Умови хроматографічного аналізу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зміст

Введення

1. Умови хроматографічного аналізу в методі ВЕРХ

1.1 Обладнання

1.2 Рухома фаза

1.3 Нерухома фаза

1.4 Детектори

2. Критерії, що характеризують хроматографічний процес

3. Методика проведення аналізу

4. Застосування ВЕРХ

4.1 Ідентифікація

4.2 Кількісне визначення

4.3 Контроль домішок

5. Коректування хроматографічних умов

Висновок



Введення

Хроматографія -- це метод розділення, аналізу і фізико-хімічного дослідження речовин, який ґрунтується на відмінності в швидкості руху концентраційних зон компонентів, що досліджуються, котрі переміщуються в потоці рухомої фази, причому сполуки, що досліджуються, розподілені між обома фазами. Зазвичай нерухома фаза -- це сорбент з розвиненою поверхнею або рідина, адсорбована на твердому носії; рухома -- потік газу (пари) або рідини, який фільтрується через шар сорбенту. Обов'язковою умовою хроматографічного розділення речовин є відмінність у рівноважному або кінетичному розподіленні компонентів суміші між фазами. Відношення швидкості переміщення речовини до швидкості переміщення елюента позначають R_f (від англ. “relative front” - відносно фронту).

У залежності від агрегатного стану рухомої фази розрізняють: рідинну хроматографію і газову хроматографію.[2]

Рідинна хроматографія являє собою метод розділення, у якому рухомою фазою, поміщеною у колонку, є тонкодисперсна тверда речовина або рідина, нанесена на твердий тонкодисперсний носій, хімічно модифікований шляхом уведення органічних груп.

Рідинна хроматографія заснована на механізмах адсорбції, розподілу, іонного обміну або розділення за розмірами молекул.[3]

Залежно від агрегатного стану нерухомої фази розрізняють адсорбційну ( рідинно-твердофазну ) і розподільчу ( рідинно-рідкофазну ) рідинну хроматографію.[2] У фармацевтичному аналізі широкого застосування набуває високоефективна рідинна хроматографія ( ВЕРХ ). Про це свідчить включення методик ВЕРХ у ведучі зарубіжні фармакопеї: Фармакопею Європи (EP), Фармакопею Великобританії (BP), Фармакопею Німеччини (DAB), Американську фармакопею (USP), у Державну фармакопею України, а також у аналітичну нормативну документацію (АНД) по контролю якості лікарських засобів.[6,9]

ВЕРХ ( рідинна хроматографія високого тиску ) є варіантом колонкової хроматографії, у якому рухома фаза -- елюент -- проходить через сорбент, що заповнює колонку, з великою швидкістю за рахунок значного тиску на вході в колонку.

До ВЕРХ застосовуються всі кількісні співвідношення рідинної хроматографії.[2]

хроматографічний аналіз обладнання детектор



1. Умови хроматографічного аналізу в методі ВЕРХ

У методиці рекомендується зазначити такі умови аналізу:

• розміри хроматографічної колонки і матеріал, з якого вона виготовлена;

• тип нерухомої фази і, якщо необхідно, її комерційну марку;

• розмір часток нерухомої фази;

• температуру колонки;

• швидкість і склад рухомої фази;

• тип детектора.[3]

1.1 Обладнання

Основні вузли сучасного хроматографа: насос високого тиску, дозатор, високоефективна колонка, детектор з пристроєм, що реєструє результати аналізу.

Сучасні рідинні хроматографи сполучають з комп'ютерами або мікропроцесорами і споряджують пристроями, за допомогою яких можна автоматично проводити введення проби, підтримувати умови хроматографічного процесу за заданою програмою, автоматично оптимізувати умови розділення, проводити розрахунок кількісного складу суміші, що аналізується, за однією або декількома програмами і проводити якісний аналіз.

Насос високого тиску ( до 200-500 атм) забезпечує подачу елюенту в колонку з заданою постійною швидкістю. У деяких мікроколонкових хроматографах застосовують насоси порівняно низького тиску ( до 10-20 атм).

Хроматорафічні колонки виконують з нержавіючої сталі або скла довжиною 0,1 -- 0,3 м, з внутрішнім діаметром 3-8 мм і заповнюють сорбентом з діаметром часток 5 -- 10 мкм сферичної або неправильної форми за допомогою суспензійного методу. Щільне пакування часток адсорбенту малого діаметра дозволяє отримати високоефективне хроматографічне розділення компонентів суміші. [2]

1.2 Рухома фаза

Рухома фаза звичайно подається під тиском з однієї або декількох посудин і протікає через блок вводу проби, колонку, а потім через детектор із заданою швидкістю. Температуру хроматографічної колонки підтримують постійною. [3]

На відміну від ТШХ, вибір рухомої фази у ВЕРХ досить обмежений. Як правило, це суміші вода -- ацетонітрил або (рідше) вода -- метанол, вода -- тетрагідрофуран з модифікуючими добавками ( або без них ) буферних або іон-парних реагентів. В останньому випадку використовують солі фосфатної, сульфатної або оцтової кислот, літію перхлорат, солі алкілсульфонових кислот і алкіламонію і т. ін. Прищеплені сорбенти на основі силікагелю чутливі до реакції середовища, тому рН рухомої фази має бути в межах 2,0-8,0. На прямофазних сорбентах ( силікагелі ) можливе застосування більш кислих середовищ. Використання більш лужних рухомих фаз не бажане, бо може спричинити гідроліз прищеплених алкільних груп. Небажане воно і на прямофазних сорбентах, оскільки підвищує їх розчинність у рухомій фазі. Не рекомендується також уведення до складу рухомої фази деяких іонів, наприклад хлорид-іонів, оскільки вони викликають корозію нержавіючої сталі колонок.

Уведення модифікуючих добавок має на меті зменшити вплив небажаних механізмів адсорбції або створити її певний механізм.

Питання оптимізації складу рухомої фази -- одна з найбільш важких і ще не вирішених проблем рідинної хроматографії. Як загальний критерій необхідно враховувати, що об'єми утримання мають бути стійкими до незначних змін складу рухомої фази, в противному разі це призводить до невідтворенності умов хроматографування.

Склад рухомої фази, зазначений у відповідній монографії, може або залишатися незмінним протягом усього аналізу ( ізокритичне елюювання), або змінюватися за заданою програмою ( градієнтне елюювання ). Градієнтне елюювання дозволяє значно скоротити загальний час аналізу за рахунок скорочення часу виходу сполук, які сильно утримують колонкою; поліпшити розділення всієї суміші; поліпшити форму піка і зменшити “хвіст”; внаслідок невеликої відмінності у формі піків збільшує чутливість для ряду компонентів суміші, які виходять з колонки пізніше від інших.[2]

1.3 Нерухома фаза

Так як асортимент колонок, який є у продажу для ВЕРХ, дуже великий, то стає все трудніше знайти дві колонки з абсолютно однаковими властивостями. Ситуація ускладнюється тим, що кожен виробник робить рекламу своїх колонок, підбираючи умови та речовини для аналізу таким чином, щоб показати тільки позитивні характеристики колонки, а не порівнювати її з тими, що вже використовуються.

Якщо у вітчизняних АНД конкретно вказується колонка для аналізу методом ВЕРХ, то в зарубіжних фармакопеях дається лише загальне посилання на колонку з прищепленними октадецильними групами.[6]

Як сорбенти у ВЕРХ застосовують матеріали на основі силікагелю, дуже рідко -- на основі алюмінію окису. Останнім часом з'явилися полімерні сорбенти. Найбільш розповсюджені колонки, заповнені силікагелем з прищепленими октадецилсилільними (С₁₈) або октилсилільними (С₈) групами. Прямофазні колонки на основі чистого силікагелю використовують рідко. Це пов'язано з тим, що лікарські засоби, зазвичай, досить полярні речовини, більш рухомі на прищеплених ( алкілованих ) сорбентах. Іншою важливою причиною є те, що використання прямофазних сорбентів ( силікагелю ) потребує застосування рухомих фаз, до складу яких належать органічні розчинники ( етилацетат, ацетон, хлороформ і т. ін. ), які інтенсивно поглинають в ультрафіолеті, що ускладнює застоування спектрофотометричних детекторів.

У прищеплених сорбентів понад 50% поверхні залишається незакритою, тому при аналізі дуже полярних сполук ці сорбенти проявляють прямофазні властивості. У такому разі значні елююючі властивості проявляє вода, неактивна у випадку малополярних речовин.

Тип прищепленого сорбенту визначається умовами поставленого завдання і пов'язується з рухомою фазою. В деяких випадках замість сорбентів з прищепленими С₁₈ -групами застосовують більш полярні сорбенти з прищепленими С₈, С ₃, а також CN-групами.[2]

При проведенні хроматографічного аналізу з використанням іон-парних реагентів ( алкілсульфонати, а також симетричні чи асиметричні солі четвертинного амонію) часто стає проблема повноти відмивання сорбенту від модифікуючого агенту рухомої фази ( оборотна взаємодія ). Так, наприклад, при використанні додецилсульфату натрія, останній сильно адсорбується на поверхні силікагелю, що, в кінцевому випадку, впливає на хроматографічні властивості сорбентів. Ця модифікація може привести до невідтворюваності хроматограм на новій колонці.

Ще одним фактором, який впливає на хроматографічні властивості сорбентів, є проведення попередньої хімічної модифікації досліджуваних речовин перед їх хроматографуванням ( наприклад, визначення компонентного складу гентаміцину сульфату після взаємодії з тіогліколієвою кислотою чи визначення амінокислот через їх динітробензольні похідні ). При хроматографуванні таких проб поверхня силікагелю у значній мірі схильна до впливу модифікуючих реагентів ( в нашому випадку тіогліколієвої кислоти чи динітрофторбензолу). При цьому властивості поверхні за рахунок необоротної хімічної взаємодії змінюються у значній мірі, так, що проведення іншого, більш простішого аналізу неможливо.

Сорбенти одного і того ж типу виробництва різних фірм дещо відрізняються за хроматографічною поведінкою, що пов'язано з різним ступенем вкриття поверхні прищепленими групами і різною питомою поверхнею підкладки. Тому при аналізі лікарського засобу бажано орієнтуватися на колонки якоїсь однієї фірми або в тексті монографії має бути передбачена процедура оптимізації умов аналізу.[6]

1.4 Детектори

Як детектори в рідинній хроматографії звичайно використовують спектрофотометричний детектор з перемінною ( 190-900 нм ) або фіксованою ( найчастіше при 240 нм ) довжиною хвилі, рефрактометричний або флуорометричний детектори. Можуть бути використані й інші детектори, наприклад, ізонізаційнополуменевий, електрохімічні, мас-спектрометричний і т.ін.

При проведенні тестів “Контроль специфічних ( конкретно вказаних ) домішок” і “Кількісне визначення”, за інших рівних умов, доцільно застосовувати спектрофотометричний детектор з якомога більш специфічною довжиною хвилі детектування, щоб звести до мінімуму вплив на аналіз сторонніх речовин. Для цього довжину хвилі доцільно вибирати в максимумі поглинання сполуки, що досліджується.

При проведенні тестів на хроматографічну чистоту ( “Звичайні домішки”, “Хроматографічна чистота”, “Споріднені сполуки” і т. ін.) доцільно вибирати якомога менш специфічну довжину хвилі детектування ( 190-220 нм ), при якій інтенсивність поглинання різних сполук вирівнюється. При цьому зростають вимоги до чистоти ( пропускання ) рухомої фази. Під час розробки методики аналізу перевіряють стійкість до зміни аналітичної довжини хвилі детектування -- при відхиленні на 2-4 нм результати не повинні сильно змінюватись. Отриманні таким чином величини ( внутрішня нормалізація ) мають відносний характер ( через відмінності коефіцієнтів поглинання сполук, що досліджуються ). У цілому, чим менша довжина хвилі детектування, тим більш об'єктивні тести, що характеризують хроматографічну чистоту.

Недолік спектофотометричного детектора -- його недостатня універсальність: багато речовин ( цукри, спирти, аліфатичні аміни і т. ін.) погано поглинають навіть у дальньому ультрафіолеті. У цьому випадку доцільно використовувати універсальний детектор -- рефрактометричний. Однак, чутливість його на декілька порядків гірша від спектрофотометричного, що дуже обмежує його використання.[2]



2. Критерії, що характеризують хроматографічний процес

До них належать такі критерії: утримання, ефективність і ступінь розділення. Їх визначають за хроматограмою. Основною характеристикою речовини є об'єм утримання, який для і-того компонента розраховують за рівнянням:

V_Ri = F · t_i = V_m + K_i · V_s ,

де V_m = F·t_m - мертвий об'єм колонки, або об'єм утримання компонента, що не сорбується;

F - об'ємна швидкість рухомої фази;

t_m - час утримання компонента, що не сорбується;

t_i - час утримання і-того компонента;

К_і -- константа розподілення, яка дорівнює відношенню концентрації і-того компонента в нерухомій і рухомій фазах;

V_s - об'єм нерухомої фази.

Більш об'єктивною величиною є виправлений об'єм утримання:

V_Ni = V_Ri - V_m = K_i · V_s .

Для ідентифікації речовин користуються відносним об'ємом утримання r_i :

r_i = = ,

де V_Rст і t_ст -- об'єм і час утримання стандартної речовини.

Для перевірки достовірності результатів аналізу використовують такі показники, як коефіцієнт симетрії піка, коефіцієнт розділення, число теоретичних тарілок, коефіцієнт ємності компонента та відношення сигнал/шум.

Однією з характеристик хроматограми є форма піка. Вона залежить від навантаження й умов хроматографування ( вибору нерухомої фази, складу і швидкості руху рухомої фази ). При правильному виборі умов хромаграфування утворюються симетричні піки. Для перевірки правильності вибору умов хроматографування визначають коефіцієнт симетрії піка (рис.1), який обчислюють за формулою:

Кs =,

де b0,05 -- ширина піка на 1/20 його висоти;

А -- відстань між перпендикуляром, опущеним з максимуму піка, і переднім краєм піка на 1/20 його висоти.

Рис. 1 Схема хроматограми ВЕРХ



Мета хроматографії -- розділення за прийнятий проміжок часу компонентів суміші на окремі смуги ( піки ) в міру їх просування колонкою.

Розділення двох сусідніх піків характеризується коефіцієнтом розділення ( Rs ) ( рис. 1 ), який може бути обчислений за формулою:

Rs = , ,

де tR_a i tR_b - відстані вздовж базової лінії від точки введення проби до перпендикулярів, опущених з максимумів двох сусідніх піків, мм;

b_0,5a i b_0,5b - ширина піків на половині висоти, мм.

Якщо немає інших вказівок у монографіях, результати аналізу вважають достовірними, коли коефіцієнт розділення для піків, що вимірюються на хроматограмі, більший ніж 1,0. Ефективність колонки кількісно виражається числом теоретичних тарілок (n), яке може бути обчислене з даних, отриманих ізократичному режимі, за формулою:

n = 5,54,

де tR - відстань уздовж базової лінії від точки введення проби до перпендикуляра, опущеного з максимуму піка речовини, що аналізується, мм;

b0,5 - ширина піка на половині висоти, мм.

Число теоретичних тарілок характеризує ефективність розділення, яке визначається відносним розмиванням хроматографічних зон у колонці. По суті проводиться порівняння ширини піка з часом перебування компонента в колонці. Чим ефективніша колонка, тим менше розмивання смуг ( тобто утворюються вужчі піки). Як характеристику ефективності колонки використовують також висоту, еквівалентну теоретичній тарілці ( ВЕТТ ), яку розраховують за формулою:



Н = ,

де L -- довжина хроматографічної колонки.

Коефіцієнт ємності k' (відомий також як коефіцієнт розподілу маси Dm) визначають як :

Dm = k' = = ,

де К -- рівноважний коефіцієнт розподілу, який дорівнює відношенню концентрації речовини, що аналізується, в нерухомій фазі до її концентрації в рухомій фазі;

Vs i Vm -- об'єм нерухомої і рухомої фаз відповідно.

Малі значення k' показують, що компоненти слабко утримуються колонкою й елююються близько від піка речовини, яка колонкою не утримується. При цьому спостерігається погане розділення. Якщо значення k' великі, розділення поліпшується, однак зростає час аналізу і піки стають широкими, що ускладнює їх визначення.

Під час запису хроматографічного процесу навіть у холостому досліді або до чи після появи піка, як правило, самописець фіксує не пряму, а певну хвилясту лінію. Це так званий “шум”. Поява шумів може бути викликана, наприклад, утворенням бульбашок газів у детекторі при певному зниженні тиску або підвищенні температури. У деяких випадках шум може виникати в процесі підсилення сигналу детектора або в роботі самого самописного пристрою. Гранично допустимий рівень шумів регламентується відношенням сигнал/шум (S/N), яке розраховують за формулою:



S/N = ,

де h -- висота піка відповідного компонента на хроматограмі, отриманій для вказаного розчину порівняння;

hn - абсолютне значення найбільшої флуктуації шуму від базової лінії на хроматограмі контрольного розчину, яке спостерігається на проміжку, рівному двадцятикратній ширині на половині висоти піка, розміщеному рівномірно навколо місця розташування піка.[2,3]



3. Методика проведення аналізу

Перед початком досліджень хроматограф має бути перевірений за відповідною методикою, згідно з якою на стандартній колонці і наборі речовин-свідків ( фенілалкілкетонів ) перевіряються метрологічні характеристики відтворності об'єму утримання, висоти піків -- як у варіанті абсолютних величин, так і при внутрішньому нормуванні.

Відносні стандартні відхилення для об'ємів утримання площ і висот піків, якщо немає інших указівок у відповідних монографіях, не повинні перевищувати відповідно 1,5; 5; 4%. Відносні стандартні відхилення для відношень об'ємів утримання, площ і висот піків так само не повинні перевищувати відповідно 0,75; 2,5; 1,5%

Ураховуючи нестандартність сорбентів, відмінність однотипних сорбентів у різних фірм, а також зміну їх характеристик у процесі експлуатації, у тексті методик ВЕРХ у НТД обов'язково повинен бути текст “Придатність системи”, згідно з яким мають заздалегідь оцінюватися: відтворність відгуку ( площі, висоти піка, відношення висот або площ ), коефіцієнт розділення піків, фактор асиметрії, а також інші величини, наприклад, ефективність колонки ( число теоретичних тарілок n ) за якимось конкретним піком. Для визначення цих величин готується спеціальний розчин. Розрахунок проводиться за результатами п'яти повторних вимірювань.[2]

Колонку врівноважують при зазначеному складі рухомої фази. Готують випробуваний розчин і розчин(и) порівняння, як зазначено в окремій статті. Розчини не мають містити твердих часток. Використовуючи розчини порівняння, настроюють прилад і підбирають об'єми проб, що вводяться, які дозволяють одержати необхідний ( адекватний ) сигнал. Виконують повторнні введення для перевірки збіжності сигналу і перевіряють, якщо необхідно, число тарілок.

Вводять розчини і реєструють результати хроматографування. Для перевірки збіжності сигналу виконують повторні введення. Визначають площі піків аналізованих компонентів. У випадку, якщо коефіцієнт симетрії, обчислений, як описано вище, має значення від 0,8 до 1,20, допускається проводити визначення за вистою піків. При використанні градієнтного елюювання необхідно проводити визначення за площами піків. При використанні внутрішнього стандарту треба переконатися, що жоден з піків аналізованої речовини або його домішки не маскується піком внутрішнього стандарту.

З одержаних значень обчислюють вміст визначуваного компонента або компонентів. Якщо зазначено в окремій статті, відсотковий вміст одного або декількох компонентів аналізованої проби визначають за допомогою обчислення відсоткової частки площі відповідного піка або піків до сумарної площі всіх піків, виключаючи піки розчинників або доданих реактивів ( метод внутрішньої нормалізації ). У цих випадках рекомендується використання широкодіапазонного підсилювача і автоматичного інтегратора.[3]



4. Застосування ВЕРХ

При контролі якості лікарських засобів в тестах “Ідентифікація”, “Контроль специфічних домішок”, “Хроматографічна чистота”, “Розчинення”, “Однорідність дозування” і “Кількісне визначення”. Усі тести, крім “Ідентифікації”, є, фактично, варіантами “Кількісного визначення”.[2]

4.1 Ідентифікація

Ідентифікацію звичайно проводять одним із таких способів:

1) порівняння часів утримування аналізованої речовини у випробуваній пробі й розчині порівняння;

2) порівняння відносних часів утримування аналізованої речовини у випрбуваній пробі й розчині порівняння;

3) порівняння хроматограми випробуваної проби з хроматограмою розчину порівняння або з хроматограмою, наведеною в окремій статті.

( Відносний час утримування -- це відношення часу утримування аналізованої речовини до часу утримування речовини, взятої за стандарт).

Звичайно використовують перший спосіб. Другий спосіб доцільно використовувати, якщо можлива невідтворюваність умов хроматографування. Третій спосіб може застосовуватися для препаратів рослинного і тваринного походження.[3]

Приклад.

Ідентифікація кломіпраміну та меліпраміну методом ВЕРХ у фармацевтичних препаратах.

Кломіпрамін (3-хлор-5[3-(диетиламіно)пропіл]-10,11-дигідро-5Н-дибензо(b,f)-азепіну гідрохлорид) та меліпрамін (5-[3-(диметиламіно)пропіл]-10,11-дигідро-5Н-дибензо(b,f)-азепіну гідрохлорид) є трициклічними антидепресантами, що застосовуються в неврології та психіатрії.

Ідентифікація проводилася на рідинному хроматографі Alliance 2690 (Waters) з УФ-детектором з одержання не менше 5 хроматограм для кожного з розчинів в наступних умовах:

колонка довжиною 250 мм з внутрішнім діаметром 4мм, заповнена сорбентом Nucleosil C6H5 з розміром частинок 5 мкм. Аналіз проводився при кімнатній температурі (25°С). Ідентифікація та розділення проводилося в ізокритичному режимі з використанням в якості рухомої фази суміші ізопропанол:метанол:фосфатний буфер, взятих у співвідношенні 1:55:49 відповідно. Склад фосфатного буферного розчину: 0,01 М NaH?PO?, 0,006 M триетиламін і Н?РО? з рН 2,5. Швидкість елюювання -- 0,5 мл/хв.

УФ-спектри кломіпраміну та меліпраміну характеризуються піком поглинання при 197 нм, другий максимум поглинання знаходиться в ділянці 248-252 нм. Його положення залежить від нуклеофільного замісника в ароматичному циклі. Меліпрамін має другий максимум поглинання при 248,8 нм, а монохлорзаміщений кломіпрамін -- при 251,1 нм.

Для ідентифікації готували стандартні розчини кломіпраміну (10 мкг/мл та меліпраміну (10 мкг/мл) в рухомій фазі. Досліджувані проби розчинів

антидепресантів вводилися в хроматограф автоматично по 20 мкл.

Ідентифікація досліджуваних антидепресантів проводилася за їх часом утримування. Час утримуванння кломіпраміну становить 13,02 хв, а меліпраміну -- 10,03 хв. Чутливість методу складає 0,02 мкг для меліпраміну і 0,03 мкг -- для кломіпраміну у введеній пробі.

На хроматограмі спостерігається чітке розділення піків кломіпраміну та меліпраміну. Хроматограма представлена на рис.2.

Ця методика була використана для ідентифікації речовин у препаратах “Анафраніл Гейгі” (“Сіба-Гейгі АГ”, Швейцарія) -- розчин кломіпраміну гідрохлориду для ін'єкцій 25 мг/2мл та “Меліпрамін” - розчину іміпраміну гідрохлориду для інєкцій 25мг/2мл (“Егіс АТ”, Угорщина). [5]



4.2 Кількісне визначення

Кількісний аналіз методом ВЕРХ ґрунтується на припущенні, що площі (або висоти) піків, які відповідають індивідуальним сполукам на хроматограмі, пропорційні їх кількості або концентрації. Площини піків S на хроматограмі вимірюють за допомогою планіметра, інтеграторів площини піків, зважуванням вирізаних піків або обчислюють за такими формулами:

; ,

де S -- площа піка;

h -- висота піка;

b - ширина основи піка;

b0,5 -- ширина піка на середині висоти.[2]

Кількісний вміст речовин можна визначити декількома способами:

1. Абсолютне калібрування. Якщо немає зазначень в окремій статті, випробовуваний розчин і розчин порівняння поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі, одержуючи не менше п'яти хроматограм, в умовах, зазначених в окремій статті. Для випробовуваного розчину і розчину порівняння розраховують середні значення площ або висот піків аналізовано речовини. За одержаними середніми значеннями розраховують концентрацію аналізованої речовини у випробовуваному розчині.

2. Метод внутрішнього стандарту. Для кожної хроматограми спочатку розраховують відношення площі або висоти піка аналізованої речовини до площі або висоти піка внутрішнього стандарту. Одержані відношення усереднюють для випробовуваного розчину і розчину порівняння і за знайденими середніми значеннями визначають концентрацію аналізованої речовини у випробовуваному розчині.[3]

Приклад 1.

ВЕРХ в аналізі субстанції доксорубіцину

Доксорубіцин -- антибіотик широкого спектра дії. В якості нерухомої фази для визначення даного антибіотику використовують зворотньофазний сорбент “Новопак Т-18”, а у якості елюенту -- систему розчинників ізопропанол-ацетатний буфер (рН=4,5) у співвідношенні 3:7 (по об'єму). Визначення проводили на хроматографі “Water Alian” (USA) с детектором фотодіодної матриці з роміром колонки 150х3,9мм. Швидкість подачі елюенту становить 0,7 мл/хв при температурі колонки 37°С. У якості аналітичної була вибрана довжина хвилі 290 нм.

Приблизно 0,02 ( точна наважка ) субстанції доксорубіцину поміщають у мірну колбу об'ємом 25 мл і доводять водою до мітки ( розчин А). 4мл розчину А поміщають у мірну колбу ємкістю 100мл і доводять до мітки системою розчинників ізопропанол-ацетатний буфер (рН=4,5) у співвідношенні 3:7 ( розчин Б). Розчин Б фільтрують через скляний фільтр. Вводять у хроматограф 8мкл розчину Б, які були зібрані з наступних порцій фільтрату. Процес хроматографування проводили за схемою побудови каліброваного графіку. Кількісний вміст доксорубіцину розраховували за формулою:

; ,

де а -- наважка, г.[7]

Характеристики хроматографування доксорубіцину наведені в табл.1,а результати визначення та метрологічні характеристики в табл.2.

Табл. 1

Час утримування ,хв	Відхилення часу утримування від серенього значення,%	Стандартне відхилення площі піку, % (n=5)	Фактор асиметрії Т, %	Коефіцієнт розподілу ki
2,06	0,1	0,47	0,95	1,18



Табл.2 [7]

Субстанція доксорубіцину, наважка,г	Знайдено доксорубіцину	Метрологічні характеристики
	г	%
0,02115	0,02125	100,47	X=99,96
0,01965	0,02001	101,83	S=1,31
0,01890	0,01878	99,37	Sx=0,59
0,02070	0,02035	98,31	X±?X=99,96±1,63
0,02015	0,02011	99,80	?=1,63%

Приклад 2

ВЕРХ в аналізі каптоприлу

Каптоприл -- (2S)-1-[(2S)-3-меркапто-метилпропаноїл]піролідин-2-карбонова кислота -- синтетичний інгібітор ангіотензинконвертуючого ферменту є одним з найпризначуваніших антигіпертензивних засобів у терапії серцево-судинних захворювань.

Дослідження проводили на хроматографі “Міліхром А-02” (ЗАТ “ЕкоНова”, м. Новосибірськ) у зазначених умовах: колонки O2х75мм з оберненою фазою ProntoSIL-120-5-C18 AQ (“Bischoff Analysentechnik und Geraete GmbH”, Німеччина); градієнтне елюювання виконували змішуванням двох елюентів: елюент А -- [4M LiClO? - 0,1M HclO?] - H?O (5:95); елюент Б -- ацетонітрил “для ВЕРХ” (від 5% до 100% ацетонітрилу за 40 хв, потім 100% ацетонітрил протягом 3хв); швидкість потоку -- 100мкл/хв; температура колонки -- 40°С; обєм проби -- 2 мкл. УФ-детектування виконувалиодночасно при 8 довжинах хвиль: 210, 220, 230,240, 250, 260, 280 та 300 нм. Обробку хроматограм проводили за допомогою програми “Аналітика Chrom”, розробленою НВФ “Аналітика” (м.Харків). Правильність методики аналізу періодично контролювали шляхом хроматографування спеціального контрольного багатокомпонентного розчину.

Каптоприл (100 мг) вносили в мірну колбу місткістю 100,0 мл, розчиняли в невеликій кількості води очищеної та доводили об'єм розчину об'єм розчину водою очищеною до позначки ( стандартний розчин 1, концентрація 1000 мкг/мл ).

У мірну колбу місткістю 100,0 мл вносили 40,00 мл стандартного розчину 1 і доводили об'єм розчину водою очищеною до позначки ( стандартний розчин 2, концентрація 400 мкг/мл ).

У дві мірні колби місткістю 100,0 мл вносили по 50,00 та 25,00 стандартного розчину 2 і доводили об'єми до позначки водою очищеною ( розчини 3 та 4 відповідно, концентрація 200 та 100 мкг/мл). У мірну колбу місткістю 100,0 мл вносили 25,00 мл розчину 3 і доводили об'єм розчину до позначки водою очищеною ( розчин 5, концентрація 50 мкг/мл ). У мірну колбу місткістю 100,0 мл вносили 10,00 мл розчину 4 і доводили об'єм розчину до позначки водою очищеною ( розчин 6, концентрація 10 мкг/мл). У мірну колбу місткістю 100,0 мл вносили 10,00 мл розчину 6 та доводили об'єм розчину до позначки водою очищеною ( розчин 7, концентрація 1 мкг/мл). Розчини каптоприлу 2, 3, 4, 5, 6 та 7 хроматографували за вищезазначених умов; об'єм роби становив 2 мкл.[8]

Хроматографування кожного розчину проводили тричі. Результати дослідження наведені в табл.3

Результати кількісного визначення каптоприлу методом ВЕРХ у модельних розчинах ( ?=210 нм; об'єм проби 2 мкл )

Табл. 3[8]

Концентрація розчину каптоприлу, мкг/мл	Площа піку	Знайдено каптоприлу	Метрологічні харакристики
		мкг/мл	%
10,0	0,004550	10,70	107,00	Х=102,81 S=3,80 Sx=1,90 ?X=6,04 ?=±5,88% X±?X=102,81±6,04
50,0	0,02755	49,95	99,90
100,0	0,05647	99,30	99,30
200,0	0,1214	210,10	105,05



4.3 Контроль домішок

Для контролю домішок звичайно використовують такі підходи.

1. Кількісне визначення домішки з використанням розчину порівняння з відомою концентрацією домішки ( звичайно у варіанті абсолютного калібрування).Такий підхід передбачає однаковий відгук домішки у присутності й відсутності основної речовини.

2. Метод внутрішньої нормалізації. Такий підхід передбачає виконання лінійності у широкому діапазоні й може вимагати врахування відмінностей у відгуках домішки і основної речовини. Його часто застосовують для визначення суми домішок. При цьому суму площ усіх піків на хроматограмі ( без врахування піка розчинника ) беруть на 100% і вміст кожної конкретної домішки або суми домішок знаходять як частку площі піка цієї домішки або суми площ піків домішок у загальній сумі площ усіх піків на хроматограмі.

3. Порівняння з розведеним розчином основної речовини.

4. Метод стандартних добавок. До аналізованої проби додають відому кількість домішки. За даними хроматографування випробовуваної проби і випробовуваної проби з добавкою визначають вміст домішки. Для підвищення точності можливе використання методу внутрішнього стандарту.[3]

Приклад

Визначення сторонніх домішок у дипразині методом ВЕРХ.

Для лікування різноманітних захворювань в медичній практиці широко застосовується дипразин. При зберіганні, особливо під дією світла, дипразин легко окислюється з утворенням 9-S-оксидів і 9,9-S-диоксидів.

Під час роботи використовували субстанцію дипразину, яка по всім показникам відповідає відповідній НД.

Дослідження проводили на хроматографі “Мілліхром-2” з колонкою КАХ 3-64-3, заповненою сіласорбом 600. Довжина хвилі детектування 248 нм, масштаб регістрації 4,0, час вимірювання 0,4с.

У якості елюенту використана система етанол-гексан (7:3). Для переходу дипразина в основу використовували диетиламін.

Для аналізу 0,1г препарату розчиняли в суміші розчинників етанол-диетиламін (19:1). 1 мкл отриманого розчину вводили в колонку і хроматографували.

Площі піків домішок розраховували, помножуючи висоту піка на її ширину, виміряну на відстань, яка дорівнює половині висоти. Вміст домішок (?) в процентах розраховують за формулою:

*100%,

де Sзаг -- сума площ піків дипразину і домішок; Sдом -- площа чи сума площ піків домішок.[4]

Результати визначення сторонніх домішок у субстанції дипразину методом ВЕРХ

Вміст домішок у субстанції, %	Метрологічні характеристики
1,04 1,23 1,15 1,09 1,17 1,07	Х=1,13 Sx=0,029 ?X=0,074 ??=±6,59%



5. Коректування хроматографічних умов

Під час проведення дослідження допускається коректування хроматографічних умов, зазначених у відповідній монографії, яке виконують для досягнення придатності системи. У межах цих змін методика була валідована при її розробці. Тести на придатність системи включають у методику для забезпечення необхідної якості хроматографії ( розділення, форма піка, збіжність результатів ). Однак, оскільки нерухома фаза описана в статті в загальному вигляді, є багато комерційно доступних сорбентів указаного типу з дещо відмінними властивостями, для досягнення вимог щодо придатності системи може знадобитися коректування хроматографічних умов. Іноді, зокрема для оберненофазної хроматографії, воно не завжди призводить до досягнення необхідних вимог. У такому разі слід замінити колонку на аналогічну, але з іншою комерційною маркою сорбенту, який забезпечує виконання необхідних умов.

Для критичних параметрів рекомендації з їх регулювання з метою досягнення виконання вимог щодо до придатності системи чітко обумовлюють у відповідній монографії.

Слід уникати одночасної зміни декількох умов аналізу, коли це може справити кумулятивний ефект на систему.

Склад рухомої фази: концентрація мінорного розчинника може бути змінена на ±30% відносних або ±2% абсолютних залежно від того, який вираз більший. Для інших компонентів концентрація може бути змінена на ±10% абсолютних.

рН водних компонентів рухомої фази: ±0,2 одиниці рН; при аналізі нейтральних речовин ±1,0 одини ці рН.

Концентрація солей у буферному розчині, який уходить до складу рухомої фази: ±10%.

Коректування довжини хвилі детектування не допускається.

Колонка: довжина ±70%; внутрішній діаметр ±25%; розмір частинок не більше 50% у бік зменшення; не допускається збільшення частинок.

Швидкість рухомої фази: ±50%.

Об'єм введеної проби може бути зменшений за умови виконання вимог щодо детектування піка і збіжності результатів.

Програма градієнта: конфігурація обладнання, що використовується, може суттєво впливати на ступінь розділення, час утримання і відносний час утримання, описані в методиці. На ці параметри впливає об'єм комунікації, тобто об'єм між точкою зміщення компонентів рухомої фази і колонкою.[2,6]



Висновок

Високоефективна рідкісна хроматографія ( ВЕРХ) -- найважливіший метод фармакопейного аналізу субстанцій і лікарських речовин, та навіть через 30 років після своєї появи, він залишається одним з самих трудомістких, тривалих і дорогих методів.

Головну причину цього можна побачити у консервативному підході до використання ВЕРХ, який закріпився у ведучих Фармакопеях світу. Це обумовлено тим, що розробка кожної процедури ВЕРХ-аналізу виконується самими авторами фармакопейних статтей згідно з їх можливостями та знаннями. Як висновок, кожній речовині ставиться відповідно своя “ унікальна ” процедура аналізу, яка вимагає “ своєї ” хроматографічної колонки, “ своїх ” рухомих фаз, “ своєї ” методики калібрування хроматографа. Навіть відносно не важкий аналіз вимагає набору допоміжних матеріалів, висококваліфікованих спеціалістів і це займає багато часу. Так, наприклад, ВЕРХ-аналіз ампіциліну згідно монографії Європейської Фармакопеї займає більше 15 годин.[1]

Тому проблема удосконалення ВЕРХ-аналізаторів дуже актуальна в наш час і вирішення цього питання зіграє не аби яку роль у здійсненні ефективного контролю якості лікарських засобів.

Перевага ВЕРХ перед іншими методиками -- її універсальність і об'єктивність. Порівняно з ТШХ ВЕРХ має вищу ефективність розділення, а також дає можливість одержання кількісних, а не напівкількісних, як у ТШХ, результатів. ВЕРХ зараз є основним методом кількісного визначення у фармакопеї США, широко застосовується у Європейській, Британській, Німецькій фармакопеях і, в перспективі, може витіснити всі інші методи аналізу.



Література

1. Барам Г. И. Новые возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармакопейном анализе / Д. В. Рейхарт, Е. Д. Гольдберг, Б. Н. Изотов, М. О. Родинко, В. А. Хазанов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -- 2003. - Т.135, №1. - С.75-79

2. Безуглий П. О. Фармацевтичний посібник / В.О. Грудько, С.Г. Леонова, С.Г. Таран, І.В. Українець, Н.В. Гарная, В.А. Георгіянц, Л.В. Сидоренко. - Х.: Вид-во НфаУ “Золоті сторінки”, 2001. - 240с.

3. Державна фармакопея України / Державне підприємство “Науково-експертний центр”, - 1-е вид. - Х.: РІРЕГ, 2001. - 531с.

4. Компанцева Е.В. Определение посторонних примесей в дипразине методом ВЭЖХ / М.В. Гаврилин, И.И. Монастырева // Фармация. - 1999. - Т.ХL VIII, №.1. - С.26-27.

5. Костишин Л.П. Ідентифікація та кількісне визначення кломіпраміну та меліпраміну методом високоефективної рідинної хроматографії у фармацевтичних препаратах // Вісник фармації. - 2005.- №.4. - С.24-27

6. Куликов А.Ю. Высокоэффективная жидкостная хроматография в фармацевтическом анализе. Сообщение 1. / А.Г. Верушкин, С.А. Шкляев // Фармаком. - 2001. - №.1. - С.47-56.

7. Шарманов В.К. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе доксорубицина / Е.Н. Карпенко, Л.Е. Сипливая, Л.Н. Ерофеева, О.Д. Печенин // Фармация. - 2004.- №.3.- С.8-10

8. Шовкова З.В. Високоефективна рідинна хроматографія в аналізі каптоприлу / С.І. Мерзлікін, В.В. Болотов // ВІСНИК ФАРМАЦІЇ. - 2006.- №.3. - С.31-34

Размещено на Allbest.ru