Основной целью курсового проекта является рассчитать участок ферментации бензилпенициллина. В проекте предусмотрены материальные, тепловые, энергетические, экономические расчеты, а также расчет и подбор оборудования. В ходе расчетов необходимо определить количество полупродукта, а именно культуральной жидкости бензилпенициллина, используемой для выделения бензилпенициллина натриевой соли, которая в свою очередь является сырьем для получения 6-амминопенициллиновой кислоты.

Бензилпенициллина натриевая соль представляет собой белый порошок, горького вкуса, легко растворимого в воде, в этиловом и метиловом спиртах. Легко разрушается под действием кислот и щелочей, а также при нагревании [1].

Препарат при внесении в пламя окрашивает его в фиолетовый цвет. При взаимодействии с соляной кислотой образуется осадок, растворимый в избытке кислоты. Оптическая плотность 0,18% раствора при длине волны 264 нм должна быть от 0,75 до 0,95. удельное вращение 2% раствора препарата не менее 270єС. Удельное поглощение, при длине волны 320 нм - не более 0,40 [2].

Препарат оказывает антимикробное действие на грамоположительные и некоторые грамотрицательные микробы, стафиллококи, пневмококки и другие. Препарат применяют при пневмонии, септических заболеваниях, остэомиллите и др. [1].

Раздел 1. Анализ технологического процесса получения бензилпенициллина

1.1 Технико-экономическое обоснование выбранного метода ферментации

ТП.1.1 Выращивание посевного материала в инокуляторе

Процесс выращивания посевного материала в инокуляторе состоит из следующих операций:

ТП.1.1.1 Подготовка инокулятора к загрузке.

ТП.1.1.2 Приготовление питательной среды, загрузка в инокулятор и стерилизация.

ТП.1.13 Засев питательной среды и ведение технологического процесса.

ТП.1.1.1 Подготовка инокулятора к загрузке

Инокулятор после освобождения от предыдущей загрузки тщательно промывают водой из шланга, проверяют включением исправность работы мешалки, чистоту барботера. Промывание воды с помощью вакуум-насоса передают в сборник.

Если предыдущая операция была нестерильной, то перед сливом содержимого производят проверку аппарата на герметичность при давлении воздуха 1,2 - 1,5 кгс/см², затем массу нагревают до (100±5) єС и выдерживают 30 минут. Содержимое аппарата после предварительной убивки выводят в специально отведенное место.

После освобождения промытый питьевой водой аппарат подвергают мойке (4±1) % раствором едкого натра. Щелочь нагревают острым паром до температуры (95±5) єС и выдерживают в течение 1 часа, при этом осуществляют барботаж подачей воздуха через барботер, промывают выхлоп и пробник. Затем содержимое после охлаждения сливают на станцию биологической очистки и начинают ремонт аппарата. При этом производят внутренний осмотр аппарата, проверяют крепление трубы барботера, лопастей и муфт мешалки, уплотнение вала, заменяют прокладки вентилей и посевного штуцера.

По окончании ремонта закрывают люк и проводят проверку аппарата и

воздушного фильтра на герметичность, для чего в аппарате и фильтре создают сжатым воздухом давление от 1,2 до 1,5 кгс /см². давление на фильтре должно быть больше, чем на аппарате. Резиновой грушей на фланцевые соединения, сальниковые уплотнения, прокладку люка и посевного штуцера, сварные швы наносят мыльный раствор. Появление пузырьков свидетельствует о негерметичности. После ликвидации пропусков аппарат и фильтр снова проверяют на герметичность и выдерживают под воздушным давлением 30 минут. Падение давления недопустимо.

По окончании проверки на герметичность снимают воздушное давление и приступают к стерилизации. Для этого аппарат и все прилегающие к нему коммуникации нагревают острым паром, подавая его через загрузочную, посевную линии, барботер и пробник. При достижении температуры 125єС стерилизуют посевной штуцер в течение 20-30 минут, открыв его на полоборота, после чего закрывают. При температуре (132±2) єС отмечают начало стерилизации. Стерилизуют 1 час при температуре (132±2) єС и давлении 1,9-2,2 кгс/см². По окончании стерилизации вентиля подачи пара в аппарат закрывают и при снижении давления от 0,6 до0,8 кгс/см² производят смену парового давления на воздушное. В подготовленной к загрузке инокулятор загружают питательную среду по предварительно простерилизованному коллектору.

ТП.1.1.2 Приготовление питательной среды, загрузка в инокулятор и стерилизация

Концентрат питательной среды готовят в отделении средоприготовления. Требования предъявляемые к нестерильной питательной среде: рН (6,1±0,3); содержание углеводов от 5,7 до 6,1%; температура (75±5) єС.

Питательную среду центробежным насосом передают по заранее простерилизованной загрузочной линии в инокулятор, отбирают пробу для определения рН, загружают жир. После этого аппарат со средой стерилизуют в течении 20-30 минут при температуре от 120 до 125єС и давлении 1,0 - 1,4 кгс/см²

при непрерывно работающей мешалке. По окончании стерилизации при снижении давления до 0,8-1,0 кгс/см² открываем вентиль подачи воздуха на барботер. После этого охладить среду до (25±1) єС подачей воды в рубашку аппарата. Требования предъявляемые к стерильной питательной среде: рН от 5,8 до 6,4; содержание углеводов от 3,7 до 4,3%; температура (25±1) єС.

Перед посевом отобрать пробу питательной среды.

ТП.1.1.3 Засев питательной среды и ведение технологического процесса

Для засева инокулятора используют сухие споры Penicillium Chrysoqenum, штамп 19, выращенный на пшене. Во время посева отключить мешалку. Снять давление с аппарата до 0,05 кгс/см². Поставить ширму. Вокруг посевного штуцера создать кольцевую зону пламени с помощью факела, осторожно открыть посевной штуцер, быстро и аккуратно из колбы пересыпать посевной материал в аппарат. Обжечь колпачок в зоне пламени и закрыть посевной штуцер. Установить оптимальный режим выращивания посевного материала согласно контрольному направлению микробиолога. Процесс выращивания вести при непрерывном перемешивании. Температура на режиме (25±1) єС, давление 0,4 - 0,5 кгс/см². Количество подаваемого воздуха - 2 объема воздуха на 1 объем среды в минуту. Температура подаваемого в аппарат воздуха 50 - 60 єС. Посевной материал должен быть стерильным и к моменту передачи в посевной аппарат иметь рН от 5,8 до 6,2, биомассу не ниже 30%, стадию развития III, IV. Процесс выращивания длится от 40 до 60 часов. Каждые 8 часов отбирают пробы для определения рН, стерильности, биохимических показателей.

ТП.1.2 Выращивание посевного материала в посевном аппарате

Процесс выращивания посевного материала в посевном аппарате состоит из следующих операций:

ТП.1.2.1 Подготовка посевного аппарата к загрузке. Осуществляют аналогично стадии подготовки инокулятора к загрузке.

ТП.1.2.2 Приготовление, прием и стерилизация питательной среды.

ТП 1.2.3 Засев питательной среды и выращивание посевного материала.

ТП 1.2.2 Приготовление, прием и стерилизация питательной среды

Приготовление питательной среды производят в отделении средоварки. После приготовления проверяют значение рН (6,1±0,3). Центробежным насосом среду передают на установку непрерывной стерилизации (УНС). Температура подаваемой на УНС среды (75±5) єС. Требования, предъявляемые к нестерильной питательной среде: рН от 5,8 до 6,4; содержание углеводов от 4,7 до 4,9%; температура 70-80єС.

Стерилизацию среды для посевных аппаратов осуществляют на УНС, которая состоит из нагревательной колонки и выдерживателя. Концентрат питательной среды подают в колонку, куда одновременно подается пар при давлении 4,5 - 5 кгс/см². Из колонки среда поступает в выдерживатель. Разбавление концентрата среды происходит за счет конденсата, образующегося при стерилизации. Объем среды поступающей в посевной аппарат определяют визуально через смотровое стекло. Среду в посевном аппарате охлаждают путем подачи воды в змеевики до температуры (25±1) єС, поддерживая при этом стерильным сжатым воздухом давление в аппарате от 0,4 до 0,5 кгс/см².

Перед засевом среды из аппарата отбирают пробу для определителя рН, содержания углеводов и стерильности. Стерильная среда должна иметь следующие показатели: рН от 5,8 до 6,4; содержание углеводов от 3,7 до 4,3%.

ТП.1.2.3 Засев питательной среды и выращивание посевного материала

Посевным материалом для засева питательной среды в посевном аппарате служит посевной мицелий, выращенный в инокуляторе в количестве 12 - 14% от объема среды. Засев производят по предварительно простерилизованному коллектору за счет разности давления в инокуляторе (1,3 кгс/см²) и в посевном

аппарате (0,3 кгс/см²). Окончание передачи посевного материала определяют по падению давления в инокуляторе или по времени от 5 до 10 минут после того, как посевная линия станет холодной. После посева отбирают пробу для определения рН и стерильности и устанавливают режим выращивания.

Во время выращивания держать под паровой завесой линию слива в канализацию, пробник, посевные и загрузочную линии, выхлоп.

Температурный режим выращивания (25±1) єС. Количество подаваемого воздуха - 1 объем воздуха на 1 объем среды в минуту. Давление на режим 0,4-0,5 кгс/см². перемешивание непрерывное. Каждые 8 часов отбирать пробы для контроля за развитием мицелия, отсутствием посторонней микрофлоры и изменением рН. Перед передачей в ферментатор рН естественный. Время выращивания посевного материала от 16 до 24 часов. Допускается хранение в захоложенном состоянии от 6 до 12 часов при температуре 20-22єС. Заключение о пересеве в ферментатор даст микробиолог по совокупности следующих данных:

внешний вид - хлопьевидная масса средней густоты, заполняет весь объем пробы;

уровень биомассы не ниже 35%;

стадия развития III, IV;

отсутствие посторонней микрофлоры;

рН от 5,8 до 6,2.

ТП.1.3 Биосинтез бензилпенициллина в ферментаторе

Технологический процесс биосинтеза бензилпенициллина в ферментаторе состоит из следующих операций:

ТП.1.3.1 Подготовка ферментатора к загрузке.

ТП.1.3.2 Приготовление питательной среды.

ТП.1.3.3 Стерилизация питательной среды и загрузка ее в ферментатор.

ТП.1.3.4 Засев питательной среды и ведение процесса биосинтеза бензилпенициллина.

ТП.1.3.1 Подготовка ферментатора к загрузке

Подготовка ферментатора к загрузке включает следующие операции:

1. Промывка аппарата питьевой водой;

2. Промывка аппарата моющим раствором и проверка работы барботера;

3. Профилактический ремонт и внутренний осмотр;

4. Проверка на герметичность (при давлении 1,2 - 1,5 кгс/см², выдержка 30 минут);

5. Проверка вентилей паром;

6. Стерилизация воздушного фильтра (при давлении 1,8 - 2,0 кгс/см² в течение 1-1,5 часа);

7. Стерилизация аппарата (при температуре 135-140єС в нижней зоне аппарата и давлении 2,5 - 2,7 кгс/см² в течении 15-30 минут);

8. Охлаждение аппарата водой.

По специальному графику и после нестерильных операций проводят мойку ферментатора (4±1) % раствором едкого натра при температуре 100єС в течение 1 часа при этом осуществляют барботаж подачей воздуха на барботер.

ТП.1.3.2 Приготовление питательной среды

В аппарат для приготовления питательной среды загружают воду, подогревают острым паром до (37,5±2,5) єС, через люк загружают расчетное количество муки соевой и мела химически осажденного, по материальной линии кукурузный экстракт. При работающей мешалке смесь подогревают острым паром до (100±1) єС, кипятят 50-60 минут, затем продувают сжатым воздухом в течение 80-90 минут. После охлаждения содержимого до (75±5) єС загружают по материальной линии питьевую воду, а через люк аммоний сернокислый, магний сернокислый; калий фосфорнокислый тиосульфат натрия, глюкозу кристаллическую. Загружают (40±2) % раствор натра едкого для доведения рН от 5,7 до 6,2. Через люк загружают фенилуксусную кислоту, затем среду передают через фильтр-ловушку в аппарат приема среды с помощью насоса. К концентрату среды добавляют жир и пропинол Б-400.

ТП.1.3.3 Стерилизация питательной среды и загрузка ее в ферментатор

Питательную среду из приемника центробежным насосом с температурой 70-80єС передают на УНС, состоящую из стерилизационной колонки, выдерживателя и теплообменника типа "труба в трубе". Предварительно всю УНС вместе с линией подачи среды в ферментатор проверяют на герметичность и стерилизуют при 131-135єС и давлении 1,9-2,2 кгс/см² в течение часа.

Концентрат среды в колонке нагревают до (127±1) єС, откуда среда поступает в выдерживатель, где выдерживается 8-10 минут при (127±1) єС. Затем среда поступает в теплообменник, где охлаждается до (25±1) єС после чего загружается в ферментатор. При приеме среды поддерживать в ферментаторе давление 0,5-0,6 кгс/см² периодически включая мешалку, устанавливают оптимальный расход воздуха.

После загрузки концентрата через УНС загружают промывные воды, которые стерилизуют при 132-135 єС. Объем загруженной среды контролируют визуально через смотровые стекла. По окончании загрузки УНС продувают паром (30±5) минут. В случае необходимости среду дополнительно охлаждают в ферментаторе до (24,5±0,5) єС. После загрузки среды отбирают пробу для определения стерильности и биохимического анализа.

Ферментационная среда должна иметь следующие показатели:

рН 5,8-6,2;

содержание углеводов 1,3-1,7%;

содержание фосфора минерального 110-130 мг %;

содержание азота аммонийного110-130 мг %;

температура перед посевом 24,5±0,5єС.

ТП.1.3.4 Засев питательной среды и ведение процесса биосинтеза бензилпенициллина

Посевным материалом для засева питательной среды в ферментатор служит мицелий, выращенный в посевном аппарате. Засев производят по предварительно

простерилизованному посевному коллектору за счет разницы давления в аппаратах. После засева устанавливают оптимальный режим ферментации:

температура выращивания 24±1єС;

избыточное давление в аппарате 0,3-0,5 кгс/см²;

непрерывная работа мешалки с частотой вращения 3с^-1;

режим операции: до (13±1) и роста - 1 объем воздуха на 1 объем среды в минуту, затем по мере накопления биомассы 1,5 объема воздуха на 1 объем среды в минуту;

температура подаваемого воздуха 50-60єС.

разу после засева подключить дозацию жира (подсолнечного масла) до конца ферментации. Предварительно простерилизовать коллектор в течение 30-40 минут при давлении 1,9-2,2 кгс/см².

Начиная с (14±2) и роста подключить дозацию 32% раствора глюкозы по возрастающей программе.

Дозирование вести под контролем вязкости, объемной биомассы и рН. При вязкости 7-10 с и биомассе 32-35% скорость подачи раствора постепенно уменьшить.

Начиная с 20 часов роста при достижении объемной биомассы 20-25% подключить дозацию предшественника - 8% раствора натриевой соли фенилуксусной кислоты. Одновременно до начала дозирования при необходимости вывести рН культуральной жидкости до значения 6,5 раствором аммиака. Скорость подачи предшественника зависит от характера развития продуцента, накопления биомассы и концентрации его в культуральной жидкости, которая должна быть в пределах от 0,08 до 0,12%.

Регулирование содержания аммонийного азота осуществляют подачей (12±1) % раствора серного аммония. В период от 45 до 60 часов роста при снижении содержания аммонийного азота до 40 мг % подключить дозацию раствора серного аммония. Содержание аммонийного азота поддерживать на уровне 20-40 мг %.

В процессе биосинтеза необходимо поддерживать оптимальный уровень рН 6,5-6,7. При значении рН ниже 6,5 подключить дозацию 25% раствора аммиака. При рН 6,8 и выше увеличить скорость подачи глюкозы и подсолнечного масла, если рН не снижается, то при рН выше 7,0 разовыми подачами подать (10±1) % раствор фитофосфорной кислоты.

Систематическое дозирование питательных веществ приводит к

увеличению объема культуральной жидкости в аппарате. В связи с этим начиная (75±5) ч роста при достижении активности 12000 Ед/мл и выше из ферментатора производить отливы культуральной жидкости. За операцию произвести 5-6 отливов.

Для предупреждения и в случае избыточного накопления биомассы, повышения вязкости культуральной жидкости и ингибирования биосинтеза недостатком кислорода произвести долив стерильной водой, или раствором иносульфата натрия (0,1% к объему питательной среды).

В случае слабого развития гиф, увеличения лизированных участков, снижения биомассы ниже 30%, слабом потреблении азота произвести долив кукурузным экстрактом (0,6% к объему культуральной жидкости).

Каждые 8 часов проводят отбор проб. Определяют рН, стерильность, уровень биомассы, вязкость, активность бензилпенициллина, содержание углеводов, аммонийного азота, предшественника, стадию развития. Для оперативного контроля пробы отбирают каждые 4 часа.

Процесс биосинтеза продолжается (190±10) часов. По распоряжению микробиолога прекратить дозацию и слить культуральную жидкость на фильтрацию. Культуральная жидкость перед сливом должна иметь следующие показатели:

рН от 6,5 до 6,8;

активность не ниже 11000Ед/мл;

содержание пенициллоподобных веществ не более 900 Ед/мл [1].

1.3 Характеристика применяемого сырья и вспомогательных материалов

1.5 Процессуальная схема производства