале своего зарождения на стадии одноэлектронного восстановления кислорода с образованием супероксидного анион-радикала. Фермент супероксиддисмутаза впервые был описан McCord J. M. и Fridovich I. в 1969 году [64].

СОД осуществляет дисмутацию супероксидного анион-радикала, скорость которой (2?109 л · моль-1 · с-1 и выше) значительно превышает скорость спонтанной реакции при нейтральных значениях рН (7?105 л · моль-1 · с-1) [63]. Конечным продуктом реакции является перекись водорода:

О2?? + О2?? + 2Н+ > Н2О2 + О2(1.27)

В настоящее время выделено несколько изоферментных форм СОД. Сu,Zn-СОД (31 кДа) является наиболее распространённой и хорошо изученной. Она содержится в клетках эукариот (ядра, цитоплазматический матрикс, пероксисомы, межмембранный просвет митохондрий, лизосомы) и обладает чувствительностью к воздействию цианидов. Молекула фермента состоит из двух идентичных субъединиц, каждая из которых содержит в области активного центра один атом меди и один атом цинка. Cu++ принимает участие в дисмутации супероксидного анион-радикала, а цинк, по всей вероятности, способствует стабилизации белковой молекулы [22].

Mn-СОД (40 кДа) является цианрезистентной формой и содержится, в основном, в матриксе митохондрий и хлоропластов эукариот [52]. Однако предшественник митохондриальной Mn-СОД синтезируется в цитозоле, в митохондриях происходит лишь отщепление от него полипептидного фрагмента [65]. В настоящее время этот изофермент СОД выявлен у бактерий. Фермент состоит из 4 субъединиц, содержащих ион марганца в области активного центра. Действие Мn-СОД направлено на дисмутацию О2? ?, образующегося в результате функционирования системы тканевого дыхания. Обе формы СОД действуют как внутриклеточные ферменты [3].

В межклеточном пространстве обнаружена высокомолекулярная внеклеточная (экстрацеллюлярная) СОД (135 кДа), состоящая из 4-х субъединиц. Каждая субъединица имеет молекулярную массу около 30 кДа и содержит ионы меди и цинка [62]. Кроме более высокой молекулярной массы, субъединица экстрацеллюлярной СОД отличается от субъединицы цитоплазматической Cu,Zn-СОД аминокислотным составом, антигенными свойствами и генным локусом, кодирующим аминокислотную последовательность апофермента. Каталитическая активность экстрацеллюлярной СОД значительно ниже, чем у цитоплазматического фермента [63]. Этот Сu,Zn-содержащий гликопротеин является главной изоформой межклеточных жидкостей - плазмы, лимфы, синовиальной жидкости и в небольших количествах обнаруживается почти во всех тканях. Экспрессия внеклеточной СОД связана преимущественно с клетками глии и фибробластами в отличие от Cu,Zn-СОД, которая секретируется фактически всеми клетками организма [42].

Выделяют ещё одну изоформу СОД - железосодержащий фермент, который вначале был обнаружен у прокариот. В настоящее время показано, что этот фермент широко распространён - от бактерий до растений-эукариот семейства Ginkgo biloba, Gingkoaceae, Cruciferae и Nymphaceae и др. Fe-СОД - это димер с молекулярной массой 41 кДа, в области активного центра которого основное место занимает железо [62].

Содержание изоферментов супероксиддисмутазы в отдельных органах и тканях экспериментальных животных существенно различается. Наиболее высокий уровень Cu-,Zn-СОД выявлен в печени (до 350 мкг/г массы ткани), почках (185 мкг/г массы ткани) и поджелудочной железе (165 мкг/г массы ткани). В сердце, мозге и эритроцитах содержание этого изофермента составляет около 60-70 мкг/г массы ткани (клеток). Наименьший уровень супероксиддисмутазной активности выявлен в мышечной и жировой ткани [22]. Активность Mn-СОД снижается в ряду: сердце, почки, печень, мозг, поджелудочная железа, мышечная и жировая ткань. В эритроцитах Mn-СОД отсутствует. В отдельных органах также существуют различия в распределении супероксиддисмутазной активности. Например, в мозге глиальные клетки содержат супероксиддисмутазы в шесть раз больше, чем нейроны. С возрастом, в процессе индивидуального развития организма, удельная активность супероксиддисмутазы в печени, сердце и мозге мышей снижается, хотя снижение активности в сердце и мозге компенсируется увеличением количества фермента [60].

Образующийся в процессе диспропорционирования анион-радикала кислорода пероксид водорода может утилизироваться с помощью двух ферментов: каталазы и глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9).

1.6.2 Каталаза

Каталаза (КФ 1.11.1.6) - один из давно известных ферментов-антиоксидантов, впервые описанный Loew в 1901 году. Каталаза является гемопротеином, катализирует реакцию расщепления Н2О2. Разложение перекиси водорода происходит в две стадии:

Каталаза-Fe3+ + Н2О2 > окисленная каталаза,(1.28)

окисленная каталаза + Н2О2 > Каталаза-Fe3+ + 2 Н2О + О2(1.29)

В окисленном состоянии каталаза может проявлять пероксидазную активность, участвуя в окислении спиртов и альдегидов. Однако, в физиологических условиях пероксидазная активность фермента почти в 10 000 раз ниже каталазной [10].

Каталаза содержится в большинстве аэробных клеток. У животных она присутствует почти во всех тканях организма. Наибольшее ей количество сконцентрировано в печени, почках и эритроцитах. Содержание каталазы в щитовидной железе, половых железах, соединительной ткани и ткани мозга относительно низкое. На субклеточном уровне каталаза, в основном, локализована в пероксисомах (80%) и цитозоле (20%). Небольшое её количество может присутствовать в лизосомах и митохондриях. Каталаза относится к внутриклеточным ферментам и из-за высокой молекулярной массы плохо проникает во внеклеточную среду, где может быстро подвергаться протеолитическому расщеплению [9]. Поэтому считается, что внеклеточная защитная роль каталазы незначительна, однако её повышенное содержание в сыворотке крови при некоторых заболеваниях, таких как ревматоидный артрит и острый респираторный дистресс-синдром, может служить для защиты от окисления определённых молекул и структур, в частности, б1-ингибитора протеиназ. Происхождение сывороточной каталазы при острых воспалительных процессах не ясно, возможно её выделение из разрушенных клеток [3]. На культуре лимфоцитов человека было показано, что наличие в культуральной среде даже небольшого количества каталазы отменяет апоптотическую гибель и возвращает клеткам Т-линии способность к росту в среде, не содержащей сыворотки [10]. Авторы этой работы предположили, что Т-лимфоциты могут выделять во внешнюю среду каталазу, что необходимо для их защиты в области воспалительного очага.

Каталитическая активность этого фермента чрезвычайно высокая. Одна молекула каталазы может разложить за секунду 44000 молекул пероксида водорода. В присутствии фермента реакция почти не требует энергии активации и ее скорость определяется скоростью диффузии субстрата к активному центру фермента. Однако каталаза характеризуется большой величиной Км, и эффективное разложение пероксида водорода происходит только при его высокой концентрации. Поэтому в клетке максимальная каталазная активность характерна для мест с высокой продукцией H2O2, например пероксисомах [22]. Защита каталазы от высоких концентраций собственного субстрата, по-видимому, обеспечивается НАДФН. Каждая субъединица тетрамерной молекулы каталазы способна связывать молекулу восстановленного НАДФН, что предохраняет её от инактивации и повышает ферментативную активность [3].

1.6.3 Глутатионпероксидаза

Глутатионпероксидаза (ГПО) (КФ 1.11.1.9) впервые была описана в 1957 году Mills G. C. По своей структуре селенсодержащая ГПО является тетрамером, с молекулярной массой каждой субъединицы около 19 кДа. Каждая субъединица содержит по одному атому селена, связанного с цистеиновыми остатками. Фермент локализован, в основном в цитозоле (около 70%) [9]. В митохондриях млекопитающих находится около 20 - 30% ГПО. В настоящее время известно пять изоферментных форм селенсодержащей ГПО [23]. В плазме и молоке обнаружен внеклеточный изофермент, в цитоплазме клеток печени и кишечника - особый изофермент ГПО-G1, в ядрах спермы содержится специфическая изоформа фермента. Выявлен изофермент, несодержащий селена и идентичный глутатион-S-трансферазе [3].

ГПО, используя восстановленную форму глутатиона в качестве субстрата, эффективно расщепляет не только перекись водорода, но и органические гидроперекисные соединения, включая гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот. При определённых условиях её роль в обезвреживании Н2О2 в тканях значительно более весома, чем каталазы, так как действие последней ограничено пероксисомами. ГПО имеет высокое сродство к Н2О2, что определяет её ведущую роль в метаболизме перекиси водорода при более низких физиологических концентрациях каталазы. В некоторых тканях (мозг, сердце, лёгкие), где активность каталазы низкая, обезвреживание Н2О2 осуществляется, в основном, ГПО. В условиях ОС, когда резко возрастает концентрация перекиси водорода, ключевая роль в её расщеплении принадлежит каталазе [22].

В настоящее время выделен изофермент селенсодержащей ГПО, названный «ГПО гидроперекисей фосфолипидов» или липидгидропероксид ГПО (КФ 1.11.1.12), который по своей структуре является мономером с молекулярной массой 22 кДа и содержит один атом селена, связанного с цистеиновым остатком белка. Этот изофермент в отличие от классической ГПО может восстанавливать гидроперекиси фосфолипидов без предварительного их гидролиза [9]. Являясь липофильным соединением, он активно взаимодействует с гидроперекисями фосфатидилхолина, холестерина и эфиров холестерина в мембранах и липопротеинах низкой плотности. Благодаря совместному действию с токоферолом ГПО гидроперекисей фосфолипидов эффективное разрушение продуктов ПОЛ в клеточных мембранах [10].

Активность ГПО зависит от концентрации восстановленной формы глутатиона. Восстановление образующегося окисленного глутатиона осуществляется за счёт работы фермента глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) - цитоплазматического белка, распределённого в тканях подобно глутатионпероксидазе. Этот фермент функционально связан с ГПО. Действие глутатионредуктазы зависит от уровня НАДФН и, следовательно, от состояния пентозофосфатного цикла и активности её ключевого фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49). Она восстанавливает окисленный глутатион, используя НАДФН, который образуется за счёт реакций пентозного цикла [12].

Активность и стабильность ключевых ферментов АОЗ взаимосвязаны. Три основных фермента - СОД, каталаза, ГПО - инактивируются одним из продуктов их ферментативной реакции. Согласованное действие этих ферментов является необходимым для защиты их от непосредственного инактивирующего воздействия образующихся АФК [18]. Так, СОД, разрушая О2??, защищает каталазу от его инактивирующего влияния, при этом снижается вероятность восстановления Fе3+ и возможность образования ОН?, который служит прооксидантом ПОЛ. А продукты ПОЛ являются потенциальными ингибиторами глутатионпероксидазы. Каталаза и ГПО предохраняют СОД от инактивации, устраняя Н2О2. Поэтому, только при условии сохранения активности и стабильности всех своих компонентов ферментативная АОЗ способна обеспечить эффективную защиту организма от токсических форм активированного кислорода [62].

Действие неферментативной АОЗ связано с большой группой низко- и высокомолекулярных химических соединений. Низко- и высокомолекулярные антиоксиданты обеспечивают надёжную и всестороннюю защиту тканей от токсического действия прооксидантов за счёт разной их локализации в субклеточных компонентах клетки и во внеклеточной среде [63].

К высокомолекулярным соединениям, проявляющим неферментативную антиоксидантную активность, относят церулоплазмин, трансферрин, альбумины плазмы, липопротеины высокой плотности, гаптоглобин, фибриноген, гемопексин, г-глобулины, гепарин, цитохром с, тиоредоксин и т.д. [3].

Низкомолекулярными соединениями, проявляющими антиоксидантное действие, являются аскорбиновая кислота, токоферолы, мочевая кислота, билирубин, восстановленная форма глутатиона, эстрогены, флавоноиды, каротиноиды, некоторые аминокислоты и т. д. [11].

Основное назначение АОС в тканях - это защита от токсического воздействия АФК при нормальном функционировании организма и при состояниях окислительного стресса. В организме существует определённое равновесие между ферментативными и неферментативными элементами АОЗ, так как последние могут при ОС выступать в качестве прооксидантов, являясь источниками АФК. Однако и ферментативные компоненты АОЗ при ряде патологических состояний могут вносить свой вклад в генерацию АФК [9].

1.7 Альфа-токоферол

Важной особенностью физиологической антиоксидантной системы является распределение ее компонентов между гидрофильной и гидрофобной фазами клеточных структур. Жирорастворимые антиоксиданты (токоферол, в-каротин, полифенолы, убихинон и др.) локализованы в липидных структурах - мембранах, липопротеинах. Водорастворимые - аскорбиновая кислота, глутатион, эрготионеин, антиперекисные и протеолитические ферменты - функционируют внутри клетки. Во внеклеточном пространстве находятся различные металлопротеины (церулоплазмин, трансферрин, лактоферрин, гемоглобин, альбумин), мочевая и аскорбиновая кислоты [67]. Таким образом, все клеточные структуры и внеклеточная среда находятся под контролем АОС.

Ферментативные антиоксиданты - средство внутриклеточной защиты, в сыворотке, лимфе и других средах их содержание мало. Вместе с тем во всех водных и липидных фазах организма могут протекать радикальные окислительные процессы, в защите от которых важную роль играют антиоксиданты - ингибиторы органических радикалов, среди которых важное место занимают соединения фенольного типа [3]. Фенольными антиоксидантами принято называть любые соединения вида Аr(ОН)n, в которых одна или несколько гидроксильных групп соединены с ароматическим ядром (Аr), при этом молекулы могут содержать несколько фрагментов Аr(ОН)n. Фенольные антиоксиданты (АrОН) эффективно взаимодействуют с гидроперекисными радикалами жирных кислот и ненасыщенных липидов в реакции:

АrОН + RO2? > АrО? + RООН(1.30)

По существу в данной реакции не наблюдается исчезновения свободной валентности, а имеет место только замена гидроперекисного радикала RO2? на феноксильный АrО?, однако при этом достигается эффект ингибирования свободнорадикального окисления, обусловленный большей стабильностью АrО?, который практически не участвует в реакциях продолжения цепей окисления [15].

В частности, к фенольным антиоксидантам относятся - б-токоферол, полифенолы, флавоноиды и близкие к ним по строению хиноны - витамины группы К, убихинон. Их действие усиливают серосодержащие соединения - глутатион, эрготионеин, цистеин, метионин, а также витамины А и С, в-каротин [24].

Таким образом, эндогенные фенольные антиоксиданты занимают ключевое положение в антиоксидантной системе организма. Прежде всего, это связано с тем, что они контролируют целостность и функциональную активность важнейших клеточных структур - мембран [33].

Витамин Е относится к наиболее сильнодействующим природным антиоксидантам и является «первой линией обороны» клеточных мембранных фосфолипидов [66].

Рисунок 4 - Химическая структура б-токоферола (витамин Е)

При этом в ингибировании ПОЛ участвуют только восстановленные формы витамина Е, а восстановителем антиоксидантных свойств токоферола являются так называемые коантиоксиданты. Коантиоксиданты могут быть гидрофильными и липофильными, природными и синтетическими; к наиболее изученным относятся убихинол (восстановленная форма коэнзима Q10), аскорбиновая кислота, билирубин, 3-гидроксиантраниловая кислота [8]. В результате происходит не только восстановление молекулы витамина Е, но и предотвращается возможность инициации радикалом б-токоферола окисления липидов [67].

Суточная потребность в витамине Е составляет 4-5 мг [69]. В организме человека максимальное содержание витамина Е (суммарное количество токоферолов) обнаружено в надпочечниках, жировой ткани, гипофизе, печени и семенниках [8]. В клетках б-токоферол преимущественно концентрируется в богатых ненасыщенными липидами мембранах митохондрий и лизосом, а также эритроцитах, плазматических мембранах, т. е. там, где измеряется высокое парциальное напряжение кислорода [70]. В ядрах клеток также выявляются значительные количества б-токоферола, связанного с негистоновыми белками, предполагается, что ядерный токоферол защищает хроматин от окислительных повреждений [7].

У млекопитающих витамин Е, поступающий в составе липидов пищи животного или растительного происхождения, всасывается в кишечнике, после чего включается в хиломикроны и через лимфатическую систему транспортируется в кровь, откуда основная его часть переходит в печень [3].

В печени происходит процесс включения витамина Е в состав липопротеинов, которые затем секретируются в кровь. В крови витамин Е, как и другие жирорастворимые витамины, переносится липопротеинами, при этом если у мужчин бо?льшая часть витамина связана с липопротеинами низкой плотности, то у женщин - с липопротеинами высокой плотности [15].

Внутриклеточная транспортировка липофильного б-токоферола осуществляется в комплексе со специальными б-токоферолсвязывающими (-переносящими, -ассоциированными) белками. Наиболее хорошо описан и изучен «б-токоферолпереносящий белок» печени («б-tocopherol transfer protein», б-ТТР) [12]. У животных (крыса, кролик) и человека б-ТТР содержится в цитозоле гепатоцитов и осуществляет транспорт витамина Е от липосом к эндоплазматическому ретикулуму, где и происходит синтез липопротеинов [8].

В числе основных причин высокой эффективности б-токоферола можно назвать следующие:

1. стабилизация липидного бислоя за счет образования устойчивых комплексов между молекулами б-токоферола и остатками полиненасыщенных жирных кислот, ограничивающих доступ активных форм кислорода (АФК) к жирнокислотным цепям [66].

2. ярко выраженная антирадикальная активность, проявляющаяся против всех свободных радикалов кислорода, в том числе в отношении самого реакционноспособного - супероксиданиона, а также синглетного кислорода [8].

б-Токоферол способен прерывать цепи окисления благодаря переносу водорода с фенольного кольца на пероксидный радикал с образованием молекулярного продукта. Образующийся из б-токоферола феноксирадикал является относительно стабильной и нереакционноспособной структурой за исключением его взаимодействия с другими пероксидными радикалами RОО?. При окислении хроманового кольца и боковой цепи б-токоферола образуется продукт, не являющийся СР. Этот продукт образует коньюгат с глюкуроновой кислотой и экскретируется из организма с желчью [68].

Было установлено, что б-токоферол, селенит натрия, ряд фенольных соединений природного происхождения оказывают выраженное гепатопротекторное действие при нарушениях функций печени, вызванных гепатотропными ядами, способствуют снижению нарастающего количества продуктов ПОЛ в крови, желчи, гомогенатах тканей внутренних органов [69]. В модельных смесях липидов природного происхождения б-токоферол обеспечивает до 60-85% ингибирующего эффекта по сравнению с другими природными антиокислителями [7].

2. Материалы и методы

2.1 Объект исследования

В качестве объекта исследования использовали взрослых лабораторных белых крыс, самцов, массой 250 - 350 г, содержащихся на стандартном рационе питания в виварии. Животные были разделены на 5 экспериментальных групп: 1 - интактные животные; 2 - крысы, подвергнутые интоксикации ССl4; 3 - животные, которым ежедневно в течение 14 дней per os вводили б-токоферол в дозе 200 мг/сутки, по истечении двух недель животных декапитировали; 4 - крысы, которым ежедневно в течение 14 дней перорально вводили б-токоферол в дозе 200 мг/сутки, затем на 15 день вводили тетрахлорметан и через 24 часа осуществляли забой; 5 - крысы, подвергнутые интоксикации ССl4 (в течение 24 часов), затем в течение 14 дней получавшие витамин Е (200 мг/сутки).

Окислительный стресс индуцировали введением 50% раствора ССl4 в вазелиновом масле из расчета 250 мкл ССl4 на 100 г веса животного. Забой животных производили через сутки после введения гепатотоксина (2 и 4 экспериментальные группы).

У декапитированных животных в плазме определяли активность аланинаминотрансферазы; в плазме крови и гомогенате почек оценивали показатели ПОЛ по содержанию малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК), определяли активность антиоксидантных ферментов - каталазы и супероксидисмутазы.

2.2 Определение активности аланинаминотрансферазы

Аланинаминотрансфераза (АлАТ) -- эндогенный фермент из группы трансфераз, подгруппы аминотрансфераз (трансаминаз), широко используемый в медицинской практике для лабораторной диагностики повреждений печени.

АлАТ катализирует перенос аминогруппы аланина на альфа-кетоглутаровую кислоту с образованием пировиноградной кислоты и глутаминовой кислоты. Переаминирование происходит в присутствии кофермента пиридоксальфосфата - производного витамина В6.

Определение активности аланинаминотрансферазы проводили с использованием набора реактивов фирмы «Витал».

Принцип метода:

А) L-аланин + б-кетоглутарат <АлАТ> пировиноградная кислота + L-глутамат;

Б) Фотометрическое определение содержания оксалоацетата в пробе на основе реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

Реактивы (состав набора фирмы ВИТАЛ):

реагент № 1. Субстратная смесь (L-аланин - 0,2 моль/л, Б-кетоглутаровая кислота - 2,0 ммоль/л, Фосфатный буфер, рН 7,4 - 0,1 моль/л);

реагент № 2. Раствор 2,4-ДНФГ (2,4-динитрофенилгидразин - 1,0 ммоль/л, соляная кислота - 1,0 моль/л);

калибратор (Пируват натрия - 1,0 ммоль/л);

реагент № 4. Гидроксид натрия 4,0 моль/л.

Флаконы 1, 2 содержат готовые к использованию реагенты. Калибратор готов к использованию. Содержимое флакона 4 (или аликвоту) развести бидистиллированной водой в 10 раз.

Ход определения:

Таблица 1 - Ход определения АлАТ

Поместить в пробирки	Опытная проба, мл	Холостая проба, мл
Субстратно-буферный раствор	0,5	0,5
Плазма крови	0,1	-
Инкубировать в водяной бане при 37 °С 30 минут
Раствор 2,4-ДНФГ	0,5	0,5
Плазма крови	-	0,1

Через 20 минут (20-25 °С) в пробирки внести по 5 мл 0,4 моль/л раствора NaOH и через 5-10 минут фотометрировать против холостой пробы в интервале длин волн 500-560 нм (лopt=537 нм) в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см.

Таблица 2 - Построение калибровочного графика

№ пробы	калибратор	Дист. вода	Раствор 2,4-ДНФГ	Содержание пирувата в пробе	Концентрация каталитической активности АлАТ (С)
	мл	мл	мл	нмоль	мкмоль/(с*л)	ммоль/(ч*л)
1	0,05	0,55	0,5	50	0,278	1,0
2	0,10	0,50	0,5	100	0,556	2,0
3	0,15	0,45	0,5	150	0,834	3,0
4	0,20	0,40	0,5	200	1,112	4,0
5	0,25	0,35	0,5	250	1,390	5,0
6	0,30	0,30	0,5	300	1,668	6,0
контр	-	0,60	0,5	-	-	-

Через 20 минут (20-25 °С) в пробирки внести по 5 мл 0,4 моль/л раствора NaOH и через 5-10 минут фотометрировать против дстиллированной воды при длине волны 500-560 нм (лopt=537 нм) в кювете с толщиной поглащающего слоя 1 см.

Расчет активности фермента в сыворотке крови производят по калибровачному графику.

1. Рассчитать по калибровочному графику коэффициент k:

k = С / Е,(2.1)

Е = (Екал - Ек),(2.2)

где Екал - экстинция калибровочной пробы;

Ек - экстинция контроля;

С - каталитическая концентрация АлАТ (активность) в мкмоль/(с*л) или ммоль/(ч*л) в калибровочной пробе.

2. Каталитическая концентрация АлАТ (активность) рассчитывается в мкмоль/(с*л) или ммоль/(ч*л) по формуле:

АлАТ = Епр ? k,(2.3)

где АлАТ - каталитическая концентрация (активность);

k - коэффициент, расчитанный по калибровочному графику;

Епр - экстинция опытной пробы, измеренной против холостой пробы.

При активности АлАТ, превышающей 3 ммоль/(ч*л) (0,834 мкмоль/(с*л)), сыворотку (плазму) крови следует развести. При расчете учесть степень разведения.

2.3 Определение содержания гемоглобина

Содержание гемоглобина в эритроцитах определяли стандартным гемоглобинцианидным методом. Гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин, образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид, оптическая плотность которого при 540 нм пропорциональна концентрации гемоглобина в образце крови.

Реактивы:

1. стандарстный раствор гемоглобина с известной концентрацией (120 г/л);

2. набор реагентов для определения гемоглобина в крови “ГЕМОГЛОБИН-АГАТ”;

3. трансформирующий раствор.

Ход определения:

К 5 мл трансформирующего раствора добавляли 20 мкл крови. Все тщательно перемешивали и оставляли на 10-15 мин при комнатной температуре для полного развития окраски. Также подготавливали пробу со стандартным раствором гемоглобина с концентрацией 120 г/л. Измерение оптической плотности опытной и калибровочной проб проводили на ФЭКе при длине волны 540 нм в кювете с толщиной 10 мм против трансформирующего раствора. По оптической плотности гемоглобина в калибровочной пробе проводили расчет содержания гемоглобина в опытных пробах:

Нb = Dо ? 120 / Dх ,(2.4)

где Hb - концентрация гемоглобина, г/л;

Dо - оптическая плотность опытной пробы;

Dх - оптическая плотность пробы со стандартным раствором Hb;

120 - концентрация Hb в стандартном растворе, г/л.

2.4 Определение содержания белка

Для определения содержания белка использовали микробиуретовый метод (Кочетков, 1971).

Реактивы:

1. стандартный раствор белка (сывороточного альбумина);

2. биуретовый реактив (реактив Бенедикта) - 17,3 г цитрата натрия и 10 г карбоната натрия растворяют при подогревании в небольшом количестве воды, в раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворённого в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл.

3. 6%-ный раствор NaOH.

Ход определения:

К 2 мл физиологического раствора, содержащего 10 мкл гомогената, добавляют 2 мл 6%-ного NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 330 нм на спектрофотометре. Предварительно строят график по стандартному раствору белка, по которому, построив линию Тренда, и определяют концентрацию белка в растворе.

2.5 Определение содержания диеновых конъюгатов

Определение содержания первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов, осуществляли спектрофотометрически в экстрагированной гептановой фазе липидов при 233 нм.

Принцип метода:

Вследствие р-р переходов спектры коньюгированных гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот характеризуются интенсивным поглощением в ультрафиолетовой области спектра с максимумом при 232-234 нм (Каган и др., 1986).

Реактивы:

1. гептан-изопропанольная смесь в соотношении 1:1;

2. 0,74%-ный водный раствора KCl.

Ход определения:

Определение содержания диеновых коньюгатов (ДК) проводили в плазме крови и гомогенате почек. Для этого липиды экстрагируют стократным избытком смеси растворителей. В гомогенизатор вносят 0,1 мл плазмы или гомогената, добавляют 5 мл изопропилового спирта и тщательно растирают до получения гомогенной суспензии. Содержимое гомогенизатора количественно переносят в мерную центрифужную пробирку, в которую затем добавляют 5 мл гептана.

Экстракт центрифугируют в течение 10 мин при при 3000 об/мин. (1700g). Надосадочную фракцию переносят в градуированную пробирку и добавляют 1/5 объема раствора KCl для отмывки липидного экстракта от нелипидных примесей. После тщательного встряхивания образовавшаяся эмульсия расслаивалась на две прозрачные фазы. В гептановом экстракте (верхняя фаза) измеряют спектрофотометрически содержание сопряженных диенов в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против гептана. Расчёт количества ДК производят с учетом молярного коэффициента экстинкции:

С (моль / г ткани) = D · F · / K · с,(2.5)

C (моль / л плазмы) = D · F · / K · v,(2.6)

где С - концентрация ДК;

D - оптическая плотность гептанового экстракта;

F - фактор разведения, равный 121,2;

K - коэффициент молярной экстинкции для ДК при длине волны 233 нм, равный 27000 М-1?см-1 (Паранич и др., 1993);

с - концентрация белка, г/л;

v - объём образца плазмы, л.

2.6 Определение содержания малонового диальдегида

Определение вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида, проводили по качественной реакции с тиобарбитуровой кислотой.

Принцип метода:

В липидных системах в результате процессов перекисного окисления липидов образуется малоновый диальдегид (МДА), взаимодействие которого с 2-тиобарбитуровой кислотой приводит к образованию хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм (Ko, Godin, 1990).

Реактивы:

1. 0,9%-ный раствор NaCl (физиологический раствор);

2. 30%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);

3. 0,1М раствор динатриевой соли этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) (С10Н14N2Na2O8 * 2H2O, Mr = 372,24г/моль);

4. 1%-ный раствор 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК);

5. 0,05 н раствор NаОН;

Ход определения:

К 0,2 мл плазмы добавляют 0,8 мл физиологического раствора и 0,5 мл раствора ТХУ, перемешивают и ставят в ледяную баню на 2 часа. Затем центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. (1700g). Аналогичным образом готовят контрольную пробу, в которой эритроциты заменяют равным объемом дистиллированной Н2О. 1 мл супернатанта переносят в другую пробирку, добавляют 0,075 мл ЭДТА и 0,25 мл раствора ТБК, приготовленного на 0,05 н растворе NаОН. Содержимое перемешивают и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры.

Для определения концентрации МДА в ткани печек использовали 3 мл гомогената и 1,5 мл раствора ТХУ, соответственно объём остальных реактивов увеличивали в 3 раза.

Измеряют поглощение опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 532 нм 600 нм в кюветах с толщиной слоя 1,0 см. Расчёт содержания МДА производят с учётом коэффициента молярной экстинкции образовавшегося хромогена, равного 1,56*105 М-1см-1 (Стальная И.Д., 1977):

С (моль / г ткани) = D532 - D600 · F / К · m,(2.7)

C (моль / л плазмы) = D532 - D600 · F / К,(2.8)

где С - содержание МДА;

D532 - оптическая плотность опытной пробы при длине волны 532 нм;

D600 - оптическая плотность опытной пробы при длине волны 600 нм;

F - фактор разведения, равный 9,94;

К - коэффициент молярной экстинкции образовавшегося хромогена, равный 1,56·105 М-1?см-1;

m - масса образца, г.

2.7 Определение активности супероксиддисмутазы

Принцип метода основан на ингибировании реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии супероксиддисмутазы (СОД), вследствие дисмутации супероксидных анион-радикалов, которые являются продуктом одного из этапов окисления и, по-видимому, одновременным участником его последующих стадий [Практикум по свободнорадикальному окислению, 2006; Сирота, 1999].

Об интенсивности аутоокисления адреналина, судят по динамическому нарастанию поглощения при длине волны 347 нм, обусловленному накоплением продукта окисления, не описанного ранее в литературе, и опережающим по времени образование адренохрома (с максимумом поглощения при 480 нм).

Реактивы:

1. 0.1 % (5.46 мМ) аптечный раствор адреналина;

2. бикарбонатный буфер, pH=11 (2.12 г Na2CO3, 0.168 г NaHCO3, 0.074 г ЭДТА растворяли в 200 мл дистиллированной воды; pH доводили до нужного значения добавлением NaOH);

3. этанол-хлороформная смесь (2:1).

Ход определения:

В качестве источника СОД используют эритроцитарный гемолизат, плазму крови или гомогенаты тканей. В пробирку вносят 50 мкл плазмы или гомогената и 450 мкл дистиллированной воды, предварительно охлажденной до 0°С. В пробирки добавляют по 250 мкл этанол-хлороформной смеси. Полученная суспензия интенсивно перемешивается и центрифугируется при 8000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант используется для определения активности СОД. Измерение проводится в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Последовательность внесения реагентов в пробу представлена в табл.2.3. Исходная концентрация адреналина в пробе равна 230 мкМ.

После внесения адреналина в холостую пробу, содержащую бикарбонатный буфер, содержимое кюветы тщательно и быстро перемешивается. Изменение оптической плотности регистрируется через каждые 30 секунд в течение 3 минут. Аналогичным образом обрабатывается и опытная проба. Для расчета активности СОД используют показатели величины поглощения контрольной и опытной проб.

Таблица 3 - Порядок внесения реагентов в пробу

Реагенты	Контрольная	Опытная
0,2 М бикарбонатный буфер, рН 11	3 мл	3 мл
Дистиллированная вода	0,05 мл	-
Супернатант (плазма)	-	0,05 мл
5,46 мМ раствор адреналина	0,15 мл	0,15 мл

Активность фермента выражают в Единицах активности на грамм Нb или белка (за Единицу активности СОД принято 50% ингибирование реакции окисления адреналина). Расчет активности СОД производят по формуле:

,(2.9)

где - Ед. активности на мл плазмы, гомогената;

Ео - оптическая плотность опытной пробы;

Ек - оптическая плотность холостой (контрольной) пробы;

50 - коэффициет пересчета на единицу активности СОД;

F - коэффициент разведения материала в пробе, равный 15;

Vрс - объем реакционной среды, равный 3,15 мл;

Vпр - объем вносимого образца (плазма, гомогенат), равный 0,05 мл;

d - длина оптической пути кюветы (1 см);

Нb - содержание гемоглобина, г/л (либо с - концентрация белка, г/л);

1000 - коэффициент для расчёта результата на грамм Нb или грамм белка.

2.8 Определение активности каталазы

Каталаза катализирует разложение пероксида водорода по реакции:

2 Н2О2 > 2 Н2О + О2(2.10)

О ходе реакции судят по изменению концентрации пероксида водорода в пробе спектрофотометрическим методом при длине волны 230 нм, максимуме поглощения Н2О2. В качестве источника фермента можно использовать гомогенаты тканей, клетки крови, биологические жидкости, субклеточные органеллы.

Реактивы:

1. 1 М трис-НСl буфер, рН 8,0, содержащий 5 мМ ЭДТА. Для приготовления буферного раствора 12,1 г триса и 0,186 г динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой.

2. 1 М фосфатный буфер, рН 7,0. Для его приготовления берут 14,13 г фосфата натрия двузамещённого, помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой.

3. 10 мМ раствор пероксида водорода (0,03%).

Ход определения:

Для определения активности каталазы готовят две пробы - контрольную и опытную в соответствии с таблицей.

Таблица 4 - Содержание проб для определения активности каталазы

Компоненты инкубационной пробы	Контрольная проба, мл	Опытная проба, мл
1 М трис-НСl буфер с 5 мМ ЭДТА, рН 8,0	0,15	0,15
Н2О2	-	2,70
Н2О	2,85	0,15
Гомогенат, плазма	0,06	0,06

Реакцию запускают внесением в пробу, находящуюся в спектрофотометрической кювете с расстоянием между рабочими гранями 1,0 см, гомогената, плазмы или гемолизата. Содержимое кюветы перемешивают и определяют начальную оптическую плотность. За ходом реакции следят в течение 3 минут. Регистрацию оптической плотности проводят при комнатной температуре.

Для приготовления гемолизата к 0,1 мл упакованных эритроцитов или 0,1 мл гомогената ткани приливают 2 мл охлаждённой до 0оС дистиллированной воды. Далее для определения активности каталазы в эритроцитах полученный 1мл гемолизата разводят до 100 мл водой (или 5 мкл на 10,6 мл дистиллированной воды). Расчет активности каталазы производят по формуле:

А = (ДЕ / мин ? е ·с) · F · 1000,(2.11)

где А - активность фермента в моль/мин · г Нb или моль/мин · г белка;

ДЕ / мин - изменение оптической плотности в минуту;

е - коэффициент молярной экстинкции пероксида водорода, при л =230 нм равный 0,071 М-1·см-1;

с - концентрация белка, г/л;

F - коэффициент учитывающий разведение супернатанта (21) и эритроцитов (2121).

2.9 Статистическая обработка результатов

Для обработки полученных результатов использовалась программа Statistica 6. Обработку результатов проводили с помощью подсчета медианы и интерквартального разброса (С25 и С75 процентели). Проверку гипотезы о статистической достоверности двух выборок проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок с достоверностью p<0,05.

3. Результаты исследования

Об оценке функционального состояния АОС судили на основании определения про- и актиоксидантного статуса. Прооксидантный статус оценивался по содержанию продуктов ПОЛ: ДК и МДА. Антиоксидантный статус оценивался по активности СОД и каталазы. Данные параметры были исследованы в плазме и почках подопытных животных.

3.1 Уровень аланинаминотрансферазы

Аланинаминотрансфераза синтезируется внутриклеточно, и в норме лишь небольшая часть этого фермента попадает в кровь. Наиболее высокая активность АлАТ выявляется в печени и почках, меньшая - в поджелудочной железе, сердце, скелетной мускулатуре. При повреждении или разрушении клеток, богатых АлАТ (печень, почки), происходит выброс этого фермента в кровяное русло, что приводит к повышению его активности в крови. Поэтому в качестве показателя степени токсического поражения печени и почек в плазме измеряли активность АлАТ (Рисунок 5).

Рисунок 5 - Активность АлАТ в плазме до введения ССl4, после введения и под влиянием б-токоферола (* р<0,05)

Активность аланинаминотрансферазы, в группе подвергшейся воздействию ССl4, повышается в 3,1 раз (р<0,05), по сравнению с контрольной группой. Показатели АлАТ у животных получавших в течение 14 дней б-токоферол находятся на одном уровне со значениями контроля. В четвёртой группе, где крысам перед введением тетрахлорметана две недели ежедневно per os давали витамин Е, активность энзима превышает значения контроля и группы с введённым б-токоферолом на 71% (р<0,05). Тогда как, по сравнению с группой «CCl4» фермент проявляет значительно меньшую активность - активность в группе «б-Т+CCl4» на 43% ниже чем в «CCl4» (р<0,05). В случае, когда витамин Е в течение 14 дней вводили после отравления тетрахлорметаном, активности трансаминазы превышала значения контроля на 35%, относительно группы «ССl4» активность АлАТ снижалась в 2 раза, однако данные изменения не достоверны.

Таким образом, значительное повышение активности АлАТ после отравления свидетельствует, о том, что введение 50% раствора тетрахлорметана вызывает разрушение плазматических мембран. Данные, что приём витамина Е до и после введения токсиканта снижает активность аланинаминотрансферазы указывают на нефро- и гепатопротекторное действие б-токоферола, которое очевидно связано со способностью витамина стабилизировать клеточные мембраны.

3.2 Показатели про- и антиоксидантной системы в плазме при интоксикации тетрахлорметаном

В плазме крови б-токоферол является основным и вероятно единственным липидрастворимым антиоксидантом. Основным переносчиком витамина Е в плазме крови являются липопротеины. Плазма крови - первая реагирует на недостаток токоферола в организме, что является важным признаком при диагностике и лечении ряда заболеваний.

Концентрация МДА и ДК (Рисунок 6, 7) в плазме у животных с введённым четырёххлористым углеродом достоверно превышает значения контрольной группы, на 67,3% и 40% соответственно (р<0,05), что подтверждает активацию процессов перекисного окисления.

Рисунок 6 - Концентрация МДА в плазме до введения ССl4, после введения и под влиянием б-токоферола (* р<0,05)

Рисунок 7 - Концентрация ДК в плазме до введения ССl4, после введения и под влиянием б-токоферола (* р<0,05)

Уровень продуктов ПОЛ у крыс, которым ежедневно в течение 14 дней вводили 200 мг б-токоферола, снижался по сравнению с контролем - МДА на 18% (р<0,05), ДК на 4,3%. При введение витамина Е до интоксикации наблюдалось повышение концентрации МДА относительно нормы - на 17% (р<0,05), концентрации диеновых конъюгатов на 5% (р<0,05). Однако, концентрация продуктов перекисного окисления не достигла такого высокого уровня, который наблюдается при воздействии только токсикантом.

Применение витамина после поражения ядом, способствовало небольшому снижению МДА и ДК по сравнению с группой «б-Т+CCl4»: концентрация МДА ниже на 6%, ДК - на 4% (р<0,05). Относительно контроля концентрация МДА в этой группе выше на 12% (р<0,05), ДК - на одном уровне с нормой.

Если сравнивать соотношение показателей групп «б-Т» и «б-Т+CCl4», то видно, что концентрация МДА плазмы в четвёртой группе повышается по сравнению с «б-Т» на 32% (р<0,05), тогда как концентрация ДК превосходит значение этой группы только на 9%, но эти значения не достоверны.

Введение витамина Е оказывает явный положительный эффект при отравлении тетрахлометаном, т.к. значения концентрации и ДК и МДА достоверно снижаются по сравнению с группой «CCl4» - ДК на 24% («б-Т+CCl4» относительно «CCl4») и 27% («CCl4+б-Т» относительно «CCl4») (р<0,05), МДА на 28% и 32% соответственно (р<0,05).

На первые сутки после введения четырёххлористого углерода наблюдается снижение активности антиоксидантных ферментов по сравнению со здоровыми животными: СОД снижается на 42%, каталаза - на 40% (р<0,05) (Рисунок 8, 9).

Рисунок 8 - Активность СОД в плазме до введения ССl4, после введения и под влиянием б-токоферола (* р<0,05)

В плазме животных, которым вводили б-токоферол, наблюдается повышение активности каталазы по сравнению с контрольными показателями на 13% (р<0,05). Активность СОД в группе «б-Т» не изменяется по сравнению с нормой. Относительно группы «CCl4», уровень активности ферментов в группе «б-Т» выше: СОД на 35%, каталазы на 48% (р<0,05).

Рисунок 9 - Активность каталазы в плазме до введения ССl4, после введения и под влиянием б-токоферола (* р<0,05)

Предварительное применение витамина Е способствует активации СОД и каталазы после воздействия CCl4. Относительно контроля активность СОД повышается на 17%, а каталазы на 26% (р<0,05). По сравнению с животными, которым вводили CCl4 активность СОД повышается на 44% (р<0,05), активность каталазы - на 55% (р<0,05). Исходя из этого, можно предположить, что б-токоферол оказывает на каталазу более стимулирующее влияние, чем на активность СОД.

Применение витамина в течение 14 дней после влияния тетрахлорметана, приводит к тому, что активность антиоксидантных ферментов снижается относительно группы «б-Т+CCl4»: СОД на 10%, каталазы на 17%. Однако, данные значения не достигают значений контрольной группы.

3.3 Показатели про- и антиоксидантной системы в почках при интоксикации тетрахлорметаном

Почки чрезвычайно сложный орган, как в плане морфологии, так и физиологии, основные функции которого ? экскреция продуктов метаболизма из организма, регуляция водного и электролитного баланса. Поскольку основные транспортные и концентрационные процессы происходят в проксимальном отделе канальцев, именно этот отдел нефрона наиболее часто повреждается токсикантами.

Важной функцией почек, сказывающейся на нефротоксичности ряда веществ, является их способность метаболизировать ксенобиотики. Хотя интенсивность метаболизма значительно ниже, чем в печени, здесь определяются те же ферментативные системы, и напряженность биотрансформации достаточно высока. Хотя многие ксенобиотики одновременно метаболизируют с образованием активных радикалов и в печени и в почках, повреждение органа, по всей видимости, обусловлено действием той части общего количества вещества, которая метаболизирует именно в почках. Близость метаболических процессов, протекающих в печени и почках, обусловливает практически одинаковую чувствительность этих органов ко многим ксенобиотикам (хлорированные углеводороды, токсины бледной поганки, паракват и др.).

Через сутки после введения животным тетрахлорметана наблюдается повышение уровня МДА в гомогенате почек в 2 раза (р<0,05) по сравнению с контролем, концентрация диеновых коньюгатов увеличивается на 40% (р<0,05) (Рисунок 10, 11).

Применение б-токоферола снижает содержание продуктов перекисного окисления по сравнению с показателями интактных животных: МДА на 14% (р<0,05), ДК на 4% (р<0,05).

Применение витамина Е до и после воздействия ядом ведёт к незначительным изменениям концентрации продуктов ПОЛ относительно контроля. В группе «б-Т+CCl4» содержание МДА выше нормы на 5,1% (р<0,05), показатели ДК равны норме, но эти изменения недостоверны. При применении токоферола после отравления, уровень МДА снижается на 7% (р<0,05), ДК - на пол процента (р<0,05).

Концентрация продуктов ПОЛ четвёртой и пятой групп превышает показатели у животных, которым в течение двух недель вводили только б-токоферол. В группе с введённым витамином Е до ССl4 МДА на 20% (р<0,05), ДК на 4% выше, в группе «CCl4+б-Т» МДА выше на 8%, ДК на 4% относительно «б-Т» (р<0,05).

Рисунок 10 - Концентрация МДА в почках до введения ССl4, после введения и под влиянием б-токоферола (* р<0,05)

Концентрация МДА в группе «б-Т+CCl4» на 52% ниже (р<0,05), чем в группе, где животные подвергались только воздействию токсиканта, ДК ниже на 40% (р<0,05). В пятой группе уровень ДК и МДА также значительно ниже показателей группы «ССl4»: ДК на 40% (р<0,05), МДА на 54% (р<0,05).



Рисунок 11 - Концентрация ДК в почках до введения ССl4, после введения и под влиянием б-токоферола (* р<0,05)

Применение витамина Е после интоксикации ведёт к уменьшению МДА в почках относительно показателей группы «б-Т+CCl4» на 5% (р<0,05), а концентрация диеновых конъюгатов остаётся на том же уровне.

Активность антиоксидантных ферментов в почках под влиянием четырёххлористого углерода спустя 24 часа после воздействия ССl4 достоверно понижается (Рисунок 12, 13). Так активность СОД относительно контроля снижается на 25% (р<0,05), активность каталазы - на 26% (р<0,05).

Рисунок 12 - Активность СОД в почках до введения ССl4, после введения и под влиянием б-токоферола (* р<0,05)



Рисунок 13 - Активность каталазы в почках до введения ССl4, после введения и под влиянием б-токоферола (* р<0,05)

При воздействии б-токоферола на здоровых особей активность супероксиддисмутазы и каталазы увеличилась относительно контроля: СОД на 10% (р<0,05), каталазы на 21% (р<0,05).

Предварительное введение витамина Е до воздействия ССl4 привело к активации ферментов. Относительно нормы активность супероксиддисмутазы повысилась на 19% (р<0,05), относительно группы «б-Т» на 10% (р<0,05). Активность каталазы в этой группе превышает контрольные значения на 34% (p<0,05), а также превышает активность, у животных с введённым б-токоферолом - на 16% (p<0,05).

При применение б-токоферола после отравления тетрахлорметаном активность СОД ниже, чем в группе «б-Т+CCl4» (на 13%), активность каталазы - на 3%. Уровень СОД по сравнению с животными, которые просто получали витамин Е снижен на 4%, а активность каталазы, наоборот, выше на 13%, но данные изменения не достоверны. Уровень активности супероксиддисмутазы данной группы выше значений контроля на 6%. Активность каталазы превышает значения группы интактных животных на 32%, но полученные изменение не достоверны.

Таким образом, общая «картина» про- и антиоксидантной системы такова:

1. концентрация продуктов перекисного окисления липидов, как в плазме, так и в гомогенате почек, после отравления животных тетрахлорметаном, в разы превышает значения интактных животных, что подтверждает активацию процессов СРО. Данное повышение МДА и ДК происходит на фоне ингибирования активности СОД и каталазы под влиянием яда. В ходе метаболизма ксенобиотика образуется огромное количество свободных радикалов, которые повреждают мембраны клеток и запускают каскад перекисного окисления липидов. Такое «поведение» энзимов можно объяснить тем, что ферментативная антиоксидантная система не справляется с таким стремительным увеличением повреждающих радикалов, что приводит к быстрой инактивации пула ферментов, следовательно, ведёт к истощению АОС. Ещё одной причиной снижения активности ферментов, вероятно, является то, что высокореактивные радикалы, образующиеся в ходе метаболизма тетрахлорметана (трихлорметильный радикала (ССl3?) и трихлорметилпероксильный радикал (ССl3О2?)), вступают в реакцию с белковой молекулой фермента, инактивируя его. Так, активность каталазы может быть снижена за счёт окисления Fe3+, входящего в состав гема. В результате, в окисленном состоянии каталаза проявляет гораздо меньшую активность.

2. Под воздействием альфа-токоферола, концентрация МДА в плазме и почках (р<0,05) и ДК в почках (р<0,05) ниже контрольных значений, ДК в плазме на уровне нормы. Возможно, такое влияние можно объяснить стабилизирующим действием витамина на структуру мембран клеток, и уменьшением в них естественной активности ПОЛ, либо такой эффект является следствием проявления антиоксидантных свойств самого токоферола, а так же активацией им ферментов АОЗ.