Для того чтобы объективно сравнить две хроматограммы необходимо учитывать следующее. Во-первых, спектрофотометрический детектор хроматографа как любой измерительный прибор вносит некоторую погрешность в получаемые данные (шум, дрейф, нелинейность и пр.). Во-вторых, получаемые восьмиточечные спектры веществ могут значимо зависеть в некоторых случаях от состава растворителя, в котором производится запись спектров, а этот состав в определенных пределах может изменяться. В-третьих, если в анализируемом образце содержатся примеси мешающих веществ, которые не отделяются колонкой от целевых соединений, то на спектры целевых веществ будут накладываться спектры мешающих соединений. В этих условиях достоверная идентификация пиков на хроматограмме требует привлечения специальных алгоритмов, один из которых мы рассмотрим далее.

Для автоматического сравнения пригодны различные статистические подходы. Наилучшие результаты можно получить, используя метод наименьших квадратов, при этом сравнение двух хроматограмм дает коэффициент совпадения, определяемый следующим образом:

,

где x и y - измеренные значения сигналов детектора (оптические поглощения) в первом и втором спектрах на соответствующих длинах волн, а n - количество данных.

В случае коэффициента, равного 0, алгоритм показывает полное несовпадение, а коэффициент, равный 1, говорит о полной идентичности хроматограмм. Обычно значение коэффициента совпадения выше 0,990 показывает, что хроматограммы подобны. Значения от 0,900 до 0,990 показывают, что исследуемые хроматограммы подобны, но результат следует интерпретировать с осторожностью. Все значения ниже 0,900 подразумевают, что мы имеем дело с двумя различными хроматограммами.

Коэффициент совпадения зависит от ряда параметров, которые можно разделить на математические и системные. Последние определяются пробой, устройством хроматографа и методом разделения. Они включают в себя специфику веществ, уровни спектральных шумов, спектры мешающих веществ, а также чувствительностью спектров к составу растворителя. Математические параметры включают в себя производные спектры, алгоритм сглаживания, линейность и точность настройки монохроматора детектора, порог поглощения. Влияние этих параметров можно учесть с помощью программного обеспечения - существует много публикаций, посвященных данным проблемам. В общем виде количественная оценка учета этих влияний затруднительна и зависит от многих причин. Рассмотрим некоторые из них подробнее.

Достоверность любого результата будет стремиться к нулю, если уровень спектральных шумов будет иметь тот же порядок, что и максимальное поглощение на выбранных длинах волн. В работе [2] показано, что коэффициент совпадения снижался с 1 до 0,985 при повышении уровня шумов с 0% до 5%. Относительный уровень шумов менее 2% не оказывал существенного влияния на результаты сравнения.

Уровень шумов на хроматограмме можно понизить путем их сглаживания (фильтрация), однако влияние фильтра на коэффициент совпадения зависит от его вида: например, применение семиразрядного фильтра Савицкого-Голея [11] дает небольшое улучшение коэффициента совпадения. Его влияние будет возрастать при расширении полосы фильтрации, но при применении фильтра со слишком широкой полосой теряется тонкая структура хроматограммы, поэтому такие фильтры следует применять только для хроматограмм, не имеющих тонкой структуры. Также, при необходимости быстрой обработки данных, может применяться фильтр Калмана, позволяющий проводить сглаживание сигнала в реальном времени. Общая идея фильтра Калмана состоит в том, что модель уточняется по ходу развития процесса. Как только становятся доступны новые данные, модель дополняется и улучшается. Несмотря на то, что с появлением мощных и быстрых вычислительных систем нужда в использовании этого фильтра практически исчезла, встречаются отдельные работы, где он может оказаться полезным [6].

Обработка аналитических данных с помощью различных преобразований играет важную роль в химическом анализе. Так, применение преобразования Фурье, за последние 20 лет, по сути, произвело революцию в спектроскопии. Замена аналоговых технологий на цифровые позволяет регистрировать сигналы не в виде привычных спектров, а в виде временных рядов, для восстановления информации из которых требуются математические преобразования. Одной из целей применения преобразования Фурье является увеличение соотношения сигнал/шум при одновременном ускорении процесса обработки данных примерно в 100 раз [6] по сравнению с классическими методами. Кроме Фурье-спектроскопии существует большое количество методов, улучшающих качество данных, часто называемые Фурье-деконволюцией (разверткой, разделением сигналов), которые включают в себя различные манипуляции с данными, зависящими от времени. Собственно само преобразование Фурье применяется лишь на заключительном этапе [12].

Другим мощным современным методом обработки сигналов является вейвлет-анализ [10], являющийся естественным развитием и продолжением преобразования Фурье. Основным недостатком преобразования Фурье является то, что его базисные функции непрерывно зависят от времени, и поэтому его сложно применять для представления данных, зависящих от времени. В вейвлет-анализе применяются базовые функции с ограниченным диапазоном аргумента, которые сдвигаются вдоль оси сигнала и получаемые в результате сверки спектры дают частотно временное представление с разным разрешением, зависящим от ширины диапазона.

В случае проб сложного состава (объекты окружающей среды, пробы биологического происхождения и т.п.) всегда существует риск того, что мешающие соединения будут оказывать существенное влияние на результаты сравнения. В описанных в литературе случаях оценивается, что при уровне примесей менее 10% коэффициент совпадения остается выше 0,990. Для уменьшения влияния мешающего вещества его фон в пробе может быть устранен на вершине пика вычитанием хроматограмм на фронте или на базовой линии текущего пика перед запуском алгоритма сравнения [8].

Центральный вопрос любого хроматографического анализа - содержит ли пик один или больше компонентов (вопрос гомогенности пика). При выполнении анализа перекрывание пиков примесей и исследуемого соединения может сильно исказить результаты. В литературе предлагаются несколько методов алгоритмов по проверке гомогенности (чистоты) пика. Все они включают в себя вычисление отношения сигналов по разным каналам (например, поглощения при двух или более длинах волн), нормализацию сигналов, относящихся к разным частям пика, подавление спектров одного или нескольких компонентов, трехмерное представление данных на графике, развернутое представление спектров как функции времени, и т.д. Ответ на вопрос о наилучшем методе в значительной мере определяется тем, известны ли хроматограммы и спектры компонентов пробы и возможных примесей. Все существующие на данный момент методы дают соответствующие результаты только в том случае, когда все спектры соединений анализируемой пробы и примесей заметно различимы. Другим фактором, влияющим "правильность" анализа, являются различия времен удерживания веществ (качество разделения пиков). Очевидно, что чем оно лучше, тем выше достоверность идентификации и ниже порог детектирования примесей. Это справедливо для всех методов.

хроматограмма хроматография жидкостная образец

Одним из наиболее популярных методов является нормализация и сравнение спектров различных частей пика. Для выполнения рутинных анализов существуют специальные программы, которые автоматически нормализуют, накладывают и выдают спектры для каждого детектируемого пика.

Алгоритм, основанный на относительном двухволновом поглощении, использует тот факте, что для чистых веществ поглощение A на длине волны прямо пропорционально поглощению на другой длине волне :

,

где M - коэффициент, характеризующий чистое вещество на выбранной длине волны [2]. Об этом мы уже говорили ранее, объясняя принцип многоканального детектирования (см. рис.3). Важно, что отношение спектральных поглощений M для чистых веществ является постоянной величиной. Любая примесь, выходящая одновременно с основным пиком, вызовет отклонение от горизонтальной линии относительного поглощения (рис.4). Аналогично работают методы, основанные на вычислении относительного мультиволнового поглощения и на отношении площадей пиков на различных длинах волн. Применение этих методов существенно повышает достоверность аналитических результатов [8].

Рис.4. Фрагмент смоделированной на компьютере хроматограммы раствора 3-х пептидов с детектированием при четырех длинах волн (210, 220, 240 и 280 нм). Справа показан гомогенный (чистый) пик 1 с постоянными значениями спектральных отношений вдоль всего пика. Слева - два гетерогенных (неразделенных) пика 2 и 3. Хорошо видно изменение спектральных отношений при переходе от одного вещества к другому. Алгоритм программы моделирования хроматограмм пептидов опубликован в работе [13], а сама программа Chrom_P распространяется бесплатно [14].

Имея возможность находить коэффициент совпадения для двух представленных веществ, мы можем создать особую базу данных, состоящую из хроматограмм эталонных образцов веществ и, выполняя поиск по этой базе, находить вещества, идентичные исследуемому. Однако для современных исследований информации о простой идентичности спектров уже недостаточно. Для решения сложных поисковых задач, при анализе образцов, содержащих сотни веществ, часто требуется отвечать на вопросы:

· чем отличаются составы анализируемых образцов?

· в чем сходство составов анализируемых образцов?

Пример таких сложных хроматограмм приведен на рис.5 и 6. Они представляют собой результаты анализа двух образцов водных экстрактов коры осины, измельченной в скоростных мельницах при разных режимах. Исследования должны выявить особенности процесса глубоко измельчения и его влияние механо-химических превращений на изменение химического состава получаемого продукта.

Чтобы ответить на эти вопросы необходимо разработать алгоритмы, позволяющие из большого количества стандартных хроматограмм "сконструировать" усредненную "эталонную хроматограмму", а затем, сравнивая с ней хроматограммы интересующих образцов сказать, какие "лишние" пики присутствуют в пробе и отсутствуют в эталоне или наоборот. Учитывая наличие погрешности измерений, наличие химических и физических шумов, отсутствие должной информации о химическом строении веществ, входящих в состав образца, а также большой объем хроматографических и спектральных данных задача разработки таких алгоритмов представляется далеко не тривиальной.

Заключение

1. Цвет М.С. О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу / Труды Варшавского общества естествоиспытателей, 1903, Том XIV, Отделение биологии, Протокол №6, с.1-20.

2. Хубер Л. Применение диодно-матричного детектирования в ВЭЖХ / М. Мир, 1993 г.

3. Heyden Y. V. Extracting Information from Chromatographic Herbal Fingerprints / LCGC Europe, September 2008, pp.438-443.

4. Boque, R. Maroto A., Heyden Y. V. Assessment of Accuracy in Chromatographic Analysis / LCGC Europe, May 2008, pp.17-21.

5. Chau F., Mok D. K. Fingerprinting Analysis of Raw Herb: Application of Chemometrics Techniques for Finding out Chemical Fingerprint of Chinese Herb / Analytical Sciences, 2001, Vol.17, pp. a419-a422.

6. Померанцев А.Л., Родионова О.Е. Хемометрика в аналитической химии / Электронный ресурс, http://www.chemometrics.ru, свободный доступ.

7. Zeng Z-D., Liang Y-Z., Xu C-J.comparing chemical fingerprints of herbal medicines using modified window target-testing factor analysis / Anal. Bioanal. Chem., 2005, Vol.381, pp.913-924.

8. Baroni M., Benedetti P., Fraternale S. The CARSO procedure in process optimization / J. Chemom., 2003, Vol.17, p.9.

9. Hansen P. W. Pre-processing method minimizing the need for reference analyses / J. Chemom., 2001, Vol.15, p.123.

10. Чуи К. Введение в вэйвлеты / М. Мир, 2001.

11. Savitzky A., Golay M. J. E. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures / An. Chem., 1964.

12. Померанцев А.Л. Методы нелинейного регрессионного анализа для моделирования кинетики химических и физических процессов / Дис. д-ра физ. - мат. наук,, Москва, ИХФ РАН, 2003.

13. Азарова И.Н., Барам Г.И., Гольдберг Е.Л. Предсказание объемов удерживания и УФ-спектров пептидов в обращенно-фазовой ВЭЖХ / Биоорганическая химия, 2006, т.32, №1, с.56-63.

14. Программа Chrom_P: http://www.econova.ru/applications/production/files/production_soft_6. zip

Приложение