Размещено на http://www.allbest.ru/

33

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вступ

Біосурфактанти (ПАР) сьогодні використовуються в багатьох галузях промисловості. З кожним днем сфера їх застосування розширюється. Тому доцільно шукати нові методи їх отримання і вдосконалювати існуючі. Одним з перспективних методів є мікробний синтез.

Синтез ПАР мікроорганізмами має ряд переваг над хімічним синтезом. Він дозволяє значно здешевити технологію (отже і знизити кінцеву вартість отриманих сполук). Крім того, біосурфактанти, на відміну від синтетичних ПАР, піддаються біодеградації, мають вищу спорідненість з навколишнім середовищем, стійкіші до коливань температури і значень рН. Тому на сьогодні багато уваги приділяють вивченню синтезу сурфактантів мікроорганізмами [1].

Початковим етапом досліджень є вибір субстрату для культивування продуцента. Як правило обирають дешеву та доступну речовину. Зараз доведено можливість синтезу біосурфактантів на різних технологічних відходах і речовинах, що забруднюють навколишнє середовище (гліцерин, n-алкани, моно- та поліароматичні сполуки). З допомогою мікроорганізмів можна перетворювати їх в потрібні сполуки [2,3,4,5,6].

У попередні дослідах було визначено ростовий субстрат та якісний склад середовища для культивування Nocardia vaccinii K-8. Тому подальша робота має бути спрямована на оптимізацію поживного середовища з метою підвищення кількості синтезованих ПАР. Для цього ми використовуватимемо методи математичного моделювання. З їх допомогою можна значно швидше оптимізувати середовище і оцінити вплив того чи іншого фактора на синтез продукту не лише якісно, а й кількісно, що дозволяє робити певні висновки і обирати подальший шлях досліджень [7].

РОЗДІЛ 1. Синтез біосурфактантів бактеріями роду nocardia на різних субстратах

1.1 Бактерії роду Nocardia як продуценти біосурфактантів

Біосурфактанти - поверхнево-активні речовини, синтезовані мікроорганізмами. Біосурфактанти мають ряд переваг над хімічними аналогами, тому дослідження в цьому напрямку вважаються досить перспективними.

З літератури відомо, що перші дослідження синтезу ПАР бактеріями роду Nocardia проводились приблизно у 80-х роках ХХ ст. Тоді досліджували штам Nocardia erythropolis.

Було показано, що при культивуванні в ферментаторі N. erythropolis даний вид синтезує комплекс біосурфактантів [8].

Культивування N. erythropolis здійснювали у ферментаторі об'ємом 28 л (робочий об'єм 20 л) на мінеральних середовищах з внесенням 4% гексадекану чи гасу при температурі 25 °С, кількості обертів - 250 об/хв. Спостереження і контроль над процесом культивування здійснювалося за допомогою відбору проб кожні чотири години під час всього експерименту. Аналізувався рівень біомаси, поверхневий натяг, міжфазний натяг та концентрація біосурфактантів в кожному зразку.

Культура упродовж росту мала блідо-молочний колір і була розділена на дві фракції. Верхня фракція містила гексадекан з клітинним матеріалом, а в нижній фракції було рідке поживне середовище.

Були отримані наступні результати: мінімальний поверхневий натяг - 33 мН/м; мінімальний міжфазний натяг - 2 мН/м; найвищий рівень - 2,5 г/л.

Подальші результати досліджень показали, що під час росту на гексадекані N.erythropolis синтезує суміш біосурфактантів.

Було з'ясовано, що поверхнева активність культуральної рідини зумовлена наявністю в ній нейтральних ліпідів. Після чотирьохступінчатої екстракції пентаном в культуральній рідині залишилось приблизно 10% ПАР. Автори охактеризували їх як полярні ліпіди [8].

Далі екстраговані сполуки були досліджені на наявність поверхневої активності. Мінімальний поверхневий натяг встановлено для жирної кислоти (33 мН/м), мінімальний міжфазний натяг - для естера.

Крім згаданої раніше бактерії (N. erythropolis) здатність продукувати ПАР була виявлена та досліджувалась у Nocardia sp. L-417 [9].

Дослідники виявили, що Nocardia sp. L-417 продукує два типи біосурфактантів з різними властивостями. Ці два типи біосурфактантів умовно назвали біосурфактант типу І (має стійку емульгувальну здатність), і біосурфактант типу ІІ (здатний зменшувати поверхневий натяг). Культуру вирощували на середовищі, яке містило (г/л): NaNO₃ - 0,1; KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄ Х 7H₂O - 0,1; CaCl₂ - 0,1, а також у середовище вносили дріжджовий екстракт - 0,2 г/л. Як джерело вуглецю використовували гексадекан (3% об'ємна частка). рН середовища - 6,0. Культивування здійснювали упродовж 96 год при температурі 30 ⁰С.

Подальші вимірювання поверхневої активності показали, що поверхневий натяг не залежить від значення рН. Слід зазначити, що серед відомих на той час ПАР така властивість була дуже рідкісною.

Також перевіряли вплив температури на біосурфактанти. Поверхнева активність вимірювались у пробах, оброблених термічно (100°С) упродовж трьох годин з інтервалом в 20 хв. Обидва типи біосурфактантів показали високу стійкість до температури.

Одним з пунктів досліджень синтезованих ПАР було вимірювання поверхневого натягу (у_s ) і критичної концентрації міцелоутворення (ККМ). Очищені біосурфактанти розичиняли в дистильованій воді у різних концентраціях. ККМ (тобто мінімальна кількість біосурфактанту, при якій він ще має поверхневі активності) біосурфактанту типу ІІ дорівнювала приблизно 20 мг/л, а поверхневий натяг в цій точці - 29 мН/м. На відміну від біосурфактанту типу ІІ, біосурфактант першого типу не виявив чітко вираженої поверхневої активності [9].

Емульгувальні властивості біосурфактантів були дослідженні при змішуванні їх з гідрофобними субстратами. Результати, наведені у табл. 1.1, показали, що біосурфактант І типу виявив емульгувальну активність до всіх досліджуваних субстратів, окрім касторової олії. Емульгувальна активність біосурфактанту ІІ типу була порівняно меншою.

З викладеного можна зробити висновок, що отримані сурфактанти мають досить корисні властивості. Це і висока стійкість до коливань значення рН, і до підвищених температур, і порівняно високі поверхнева активність та емульгувальні властивості, що дозволяє використовувати їх у багатьох галузях промисловості.

Також в літературі є дані про те, що вільні та іммобілізовані клітини штаму N. vacсinii K-8 можуть використовуватися для очищення води від нафти. Дослідження проводилися на лабораторній установці з моделюванням реальних природних умов [10].

Суть експерименту в тому, що через лабораторну установку (колонку), заповнену керамзитом, пропускали воду, забруднену нафтою (100-150 мл/л). Процес відбувався в аеробних умовах з додатковою аерацією. Попередньо в колонку помістили іммобілізовану суспензію клітин N. vacсinii K-8. В ході досліду спостерігалась адсорбція нафти на керамзиті, який поміщали в колонку. Тому керамзит попередньо насичували нафтою. Також, керуючись інформацією про те, що застосування бактеріальних культур для очистки від нафтових забруднень часто виявляється ефективним лише при додаванні мінеральних сполук, в описаному експерименті додавали в забруднену нафтою воду 0,1% диамонійфосфату. Це привело до зниження вмісту нафти на виході із колонки.

Таблиця 1.1 Емульгувальні властивості біосурфактантів, синтезованих Nocardia sp. L- 417

Субстрат для емульгування	Емульгувальні властивості, (А540)	Константа розпаду, (Kd)
	Сурфактант І типу	Сурфактант ІІ типу	Сурфактант І типу	Сурфактант ІІ типу
n-гексадекан	2,51	0,15	-1,73	-11,8
n-гексадекан/2-метилнафталін (1 :1)	2,78	0.16	-0.82	-7.76
2-метилнафталін	2,91	0.12	-0.12	-7.54
Соєва олія	2,73	0.33	-0.36	-11.60
Кукурудзяна олія	2,69	0.13	-0.39	-7.86
Неочищена нафта	2,89	0.20	-0.43	-37,7
Арахісова олія	2,61	0.12	-0.70	-6.67
Оливкова олія	2,82	0,14	-0,85	-5,28
Касторова олія	1,06	0.18	-41.00	-3.64

Але з внесенням диамонійфосфату збільшувалась мутність води. Мікробіологічний аналіз показав наявність в воді клітин досліджуваних бактерій. Таким чином при наявності диамонійфосфату відбувалося розмноження бактеріальних клітин і вивільнення їх з носія. Через це в наступних експериментах концентрацію добавки знизили до 0,01%. Це стабілізувало роботу модельної установки, і її можна було використовувати протягом семи діб.

Для N. vacсinii K-8 (дані вагового методу) при швидкості колонки 0,68 л/год вміст нафти на виході склав близько 12-16 мг/л. Вміст нафти, визначений методом ІЧ-спектрометрії, складав 0,2-0,4 мг/л. Клітини бактерій на виході з колонки були відсутні. Подальші експерименти показали, що диамонійфосфат треба вносити в концентрації 0,01%, але вносити періодично: на протязі 6-7 діб з наступною перервою на 1-2 добу.

Примітно, що за підвищення концентрації нафти (до 250 мл/л) ефективність очистки дещо знижувалась і становила приблизно 90%.

Згідно діючого законодавства в промислових стічних водах допускається вміст нафтопродуктів до 4,4 мг/л при скиданні в міську каналізацію і до 0,3 мг/л при скиданні у водоймища.

Таким чином, N. vacсinii К-8 здатний асимілювати нафту в концентраціях, близьких до її вмісту в стічних водах.

Отже, отримані у цьому експерименті результати дають змогу говорити про можливість використання досліджуваного штаму для очищення води від нафтопродуктів. А зараз чи не кожен житель планети знає про існування такої проблеми та її гостроту.

Проаналізувавши цю інформацію, можна зробити висновок, що дослідження бактерій роду Nocardia є важливими та перспективними. Адже в літературі надзвичайно мало даних про вивчення здатності мікроорганізмів цього роду продукувати біосурфактанти. І водночас, є інформація про можливість такого синтезу, що дозволяє проводити дослідницьку роботу в даному напрямі.

1.2 Споживання аліфатичних, моноциклічних та поліциклічних ароматичних сполук

Для дослідження здатності росту та синтезу ПАР на аліфатичних та моноароматичних сполуках використовувався штам Nocardia otitidiscaviarum TSH1.

N. otitidiscaviarum TSH1 виділили з термофільних умов поблизу нафтопереробних підприємств Ірану. Це був грампозитивний, нерухливий мікроорганізм з сильно розгалуженими гіфами, без ендоспор. Аналіз 16s рРНК показав 100% подібність до N. otitidiscaviarum DSM 43242^T. Цей штам розміщений у DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Німецька колекція мікроорганізмів та клітинних культур) під назвою N. otitidiscaviarum TSH1 [1].

Культивування проводили на n-алканах (гексан, додекан, гексадекан, октакозан) та моноароматичних сполуках (ксилен, толуен) при температурі 50?С у «тубах» (трубчастий посуд) на 30 мл, в яких містилось 6 мл мінерального сольового середовища з 250 мг/л різних вуглеводнів. Склад средовища (г/л):

NH₄Cl 1

Na₂HPO₄ 0,38

NaH₂PO₄·H₂O 0,38

MgCl₂·6 H₂O 0,08

CaCl₂ 0,07

KCl 0,04

FeSO₄·7 H₂O 0,001

Розчин мікроелементів 2,5 мл

До складу розчину мікроелементів входили (мг/л):

MnCl₂·4 H₂O 27

H₃BO₃ 31

CoCl₂·6 H₂O 36

CuCl₂·2 H₂O 10

NiCl₂·6 H₂O 20

Na₂MoO₄·2 H₂O 30

ZnCl₂ 50

Середовище було доведено до рН = 6,8. Агаризоване поживне середовище готувалось з додаванням 1,5% (об'ємних/масових) агару. Для запобігання зміни кольору агар та сольова частина стерилізувались окремо і змішувались перед розливом.

Ріст та утилізація субстратів спостерігалась з появою помутніння у культурах. Оптична густина вимірювалась при довжині хвилі 600 нм у кюветах на 1 см на спектрофотометрі Sinco SUV-2120 (Південна Корея).

Також досліджуваний штам протестували на здатність споживати фенол як єдине джерело енергії та вуглецю у мінеральному середовищі з фенолом в концентрації 200-1100 мг/л. Ріст культури спостерігався при 50?С у тубах на 30 мл упродовж 120 год. Поживне середовище досліджувалось на поглинання світла (л = 600 нм) щодня. Концентрація фенолу визначалась колоримертичним вимірюванням [11].

Щоб визначити чи продукує N. otitidiscaviarum TSH1 сурфактанти у мінеральне середовище був використаний метод «руйнування крапель» (“drop collapse method”). Він полягає у тому, що на пластину, вкриту жиром (олією), наносять краплі культуральної рідини досліджуваного продуцента. Якщо в ній міститься досить висока кількість ПАР, крапля розтікається по пластині («руйнується»). Якщо ж концентрація сурфактантів дуже низька або вони взагалі не синтезовані, крапля зберігатиме форму і не розтікатиметься [12].

Для проведення газової хроматографії та масспектрометрії культуральної рідини, клітини були видалені з неї центрифугуванням (5000 g, 40 хв, 4?С). Супернатант підкислили до рН = 2 додаванням 6н HCl і тричі екстрагували з етилацетатом (в співвідношеннях 1:3). Екстракт був просушений над Na₂SO₄ і концентрований під вакуумом. Реакцію дериватизації (розгалуження) провели при 60?С протягом 30 хв за допомогою триметилхлоросилану. Дослідження зразка було здійснено на приладі для газхроматорграфії-масспектрометрії “HP plus GS/5973 MSD). Дериватизований зразок розділили з допомогою програми зміни температур у колонці HP1. Колонку для газової хроматографії витримали при 80?С в початкові 2 хв, потім температуру підняли до 280?С зі швидкістю 20?С/хв і витримали її протягом 5 хв. Температура введення зразка - 250?С, швидкість руху гелію - 1 мл/хв. Параметри масспектрометрії: іонізація електронів - 70 eV, температура джерела іонів - 230?С. Масспектри досліджуваних іонів ідентифікувались за базою даних масспектрів Weily.725L.

В ході досліджень було помічено, що насичені компоненти сумішей олій, зокрема n-алкани з середньої довжиною ланцюга (С₁₀ - С₂₀) є більш біодеградабельними. Алкани з коротким ланцюгом більш токсичні для клітин, а з довгим (С₂₀ - С₄₀) важче споживаються через свою низьку розчинність у воді та доступність [2, 13]. До того ж, було помічено здатність деяких штамів, що споживають поліциклічні ароматичні, розкладати та рости на аліфатичних алканах. Штами бактерій GTI-23 [3], AP-1 [14], C2-3 [15] і PYR-1 [4] розкладають і ростуть на алканах (додекан, гексадекан) не гірше, ніж на 3- чи 4-кільцевих поліциклічних сполуках. Незначний ріст Nocardia sp., N. otitidiscaviarum TSH1 виявлено на гексані як єдиному джерелі вуглецю та енергії, і значно інтенсивніший - на алканах з довшим карбоновим ланцюгом (С₁₂ та С₁₆) (рис. 1.1).

Коли культивування проводилось на гексадекані, N. otitidiscaviarum TSH1 показала високу спорідненість для органічної фази. Дійсно, ріст відбувався повністю в органічній фазі, але каламутність не змінювалась у водній фазі. Ця властивість, разом із результатами вимірювань гідрофобності у середовищі з поліциклічними сполуками, дозволяє припустити, що N. otitidiscaviarum TSH1 має (чи може створити) гідрофобну поверхню, коли культивується за присутності гідрофобних сполук.

Рис. 1.1. Споживання аліфатичних алканів. Ріст на мінеральних середовищах з додаванням гексану (Ч), додекану (^), гексадекану (¦) і октакозану (¦). У всіх випадках зображені результати трьох паралельних дослідів.

N. otitidiscaviarum TSH1 також була вивчена на здатність рости при використанні як єдиного джерела енергії та електронів фенолу (рис. 1.2), ксилену та толуену. Феноляти є побічними продуктами, складовими стічних вод у жировій промисловості і їх видалення є очевидно актуальним.

Поліциклічні ароматичні сполуки широко розповсюджені у навколишньому середовищі як природні складові скам'янілого палива і їх піролітичні похідні. Деякі ПАС є сильними канцерогеннними чи генотоксичними речовинами, тобто здатні призвести до дуже важких захворювань або спричинити масову загибель людей. Тому необхідно очищувати навколишнє середовище від них, паралельно використовуючи їх як субстрати.

Рис. 1.2. Споживання фенолу. Залежність приросту біомаси та споживання фенолу N. Otitidiscaviarum TSH1 на мінеральному середовищі з початковою концентрацію фенолу 625 мг/л.

Біодеградація ПАС у грунтах часто обмежується повільним масообміном цих гідрофобних сполук до мікробів, що їх метаболізують. Це може привести до зниження біодоступності. Було виявлено, що рівень масопередачі ПАС у водну фазу є обмежуючим фактором у їх розкладанні [16]. Використання підвищених температур, сурфактантів та біосурфактант-продукуючих організмів - це все можливі шляхи збільшення біодоступності ПАС.

Розкладання ПАС мезофільними мікроорганізмами у аеробних умовах активно досліджувалось [17]. Мало інформації про деградацію ПАС термофільними бактеріями. Вченим Мюллером (Muller) були ізольовані мікроорганізми, здатні перетворювати нафталін, фенантрен та антрацен у термофільних умовах. Також, було показано можливість розкладу нафталіну термофільним штамом Bacillus thermoleovorans при 60?С [18]. Низька доступність, спричинена поганою розчинністю у воді, може бути подолана збільшенням цієї розчинності шляхом підвищення температури. Крім того, в такому випадку зростає коефіцієнт дифузії та транспорту кисню, компенсуючи зменшення розчинності кисню у воді [17].

Щоб краще зрозуміти специфічні особливості штаму, розробити методи підвищення біодоступності ПАС було проведено ряд експериментів.

Здатність N. otitidiscaviarum TSH1 розкладати поліциклічні ароматичні сполуки (ПАС) досліджувалась на рідких та твердих поживних середовищах з різними ПАС як єдиним джерелом енергії та електронів. Клітини для даних досліджень були вирощені на мінеральному поживне середовище, збагаченому піреном, фенантреном, антраценом чи нафталіном. Споживання ПАС спочатку визначалось візуально за зникненням кристалів цих сполук, зміною кольору, а також за збільшенням опичної густини середовища. Культури, що добре росли, були викростані для отримання інокуляту. Середовище готувалось додаванням аліквотних частин ПАС, розчинених в ацетоні, та сольової частини у «туби». Клітини вносились після випарювання розчинника. Кінцева абсолютна концентрація кожної ПАС становила 500 мг/л. Культивування відбувалось при 50?С в темряві з частотою обертання 150 об/хв. Зразки відбиралися щоденно впродовж 96 год. Ріст бактеріальних штамів на кожній з ПАС визначався вимірюванням зростання оптичної густини (при л = 600 нм). Залишкові ПАС екстарувалися енергійним струшуванням після додавання рівної кількості гексану. ПАС у гексанових фракціях відділялись обернено-фазовою високоефективною рідинною хроматографією з використанням суміші ацетонітрил-вода (в співвідношеннях 75:25, об./об.) та колонки ODS-3 (Merck, Німеччина). Швидкість подачі суміші становила 1 мл/хв [1].

Деградація ПАС також досліджувалась за допомогою «техніки spray-plate» [19]. Тверде ПС вкривалось шаром ПАС з додаванням 1% опорної суміші ПАС в ацетоні. ПАС розприскувався на кришки перевернутих чашок Петрі. Аліквотні кількості вирощених культур вносились на поверхню після випарювання ацетону. Чашки інкубувались при 50?С і перевірялось очищення зон та збільшення біомаси навколо місць внесення інокуляту.

N. otitidiscaviarum TSH1 була досліджена на здатність росту на рідких та твердих ПС з піреном, фенантреном, антраценом та нафталіном як єдиним джерелом енергії та вуглецю. Результати наведені на рис. 1.3.

Рис. 1.3. Ріст штаму TSH1 на ПАС. Ріст на мінеральних середовищах з додаванням нафталіну (^), фенантрену (¦) чи антрацену (¦) та без додавання ПАС (Ч). У всіх випадках зображені результати трьох паралельних дослідів.

Культура споживала ПАС в дуже різних межах. Через 96 год культивування, приблизно 55, 10 та 40% від початкових концентрацій фенантрену, антрацену та пірену відповідно були утилізовані. Примітно, що антрацен, що має таке ж число ароматичних кілець, як і фенантрен, набагато гірше деградується. Це може бути пов'язано з поганою розчинністю у воді. Чисті (без ПАС) зони на середовищі спостерігались у експериментах з фенантреном та піреном на 24 та 72 год культивування (рис. 1.4).

Рис. 1.4. Споживання ПАС на агаризовану середовищі. Показані зони, вільні від ПАС при рості N. Otitidiscaviarum TSH1 на пірені. Середовище освітлене променями з довжиною хвилі 254 нм.

N. otitidiscaviaum TSH1 не виявила здатності утворювати чисті зони після 5-денного культивування на антрацені. Зростання біомаси навколо місць внесення культури спостерігалось в усіх випадках.

Взагалі, деградація нафталіну за участю різних мезофільних грамнегативних бактерій досить інтенсивно вивчалась. Особливо багато даних отримано про використання в цих дослідженнях Pseudomonas spesies [5] і докладно вивчено шляхи метаболізму нафталіну у цього мікроорганізма. І разом з тим, шлях метаболізму нафталіну у широко вивчених грампозитивних нокардіоморфних бактерій майже не досліджувався. Так само мало інформації про утилізацію нафталіну термофілами.

Про вивчення утилізації нафталіну, антрацену, пірену та фенантрену штамом N. Otitidiscaviarum TSH1 написано вище. Тому перейду до методик, які використовувались саме при дослідженнях з нафталіном.

Ідентифікація нейтральних метаболітів. Високоефективна рідинна хроматографія нейтрального екстракту з культуральної рідини після росту на нафталіні виявила присутність метаболіту нафталіну, що має час утримання 25,72 хв. Спектр поглинання УФ-променів цього метаболіту дав максимальне значення при довжині хвилі (л) 320 нм та мінімальне - при 282 нм. Газова хроматографія та масспектрометрія дозволити детальніше вивчити структуру сполуки, але положення гідроксильного замісника з нафталінового кільця не прояснили. У контрольній пробі, яку проавтоклавували, метаболіту не виявили. Вихідну сполуку, тобто нафталін, піддали рідинній хроматографії протягом 36,6 хв, і його час утримання склав 5,481 хв. Визначення кислих метаболітів. Для цього провели тонкошарову хроматографію з використанням ацильованих етилових метаболітів нафталіну. Результат показав наявність кількох кислих сполук. Перша мала максимуми спектру поглинання УФ-променів при л 224, 230 та 272. Подібні характеристики має бензойна кислота. Високоефективна рідинна хроматографія кислих метаболітів виявила присутність двох основних компонентів - метаболіту ІІ та метаболіту ІІІ. За допомогою масспектрометрії метаболіти ІІ та ІІІ були ідентифіковані як 2-гідроксицинамова та бензойна кислоти відповідно. Масс спектри трьох описаних сполук зображені на рис. 1.5. Серед трьох основних метаболітів нафталіну найбільше бензойної кислоти. Інші дві сполуки містяться в менших кількостях. Також, крім основних метаболітів, N. Otitidiscaviarum TSH1 продукує деякі інші, але в дуже малих кількостях, що не дозволяє виявити їх доступними методами.

Отже, бачимо, що N. otitidiscaviarum TSH1 здатна рости на аліфатичних та ароматичних вуглеводнях. А це дозволяє використовувати її для перетворення таких речовин у певні цільові продукти (наприклад, ПАР).

Варто зазначити, що здатність розкладати ПАС з більш ніж 3 ароматичними кільцями (такі як пірен) дуже рідко зустрічається у бактерій. Разом з тим пірен, як і інші ПАС є одними з найнебезпечніших забрудників, і можливість їх утилізації з допомогою N. Otitidiscaviarum TSH1 має досить велике значення.

Размещено на http://www.allbest.ru/

33

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1.5. Масс-спектр нейтрального метаболіту І (а), та кислих метаболітів ІІ (b) та ІІІ (c), ідентифікованих як 1,2-дигідро-1,2-дигідроксинафтален, 2-гідроксициннамова кислота та бензойна кислота відповідно. Усі досліди проведені з триметилсиліл-похідними сполук.

1.3 Гліцерин як перспективний субстрат для культивування мікроорганізмів

В наш час активного розширення та розвитку промисловості з дня у день загострюється проблема із джерелами енергії. Зараз вже йде мова про вичерпання родовищ нафти в недалекому майбутньому. Тому давно почався і зараз продовжується пошук відповідної їй заміни. Одним зі способів вирішення цієї проблеми є виробництво палива з органічних сполук. Так, наприклад, виробляють біопаливо. Обсяги його продукції зростають з року в рік. Але таке виробництво має досить суттєвий недолік - у великих кількостях утворюється гліцерин, як побічний продукт технології, який потрібно утилізувати. Деякі компанії, що використовують гліцерин у великих кількостях (гіганти виробництва хімічних сполук: Dow Chemical and Procter and Gamble Chemicals) повністю припинили власне його виробництво, і перейшли на використання утвореного при виробництві біопалива. Але навіть це не дозволяє повністю утилізувати «побічний» гліцерин. Тому постає проблема пошуку інших шляхів його переробки.

Впродовж останніх десятиліть проводилось багато досліджень, які підтвердили можливість використання гліцерину як субстрату для синтезу різних хімічних сполук з допомогою мікроорганізмів [6, 20].

Наприклад, у дослідженнях з виявлення оптимального джерела вуглецю для синтезу ПАР бактеріями Pseudomonas aeruginosa гліцерин показав досить високі результати. В ході даних експериментів культуру вирощували на бензині, парафіновій олії, сироватці та гліцерині. Штам мав здатність споживати гексадекан, продукував 138 мг/л рамноліпідів, з натягом розриву краплі 38,8% після семи днів культивування. Споживання парафінової олії, що є комплекним та досить гетерогенним джерелом вуглецю, спричинило синтез рамноліпідів у кількості 260 мг/л, але змін поверхневого натягу культуральної рідини не відбувалось (він залишався на рівні 4,4%). Це могло бути спричинено підвищенням емульгувальних властивостей, які заважають кількісно визначити поверхневу активність. Використання гліцерину дало такі результати: продукування рамноліпідів у концентрації 150 мг/л, натяг розриву краплі - 28%. Зважаючи на те, що гліцерин доступний у великій кількості, такі результати є досить високими, і можуть стати ще одною підставою для застосування його в якості субстрату [6].

Мікробні сурфактанти, на рівні з біодеградабельними пластмасами, є представниками матеріалів, синтезованих мікроорганізмами з різноманітних біоресурсів. Вони привернули увагу науковців завдяки можливості їх біодеструкції, невибагливими умовами культивування продуцентів та великою розмаїтістю виконуваних функцій.

Наприклад, манозилеритритольні ліпіди є високоперспективими ПАР, тому що показують не лише чудові показники поверхневої активності, а й проявляють деякі біохімічні властивості (контроль диференціації клітин, підвищення ефективності трансфекції генів тощо).

Зараз можна знайти деяку інформацію про вирощування на гліцерині бактерій роду Nocardia [6]. Для ізоляції бактерій зі здатністю утилізувати гліцерин використовують МПА з додаванням цього спирту, гліцериновий агар, яєчне середовище з додаванням (склад у табл. 1.2) гліцерину тощо.

Таблиця 1.2

Склад яєчного середовища для виділення гліцерин-деградуючих штамів бактерій роду Nocardia

Курячі яйця цілісні 200 мл

Гліцерин 6 мл

малахітовий зелений (2% розчин) 6 мл

глутамат натрію (1% розчин) 100 мл

К₂НРО₄ (1% розчин) 100 мл

Виявлено здатність рости на гліцерині у представників таких родів, як Clostridium, Klebsiella, Enterobacter, Propionibacterium, Anaerobiospirillum, Escherichia.

Clostridium pasteurianum здатні синтезувати на гліцерині бутанол в концентраціях до 17 г/л, Klebsiella planticola - етанол у кількості до 2 г/л та форміат - до 2 г/л.

Були проведені дослідження, які показали, що Anaerobiospirillum succiniciproducens здатні перетворювати гліцерин у бурштинову кислоту. При цьому синтезована сполука отримується майже у чистому вигляді, бо синтезується лише з невеликою кількістю побічного продукту - ацетату.

Отже, можна зробити висновок, що використання гліцерину як субстрату для біотехнологічних процесів є перспективним кроком. В зв'язку з цим варто проводити дослідження росту та синтезу ПАР на даній сполуці, адже сурфатанти набувають важливого значення у науці та промисловості, і необхідно впроваджувати новітні методи та способи реалізації їх виробництва.

РОЗДІЛ 2. Матеріали і методи досліджень

2.1 Об'єкти досліджень

Об'єктом досліджень був штам Nocardia vaccinii K-8, виділений із зразків грунту і води, забруднених нафтою [10].

Штам Nocardia vaccinіi К-8, належить до роду Nocardia, який згідно з дев'ятим виданням Керівництва Бергі з ідентифікації бактерій (1997 рік) належить до 1 підгрупи (бактерії, що містять міколові кислоти) 22 групи - нокардіоформних актиноміцетів [21].

Представники роду Nocardia належить до грампозитивних еубактерій, які мають клітинну стінку. Частково кислотостійкі. Аероби. Не містять мікобактинів. Клітинна стінка містить міколові кислоти, а також велику кількість нерозгалужених насичених та ненасичених жирних кислот. У складі гліканового компоненту клітинної стінки присутні N-гліколільні залишки.

Морфологічні ознаки. Для представників роду Nocardia (у тому числі штаму Nocardia vacсinii характерні вегетативні гіфи від рудиментальних до густо розгалужених, діаметром 0,5 - 1,2 мкм, які ростуть на поверхні і проникають всередину агаризованого середовища. Гіфи часто розпадаються in situ (або при механічному впливі) на бактероїдні елементи, від паличко подібних до кокоподібних. Майже завжди утворюють повітряні гіфи, які в деяких випадках видно тільки в мікроскоп. На повітряних, і рідше, як на повітряних, так і на субстратних гіфах можуть іноді бути присутні ланцюжки (від коротких до довгих) конідій (від добре до мало розвинутих).

Колонії можуть бути з крейдовою або бархатистою поверхнею коричневого, рудувато-кориневого, рожевого, оранжевого, червоного, пурпурного, сірого або білого кольору, гладенькі або зернисті, неправильної форми, зморшкуваті або скучені. Можуть утворювати коричневий або жовтий розчинний пігмент.

У Nocardia vacсinii К-8 на 24 год росту спостерігається добре розвинутий міцелій. Також спостерігалися подовгуваті палочки та окремі коки. Морфологія культури на МПА та ГКА не відрізняеться, хоча візуально кращий ріст спостерігається на середовищу ГКА.

На 48 год росту під мікроскопом спостерігаються фрагменти міцелію, який розпався на палочки. Також присутні окремі коки. Морфологія культур під час росту на МПА та ГКА не відрізняється.

На 72 год росту на ГКА спостерігаються продовгуваті палочки і помітно збільшується кількість кокових форм. Міцелій відсутній.

При рості на середовищі з МПА спостерігаються поодинокі палочки або невеликі ланцюжки, переважають коки, але менше ніж в культурі на середовищі з ГКА. Міцелій відсутній.

Культуральні ознаки. При рості на агаризованих середовищах штам Nocardia vaccinii К-8 на 24 год утворює колонії схожої структури та зовнішнього вигляду (табл. 2.1).

При вирощуванні штаму Nocardia vaccinii К-8 у рідкому мінеральному поживному середовищі з гідрофільними субстратами (етанол, глюкоза) спостерігається досить інтенсивний ріст, утворюється здебільшого гомогенна суспензія клітин, але присутні агрегати клітин, забарвлення культуральної рідини від від мутно-білого до мутно-коричневого з рожевим відтінком в залежності від умов культивування. При культивуванні на гексадекані і парафіні візуально ріст культури спостерігається дуже незначний. Культуральна рідина майже прозора.

2.2 Культивування Nocardia vacсinii К-8

Культивування бактерій проводили на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO₃ - 0,5-1,5; KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄x7H₂O - 0,1; CaCl₂2H₂O - 0,1; рН 6,8-7,0.

Як джерело вуглецю та енергії використовували гліцерин - 0,5-1,5% (об'ємна частка). Додатковим ростовим фактором був дріжджовий автолізат - 0,15-0,25%.

Таблиця 2.1 Культуральні ознаки штаму Nocardia vaccinii К-8

Агаризоване середовище	Характер росту на середовищі	Структура колоній	Забарвлення колоній
МПА	Середній	Складчаста, зморшкувата	Кремово-біле
ГКА	Інтенсивний	Складчаста, зморшкувата	Кремово-біле

Культивування бактерій здійснювали в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (300 об/хв) при 30єС упродовж 168 год.

Як посівний матеріал використовували культуру з експоненційної фази росту (72 год культивування), вирощену на середовищі з 0,5 % гліцерину (об'ємна частка), в яке додатково вносили дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка) і FeSO₄7H₂O - 0,1% (об'ємна частка). Кількість посівного матеріалу становила 5 % від об'єму середовища.

2.3 Визначення параметрів росту і синтезу ПАР

Концентрація біомаси. Біомасу визначали за оптичною густиною культуральної рідини на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 540 нм, з наступним перерахунком отриманого показника на абсолютно суху вагу за калібрувальним графіком.

Поверхневий натяг. Вимірювання поверхневого натягу проводили на напівавтоматичному тензіометрі «Lauda TD 1C» (Німеччина).

Експрес-метод кількісного визначення поверхнево-активних речовин. Для експрес-оцінки вмісту ПАР в культуральній рідині використовували так звану “умовну концентрацію ПАР”. Її визначають, як ступінь розведення супернатанту культуральної рідини в точці різкого зростання поверхневого натягу на кривій залежності _s від логарифму показника розведення. Тобто, абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР (див. рис. 2.1) Використання такого прийому для визначення вмісту ПАР в культуральній рідині описано в роботі, в якій даний показник названо - CMD (Critical micelle delusion). Умовна концентрація ПАР, що визначається описаним методом, виражається в безрозмірних одиницях і надалі буде позначатися як ПАР.

Емульгувальні властивості. Емульгувальні властивості (індекс емульгування) досліджуваних зразків визначали за нижче описаним методом. Як субстрат для емульгування використовували соняшникову олію. До 2 мл культуральної рідини, додавали 2 мл олії та струшували упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е₂₄) проводять через 24 год, як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражали у відсотках. Також визначали індекс емульгування для культуральної рідини, розбавленої в 10 та 50 разів.

Показник рН. В ході описаних досліджень також проводилось визначення показника рН. Це робилось для того, щоб перевірити наявність чи відсутність кореляції між значенням рН та концентрацією синтезованих ПАР, чи емульгувальними властивостями культуральної рідини.

Як матеріал для визначення використовувалась нерозведена культуральна рідина. Визначення проводилось на лабораторному іонометрі «И-160ИМ» (Росія).

В ході експериментів залежності між значенням рН культуральної рідини та поверхневою активністю чи емульгувальними властивостями не виявлено.



Рис 2.1. Графік залежності поверхневого натягу (_s) досліджуваної проби, що містить ПАР від логарифму значення її розведення.

Математичне моделювання. В ході даних досліджень нами використовувались методи математичного моделювання. Їх сутть полягає у використнанні математичних залежностей (рівнянь) і знаходженні їх коефіцієнтів. Такий підхід дозволяє швидше проводити довгі послідовності експериментів і аналізувати отримані дані [7].

В нашому експерименті варіювались 3 фактори (тому його можна ще назвати повним факторним експериментом 2³)- концентрації джерела вуглецю (гліцерину), джерела азоту (NaNO₃) та дріжджового автолізату. Складена матриця планування включила всі 8 можливих комбінацій цих факторів.

Після проведення експерименту отримані дані обродлялись згідно методу Ієтса (Иетса). Даний метод полягає у обрахунку коефіцієнтів регресії у кілька стадій (кроків). Ці коефіцієнти дозволяють оцінити вплив вибраних факторів таїх варіацій. Докладніше про принцип обрахунку можна дізнатися з таблиці 2.2.

Таблиця 2.2 Схема розрахунку коефіцієнтів регресії за способом Ієтса для повного факторного експерименту 2³.

№	Матриця планування	Результатдослідів	Розрахунок коефіцієнтів регресії	Познач ефектів
	х1	х2	х3	уu	1 крок	2 крок	3 крок
1	-	-	-	y1	y1+y2	(y1+y2)+(y3+y4)	[(y1+y2)+(y3+y4)]+[(y5+y6)+(y7+y8)]	1
2	+	-	-	y2	y3+y4	(y5+y6)+(y7+y8)	[(y2-y1)+(y4-y3)]+[(y6-y5)+(y8-y7)]	x1
3	-	+	-	y3	y5+y6	(y2-y1)+(y4-y3)	[(y3+y4)-(y1+y2)]+[(y7+y8)-(y5+y6)]	x2
4	+	+	-	y4	y7+y8	(y6-y5)+(y8-y7)	[(y4-y3)-(y2-y1)]+[(y8-y7)-(y6-y5)]	x1 x2
5	-	-	+	y5	y2-y1	(y3+y4)-(y1+y2)	[(y5+y6)+(y7+y8)]-[(y1+y2)+(y3+y4)]	x3
6	+	-	+	y6	y4-y3	(y7+y8)-(y5+y6)	[(y6-y5)+(y8-y7)]-[(y2-y1)+(y4-y3)]	x1 x3
7	-	+	+	y7	y6-y5	(y4-y3)-(y2-y1)	[(y7+y8)-(y5+y6)]-[(y3+y4)-(y1+y2)]	x2 x3
8	+	+	+	y8	y8-y7	(y8-y7)-(y6-y5)	[(y8-y7)-(y6-y5)]-[(y4-y3)-(y2-y1)]	x1 x2 x3

Суть полягає у послідовному додаванні (відніманні) певних значень. Ось, наприклад, для знаходження коефіцієнта на першому кроці для першого варіанту необхідно додати значення y₁ та y₂ (подальший хід розрахунків можна прослідкувати за таблицею 2.2).

В результаті отримані значення після 3 кроку діляться на кількість дослідів (варіантів) експерименту (n=8). Так знаходяться коефіцієнти регресії b_i . Далі ноебхідно оцінити їх значимість. Одним з методів такої оцінки є графічний.

Графічний метод оцінки значимості коефіцієнтів регресії. Спочатку абсолютні значення коефіцієнтів регресії розміщують у порядку зростання. При цьому перший коефіцієнт (коефіцієнт регресії, що відповідає досліду, коли усі фактори на нижньому рівні ) не ранжують, так як він не відноситься ні до якого ефекту. Для побудови графіка на осі абсцис відкладають абсолютні величини коефіцієнтів регресії, а на осі ординат - їх порядкові номери на відстані від початку координат (встановлені значення: 0, 2, 5, 8, 12, 15, 19, 23). На графіку всі незначні коефіцієнти повинні приблизно розміститися на одній прямій, яка проходить через початок координат. Коефіцієнти, які відповідають значним ефектам, мають значно відхилятися від прямої, тобто виділятися із сукупності інших, менших ефектів, і являються статистично значущими.

РОЗДІЛ 3. Результати експериментів

3.1 Метод математичного моделювання при оптимізації поживного середовища для вирощування бактерії Nocardia vaccinii K-8

В ході науково-дослідної роботи нами здійснювалась оптимізація поживного середовища для вирощування та синтезу ПАР культурою Nocardia vaccinii K-8. Отримані у наших експериментах дані ми аналізували за допомогою методу математичного моделювання. Це дозволило значно скоротити обсяг та кількість дослідів без втрати якості отриманих даних.

Метод математичного моделювання використовується для аналізу багатофакторних експериментів (тобто тих, де контролюються одночасно кілька факторів; наприклад, концентрація вуглецю, азоту та фосфору). Спочатку складається матриця планування, в яку вносяться усі контрольовані фактори та їх значення (ті, що використовуватимуться в ході експериментів). Межі контрольованих факторів підбирають так, щоб вони починалися зі значень, які лімітують процес культивування (чи синтезу цільового продукту), і закінчувалися значеннями, які цей процес інгібують [7].

Далі проводять ряд дослідів, напрацьовуючи матеріал для обробки. Загалом у багатофакторних експериментах шукають значення певної функції. Ця функція може виражатись різними рівняннями в залежності від призначення експерименту. Опрацювання результатів дослідів дозволяє знайти коефіцієнти цих рівнянь і розв'язати їх.

Після розв'язання рівняння можна кількісно оцінити вплив комбінацій досліджуваних факторів і зробити висновки. Із закінченням першої стадії експеримент проводять знову, але межі вибирають близькі до отриманих оптимальних значень в попередньому досліді, «розсуваючи» їх. Тобто, якщо в попередньому експерименті використовувались межі від 1 до 10, а отримані оптимальні значення - 6-7, то наступний експеримент буде ставитись у межах від 5,5 до 7,5. Досліди можуть повторювати таким чином по кілька разів. Це дозволяє досягнути найкращих результатів і максимально оптимізувати поживне середовище для цільового процесу [7].

На даному етапі досліджень нашою метою була оптимізація поживного середовища для росту Nocardia vaccinii K-8 та синтезу нею ПАР. До цього вже було підібрано джерело вуглецю (гліцерин), азоту (NaNO₃), фактор росту (дріждовий екстракт). В наших експериментах варіювались їх значення. Докладніше - див. табл. 3.1.

Таблиця 3.1 Контрольовані фактори та їх значення у трифакторному експерименті

№	Досліджуваний фактор	Рівні досліджуваних факторів
		-1	0	+1
1	Гліцерин (%)	0,5	1	1,5
2	NaNO3 (г/л)	0,5	1	1,5
3	Дріжджовий е-т (г/л)	0,15	0,2	0,25

Як і зазначалось вище, межі підібрані від обмежуючих (лімітуючих) значень до сповільнюючих (інгібуючих). Нижче наведена матриця планування для даного експерименту (табл. 3.2).

Таблиця 3.2 Матриця планування для повного факторного експерименту 2³

№	Рівні факторів
	Гліцерин	NaNO3	Дріжджовий е-т
1	-1	-1	-1
2	+1	-1	-1
3	-1	+1	-1
4	+1	+1	-1
5	-1	-1	+1
6	+1	-1	+1
7	-1	+1	+1
8	+1	+1	+1

Для встановлення впливу досліджуваних факторів на синтез ПАР Nocardia vaccinii K-8 використовувся метод Ієтса (Иетса). Результати обрахунків коефіцієнтів регресії наведені в табл. 3.3.

Таблиця 3.3 Розрахунок коефіцієнтів регресії для повного факторного експерименту 2³ за методом Ієтса

№	Матриця планування	Результати дослідів	Розрахунок коефіцієнтів регресії	Позначенняефектів
	х1	х2	х3	уn	1-й крок	2-й крок	3-й крок	bі
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	-	-	-	0,5	2,53	3,24	7,3	0,9125	1
2	+	-	-	2,03	0,71	4,06	1,9	0,2375	х1
3	-	+	-	0,13	1,73	1,98	-1,22	-0,1525	х2
4	+	+	-	0,58	2,33	-0,08	-1,42	-0,1775	х1х2
5	-	-	+	0,8	1,53	-1,82	0,82	0,1025	х3
6	+	-	+	0,93	0,45	0,6	-2,06	-0,2575	х1х3
7	-	+	+	1,27	0,13	-1,08	2,42	0,3025	х2х3
8	+	+	+	1,06	-0,21	-0,34	0,74	0,0925	х1х2х3

Отримано значення коефіцієнтів регресії (стовпчик b_i в табл. 3.3). Для складання рівняння регресії необхідно оцінити їх значущість. Для цього використаємо графічний метод. Графік наведений на рис. 3.1.

З графіку видно, що найбільші відхилення знаходяться у точках 2, 3 і 4. У такому випадку рівняння регресії буде мати наступний вигляд:

y=0,9125-0,1525х₂+0,1025х₃+0,0925х₁х₂х₃.

У отриманому рівнянні біля фактору х₂ (нітрат натрію) стоїть коефіцієнт зі знаком «-», що свідчить про негативний вплив підвищення його концентрації на синтез ПАР.



Рис. 3.1. Графічний метод оцінки значущості коефіцієнтів регресії

Біля фактору х₃ (дріжджовий автолізат) стоїть знак «+», тобто збільшення його концентрації призведе до підвищення кількості синтезованих ПАР.

Після аналізу отриманого рівняння регресії можна зробити висновок, що у подальших експериментах необхідно зменшувати кількість джерела азоту (нітрату натрію) і збільшувати концентрацію дріжджового автолізату.

Висновки

1. Встановлено здатність бактерій роду Nocardia рости на аліфатичних та ароматичних вуглеводнях.

2. Розлянуто можливість використання бактерій роду Nocardia для очищення стічних вод від нафтопродуктів.

3. Доведено доцільність використання гліцерину як субстрату для культивування бактерій роду Nocardia.

4. Встановлено, що для покращення показників синтезу ПАР кількість джерела азоту (нітрату натрію) необхідно зменшити, а концентрацію дріжджового автолізату - збільшити.

Список використаної літератури

біосурфактант бактерія субстрат

1. Zeinali M., Vossoughi M., Ardestani S.K. Characterization of a moderate thermophilic Nocardia species able to grow on polycyclic aromatic hydrocarbons // Applied Microbiology. - 2007. - V. 45. - P. 622-628.

2. Singer M.E., Finnerty W.R. Microbial metabolism of straight-chain and branched alkanes // Petroleum Microbiology (Atlas, R.M., ed.), Macmillan, New York. - 1984. - P. 1-59.

3. Bogan B.W., Lahner L.M., Sullivan W.R., Paterek J.R. Degradation of straight-chain aliphatic and high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by a strain of Mycobacterium austroafricanum // J. Appl. Microbiol. - 2003. - V. 94. - P. 230-239.

4. Kelley I., Cerniglia C.E. Degradation of a mixture of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by a Mycobacterium strain PYR-1 // J. Soil Contamination. - 1995. - V. 4. - P. 77-91.

5. Zuniga M.C., Durham D.R., Welch R.A.Plasmid- and chromosome-mediated dissimilation of naphthalene and salicylate in Pseudomonas putida PMD-1 // J. Bacteriol. - 1981. - V. 147. - P. 836-843.

6. Syed S. Y., Ramon G. Anaerobic fermentation of glycerol: a path to economic viability for the biofuels industry // Current Opinion in Biotechnology. - 2007. - V. 18. - P. 213-219.

7. Мальцев П. М., Емельянова Н. А. Основы научных исследований. - К.: Вища школа. Головне изд-во, 1982. - с. 119-147.

8. Colin R. Macdonald, David G. Cooper, James E. Zajic Surface-Active Lipids from Nocardia erythropolis Grown on Hydrocarbons // Appl. Environ. Microbiol. - 1981. - V. 1. - P. 117-123.

9. Soon H. K., Ee J. L., Sang O. L., Jae D. L. and Tae H. L. Purification and characterization of biosurfactants from Nocardia sp. L-417 // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2000. - V. 31. - P. 249-253.

10. Пирог Т.П., Шевчук Т.А., Волошина И.Н., Грегирчак Н.Н. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки води от нефти // Прикладная биохимия и микробиология. - 2005. - №1. - P. 58-63.

11. Yoshihisa Y., Chozo H. Determination of urinary total phenolic compounds with the use of 4-aminoantipyrine: suggested screening test for hyperthyroidism and for catecholamine-producing tumor // Clin. Chem. - 1977. - V. 23. - P. 2151-2154.

12. Jain D.K., Collins-Thompson D.L., Lee H., Trevors J.T. A drop-collapsing test for screening biosurfactant-producing microorganisms // J. Microbiol. Meth. - 1991. - V. 13. - P. 271-279.

13. Balba M.T., Al-Dahr R., Al-Awadhi N., Chino T., Tsuji H. Bioremediation of oil-contaminated desert soil: the Kuwaiti experience // Environ. Int. - 1998. - V. 24. - P. 163-173.

14. Vila J., Lopez Z., Sabate J., Minguillan C., Solanas A.M., Grifoll M. Identification of a novel metabolite in the degradation of pyrene by Mycobacterium sp. Strain AP1: Actions of the isolate on two- and three-ring polycyclic aromatic hydrocarbons // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - V. 67. - P. 5497-5505.

15. Lee I.I.G, Han S.K., Go Y.S. and Ahn T.Y. Phylogenetic analysis of Mycobacterium sp. C2-3 degrading polycyclic aromatic hydrocarbons // J. Microbiol. - 2001. - V. 39. - P. 326-330.

16. Grimberg S.J., Stringfellow W.T., Aitken M.D. Quantifying the biodegradation of phenanthrene by Pseudomonas stutzei P16 in the presence of a nonionic surfactant // Appl Environ Microbiol. - 1996. - V. 62. - P. 2387-2392.

17. Cerniglia C.E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Biodegradation. - 1992. - V. 3. - P. 351-368.

18. Patent US 5965431, USPTO Patent Full-Text and Image Database. Aerobic Biodegradation of Aromatic Compounds Having Low Water Solubility Using Bacillus thermoleovorans strain DSM 10562 / Markl H., Antranikian G., Becker P., Markossian S. - Publ. 12.10.1999.

19. Kiohara H., Nagao K., Yana Y. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid hydrocarbons on agar plates // Appl. Environ. Microbiol. - 1982. - V. 43. - P. 454-457.