Производство лечебно-профилактических сывороток и иммуноглобулинов

Ориентировочная РА ставится перед постановкой развернутой РА дня того, чтобы получить предварительное представление об антигенной структуре бактерий, отобрать положительно реагирующие с сывороткой колонии и исключить из дальнейших исследований неагглютинирующиеся.

Развернутая РА для идентификации бактерий. Ставят ее следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй -- в третью и т. д. В полученные двукратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1--2 капли антигена (двухмиллиардной взвеси бактерий). Контролями служат изотонический раствор натрия хлорида с антигеном и исследуемая сыворотка без него. Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 °С, затем осуществляют предварительный учет, начиная с контролей. Отсутствие агглютинации в контроле и наличие взвешенных хлопьев в двух, трех и более пробирках опыта свидетельствуют о положительной реакции. Окончательные результаты учитывают через 18--20 ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре. Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» -- сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеивающихся бактерий на дне пробирки; «+++», «++» и «+» -- убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка. Заостряя внимание на агглютинате и его характере, следует указать, что жгутиковые бактерии агглютинируются в виде рыхлых легковзбиваемых хлопьев спустя 2 часа, а безжгутиковые бактерии и риккетсии склеиваются через 18--20 ч с образованием мелкозернистых трудноразбиваемых при встряхивании осадков.

Развернутая РА для идентификации инфекционных заболеваний. Эта реакция позволяет обнаружить в сыворотке больных для антитела к определенным видам патогенных микроорганизмов. Наличие их в крови -- хотя и косвенный, но очень важный показатель природы заболевания, так как образуются они только под воздействием соответствующего возбудителя. Способ подтверждения диагноза по титру антител получил название «серодиагностика». Развернутая РА дня серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее, как и диагностическую сыворотку, разводят в изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50--1:100 до 1:800 или 1:1600, так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом. В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы -- заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий, с которыми безопасно работать. РА для серодиагностики ставится и учитывается так же, как развернутая РА для определения вида бактерий. Диагностическое значение имеют титры 1:100--1:200 и выше, т. е. такое высокое содержание антител в сыворотке больных подтверждает клинический диагноз. Более достоверные результаты дает выявление нарастания титра антител в «парных» сыворотках, полученных от больного в начале заболевания и спустя 7--10 суток, когда титр агглютининов под воздействием патогенного микроба повышается в 1,3--2 раза и более.

В лабораторной диагностике определенное значение придается выявлению в сыворотке О-,-Н-, Vi-агглютининов, которые вырабатываются в разное время болезни, например при брюшном тифе и паратифах О-агглютинины накапливаются в ее разгаре, Н -- в конце, a Vi -- у выздоровевшего. Для их обнаружения готовят О-, Н-, Vi- диагностикумы, прогревая взвеси бактерий при температуре 100 °С в течение 1,5--2 ч (О), обрабатывая их формалином (Н) или спиртом (Vi).

Реакция непрямой гемаглютинации (РНГА). Реакция ставятся: 1) для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий и других высокодисперсных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютанинами в обычных РА увидеть не удается, или 2) для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчайшим микроорганизмам. Используя РИГА для обнаружения антител в сыворотках серодиагностики больных, готовят эритроцитарные антигенные диагностикумы. Для этого эритроциты обрабатывают раствором танина в разведении 1:20000--1:200000 в течение 15 мин, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют 2 ч при температуре 37 °С. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2--3 раза отмывают 0,85 % раствором натрия хлорида и в количестве 0,1-- 0,25 мл 0,5 % взвеси добавляют к сыворотке, разведенной от 1:10 до 1:1280 и разлитой по 0,25--0,5 мл в луночки плексигласовых досок. В качестве контроля используют взвеси интактных и нагруженных антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции. Результаты учитывают через 2 ч после инкубации в термостате. РНГА оценивают плюсами: «++++» -- эритроциты равномерно покрывают всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями; «+++» и «++» -- осадок эритроцитов в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из нескле- ившихся эритроцитов; «+» -- в основном несклеившиеся эритроциты. При отрицательной реакции эритроциты спонтанно агглютинируют в виде маленького диска («пуговицы») на дне лунок. В серодиагностике бактериальных и риккетсиозных инфекций РНГА по чувствительности и наглядности результатов превосходит развернутую РА, а при индикации противовирусных антител и вовсе не может быть ею заменена. [4]

Реакции преципитации

Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора антигена (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита. Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100000 и даже 1:1000000, т. е. в таких малых количествах, которые не обнаруживаются химическим путем. Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические частицы белково-полисахаридной природы, экстракты из микроорганизмов, органов и тканей, продукты распада бактериальных клеток, их лизаты, фильтраты патологического материала. Так как преципитиногены обладают термоустойчивосгью, то для их извлечения материалы подвергаются кипячению. В РП используются жидкие и прозрачные антигены. Преципитирующие сыворотки обычно получают путем гипериммунизации кроликов циклами в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Титр преципитирующей сыворотки в отличие от титра других диагностических сывороток определяется максимальным разведением антигена, который преципитируется данной сывороткой. Это объясняется тем, что преципитоген, участвующий в РП, содержит в единице объема гораздо больше частиц, чем антител в преципитирующей сыворотке такого же объема. В связи с этим преципитирующие сыворотки выпускают с титром не ниже 1:100000.

Рисунок 2 - Классификация и цели использования реакции преципитации (РП)

Реакция кольцепреципитации Асколли. В узкую пробирку диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой в количестве 0,3--0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена. Пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости. Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5--10 мин, 1--2 ч или через 20--24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена. Реакцию кольцепреципигации широко используют не только в диагностике инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы, но и в судебной медицине для определения видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен; в санитарной практике при выявлении фальсификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. С её помощью удается определить степень родства различных видов животных и растений. Недостаток реакции кольцепреципигации -- нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав антигенов, участвующих в формировании преципитата.

Двойная радиальная иммунодиффузия в агаре (метод Оухтарлони) Реакцию ставят на чашках Петри в лунках пластинок агарового геля, вследствие чего ее также называют реакцией преципитации в агаровом геле (РПГ). Антигены и сыворотки в РПГ вносятся так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном расстоянии. Диффундируя навстречу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют иммунологический комплекс, визуально обнаруживаемый в виде белой полосы (дуги). При наличии сложного по составу преципитиногена может возникать несколько линий преципитата. У серологически родственных антигенов они сливаются воедино, а у разнородных -- перекрещиваются, что позволяет определить детали их антигенной структуры. Реакция Оухтерлони в различных модификациях широко используется в диагностике вирусных и бактериальных заболеваний.

Иммуноэлектрофорез. С помощью этого метода можно провести более тонкий анализ антигенной структуры бактерий, белков, тканей, произвести идентификацию отдельных антигенов в многокомпонентной системе.

В основе метода лежит электрофорез антигенов в геле с последующей их преципитацией иммунной сывороткой. Для постановки реакции иммуноэлектрофореза используют пластины из стекла, на которые нанесен слой агара. Вначале антиген, помещенный в центре такой пластины, разделяется в электрическом поле. Затем в канавку агара, расположенную параллельно линии, по которой разделялись антигены, добавляют иммунную сыворотку. Диффундируя навстречу друг другу, антигены и антитела в месте их встречи образуют дуги преципитации.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция связывания комплемента (РСК) -- сложная двухэтапная реакция, в которой используются пять ингредиентов, составляющих две системы: антиген, антитело и комплемент (первая система), эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащей специфические к ним антитела (вторая, или гемолитическая индикаторная система). При этом взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, что сопровождается активацией (адсорбцией) на нем комплемента, но визуально обнаружить это невозможно. Ввиду этого Дж. Борде и О. Жангу предложили на втором этапе постановки реакции в качестве индикатора фиксации комплемента на комплексе антиген--антитело использовать гемсистему, которая, сама являясь иммунным комплексом, тоже способна связывать его. В конечном итоге возможны два результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу и комлемент связывается образовавшимся комплексом, гемолиза эритроцитов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену комплемент, оставаясь свободным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз (рис. 3).

Рисунок 3 - Реакция связывания комплемента 1 - положительная, 2,3 - отрицательная. Ат - антитело, Аг - антиген, К - комплимент, Эр - эритроциты барана.

Как и другие серологические реакции, РСК может быть использована для выявления специфических антител по известному антигену или для определения антигена по известным антителам.

Реакция нейтрализации

Репродуцируясь в культурах клеток, вирусы вызывают разного рода цитопатическое действие (ЦПД), выражающееся в округлении, сморщивании, уменьшении или, наоборот, увеличении размеров клеток, слиянии их и образовании симпластов, деструкции цитоплазмы и ядра. Наконец, в монослое клеток, зараженных вирусами, в результате разрушения ими отдельных участков клеточного пласта могут появляться «стерильные пятна», или бляшки, представляющие собой клон вирусной частицы, что дает возможность не только изолировать вирус, но и определить его титр. Для этого из флакона с монослойной культурой клеток удаляют питательную среду и заражают ее вирусом. После адсорбций вируса на клетках через 30--60 мин культуру клеток быстро покрывают 3 % расплавленным агаром, содержащим лошадиную сыворотку, солевые добавки и индикатор нейтральный красный. В монослое, где происходит нормальный рост клеток, среда подкисляется и индикатор окрашивает его в розовый цвет. Пораженные вирусом клетки прекращают метаболизм, pH не меняется и в этих местах четко обозначаются островки неокрашенной среды в виде беловатых бляшек различных размеров и конфигураций. Идентифицировать вирус по характеру бляшек очень трудно, и поэтому прибегают к постановке реакции нейтрализации (PH) выделенного вируса заведомо известными вируснейтрализующими сыворотками. С этой целью полученный от больного вирус накапливают в культуре клеток и различные его разведения вмешивают с неразведанной противовирусной сывороткой или, наоборот, Достоянную дозу вируса добавляют к различным разведениям иммунной выворотки. Смеси инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 1--2 ч или при температуре 4 °С в течение 18 ч. После этого смесями вируса и сыворотки заражают культуру клеток и о нейтрализующей силе ее антител судят по отсутствию ЦПД на клетки.

Смесью вирусов и сывороток можно заражать куриные эмбрионы или чувствительных животных. В таких случаях нейтрализующую активность антител чаще всего определяют по нейтрализации вирусных гемагглютининов в жидкостях эмбриона и устранению летального действия вируса на эмбрионы и животных. Одновременно вычисляют индекс нейтрализации, выражающий максимальное количество смертельных доз вируса, которое нейтрализуется данной сывороткой, по сравнению с результатами контрольного опыта, принимаемыми за единицу.

Подобным образом с помощью PH идентифицируются вирусы, выделенные из материала больных при заражении им куриных эмбрионов и животных. В таких случаях к вируснейтрализукмцим сывороткам прибавляют вируссодержащие жидкости эмбрионов и взвеси пораженных органов животных. После определенного времени инкубации смесями инфицируют культуры клеток, куриные эмбрионы и животных.

В серодиагностике вирусных инфекций PH определяют динамику нарастания тигра вируснейтрализующих антител по известному вирусу. При этом ставим реакцию с парными сыворотками, взятыми от больных в начале и в конце болезни. Диагностическим явится 4-кратное возрастание титра иммуноглобулинов во второй из них. [11]

Основные принципы производства иммунодиагностикумов

Агглютинирующие сыворотки готовятся путем гипериммунизации животных корпускулярным антигеном. В качестве продуцентов для их получения используют различных животных. Большинство исследователей получали агглютинирующие сыворотки на кроликах. Сравнительное изучение качества получаемых агглютинирующих сывороток при использовании различных животных показало, что кролики являются наиболее реактивными. Кроме того, они дают наиболее специфичные сыворотки. При необходимости получения агглютинирующих сывороток в больших количествах используют крупных животных, как-то: коз, баранов, ослов, лошадей. Также ряд исследователей с успехом готовили агглютинирующую брюшнотифозную и дизентерийную сыворотки на ослах. Б. Г. Вайнберг (1939) получил хорошую продукцию брюшнотифозных агглютининов при иммунизации сусликов. М. И. Федорович (1949) готовила агглютинирующие сыворотки против кишечнотифозной группы бактерий, помимо кроликов, на лошадях, козах, баранах. Н. А. Хоменко и Т. С. Фейгин (1965) указывают, что хотя сыворотки от крупных животных менее специфичны, они могут быть выпущены после соответствующей обработки в виде строго специфичных адсорбированных препаратов.

Для производства сывороток используют половозрелых животных со сформировавшейся нервной системой. Рекомендуется применять для иммунизации кроликов с 8-месячного возраста. При изучении продукции брюшнотифозных антител пришли к выводу что наибольшие титры сывороток дают кролики весом 2--2,5 кг. Рекомендуется применять для приготовления анаэробных агглютинирующих сывороток животных весом около 3 кг. Примерно такого же веса кроликов использовал Н. М. Ландсман (1970). Помимо этого он применял 1,5--2-летних баранов весом 30--40 кг. Что касается требований к лошадям, то они аналогичны тем, которые предъявляют к этому виду животных, предназначенных для производств гипериммунных сывороток.

Особое внимание исследователей обращается на состояние упитанности животных. Было показано, что от лошадей с хорошей упитанностью титры агглютинирующей дизентерийной сыворотки были в 5 раз выше, чем при плохой упитанности. Диалогичные данные наблюдались и при использовании других видов животных.

При получении агглютинирующих сывороток некоторые авторы придают значение наличию у животных нормальных антител. Так, В С. Киктейко (1940) показал, что чем выше уровень нормальных агглютинирующих антител в сыворотке крови кроликов, тем более высокие титры получают иммунных агглютининов.

В качестве антигена при получении последних применяют живые или убитые различными способами культуры. Большое значение при производстве агглютинирующих сывороток имеет антигенный аппарат бактерий, используемых для иммунизации животных. В настоящее время твердо установлено, что более полноценный антигенный аппарат отмечается у бактерий в S-форме. Диссоциация подчас приводит к потере видовой специфичности. Бактерии имеют сложную антигенную структуру. Известно наличие у многих бактерий групповых, видовых и типовых антигенов. Так, у сальмонелл различают основные антигены: соматический О-антиген и жгутиковый Н-антиген. Соматический О-антиген расположен на поверхности бактериальной клетки, соответствует полному антигену Буавена. Имеются жгутиковые Н-антигены. Одни Н-антигены обладают специфическими свойствами, характерными для вида, так называемые Н-антигены 1-й фазы, другие -- Н-антигены 2-й фазы -- неспецифические, обнаруживаются у различных видов сальмонелл. Кроме этих основных антигенных комплексов некоторые сальмонеллы содержат Vi-антиген и поверхностные антигены комплекса К-антигенов.

Знание антигенного аппарата сальмонелл позволило Кауфману и Уайту (1953) создать схему их классификации. На основе общности О-антигенных кохмплексов группа разбита на подгруппы. На основе же наличия специфических и неспецифических Н-антигенов в отдельных подгруппах определены типы.

При выборе метода изготовления антигена следует учитывать, что антигенные комплексы обладают неодинаковой чувствительностью к воздействию температуры и химических веществ. Vi-антиген сальмонеллезных бактерий не выдерживает нагревания при температуре 60° в течение 30 минут; полное его разрушение наступает при кипячении. Жгутиковые Н-антигены полностью разрушаются при 2,5-часовом кипячении бактерий или обработке спиртом. Соматический О-антиген термостабилен, не разрушается при кипячении и автоклавировании, выдерживает обработку спиртом, ацетоном, формалином, эфиром, хлороформом, мертиолятом. Поверхностные антигены относительно устойчивы к обработке формалином. Воздействие формалина в количестве 0,1--0,3% или в виде паров обеспечивает сохранение О-, К- и Н-антигенов. Vi-антиген лабилен и разрушается от незначительных химических или физических воздействий. Гипериммунизация вакцинами или живыми микробными телами, содержащими различные антигенные комплексы, способствует образованию соответствующих им антител.

Используемые при производстве агглютинирующих сывороток штаммы должны быть типичными по морфологическим культуральным и биохимическим свойствам, находиться в S-форме. Они должны агглютинироваться гомологичными сыворотками.

В качестве антигена применяют живые и убитые микробные тела. Для производства культура засевается на твердую или жидкую питательные среды (последние используются при производстве, например, сывороток, содержащих Н-антитела). Длительность культивирования зависит от вида микроба. Способы приготовления антигена различны. В качестве примера приведем некоторые из них. Для получения Vi-сыворотки можно применить для иммунизации живую культуру, состоящую из О-агглютинабельных штаммов в V-форме. Было показано, что Vi-антиген содержится в большинстве случаев в свежевыделенных из организма брюшнотифозных больных гемокультурах. Для иммунизации животных лучше применять вновь пересеянные суточные культуры. Хотя следует отметить, что Vi-антиген, помимо свежих, обнаружен и в старых культурах. Показано, что его можно выделить из брюшнотифозных микробов путем осаждения полного антигена квасцами. Для получения Н-сыворотки используют Н-антиген в однофазном состоянии. Для этого штаммы с достаточно развитым жгутиковым аппаратом выращивают на жидкой питательной среде. 3. С, Островская (1940), S. Bornstein (1943) и др. получали Н-антиген путем обработки микробной культуры формалином или использовали живую культуру. Однако при этом сохраняется и О-антиген. Для получения чистого Н-антигена S. Bornstein (1943) рекомендует бактерийные взвеси повторно центрифугировать, так как при этом отделяются жгутики.

Попытка применить иммунологическую подготовку (грундирование) животных не дала положительного эффекта. Антиген вводится в возрастающих количествах с интервалом между инъекциями в 3--5 дней, Такие интервалы используются при изготовлении многих агглютинирующих сывороток (лептоспирозных, против бактерий рода шигелл, рода сальмонелл, коли-сывороток и т. д.). Так, примерная схема иммунизации кроликов при изготовлении агглютинирующей сыворотки против бактерий рода шигелл: 500 млн. -- 1 млрд. -- 2 млрд. микробных тел в 1 мл внутривенно, при изготовлении агглютинирующих лептоспирозных сывороток антиген в виде 9--10-дневной бульонной культуры вводят по схеме 2--3--5 мл внутривенно. Длительность интервала и доза введения антигена в значительной степени зависят от токсичности антигена.

Реже применяется схема, при которой антиген вводится несколькими циклами по 3 ежедневные инъекции за цикл промежутками между циклами в 6--7 дней. Количество циклов определяется напряженностью титра антител. Такая иммунизация используется, например, при производстве агглютинирующей дифтерийной сыворотки. Схема введения антигена при ней следующая: 1-й цикл -- 500 млн. -- 1 млрд.-- 2 млрд. микробных тел в виде формолвакцины ежедневно; 2- й цикл -- 3 млрд.-- 4 млрд. --5 млрд. микробных тел; 3-й цикл -- 6 млрд. --7 млрд. --8 млрд. На 5--12-й день после иммунизации проводится кровопускание, после которого животным дается отдых в 20--30 дней, и начинается следующий цикл.

При приготовлении агглютинирующих сывороток на мелких животных после проведения цикла их кровопускают, а затем через 48 часов полностью обескровливают. Данный прием предупреждает получение сывороток с наличием групповых агглютининов. Длительная гипериммунизация жиротных способствует этому.

Полученная из крови сыворотка консервируется 1--2% перекристаллизованной борной кислотой или мертиолятом 1:10000. Считается, что агглютинирующие сыворотки сохраняют лучше свой титр при консервировании их 40% глицерина или 0,1% хинозола. С данной целью используются и другие консерванты. Лучшим методом сохранения сыворотками иммунных свойств является их лиофилизация.

Агглютинирующие сыворотки выпускаются в нативном и адсорбированном виде. В нативном виде они применяются для ориентировочной идентификации микробов в развернутой пробирочной реакции агглютинации или в реакции агглютинации на стекле.

Для более тонкой дифференциации микробов используют адсорбированные сыворотки. Они могут содержать от одного вида антител (монорецепторные) до двух и больше (поливалентные).

Возможность их получения была показана К. Aok (1926) и Т. Haashi (1927). В СССР впервые они были приготовлены для тифо-паратифозных и дизентерийных бактерий Ф. Г. Бернгофом и П. Н. Скраник (1937), Ф. Г. Бернгофом (1944), Л. Д. Гринберг и Ю. Г. Вейсман. Последние авторы, пользуясь методом Кастелляни, извлекали из сыворотки групповые антигены и оставляли один типоспецифический.

Принцип изготовления адсорбированных сывороток заключается в насыщении их всеми неспецифическими групповыми антигенами, при этом неистощенными остаются антитела к специфическим антигенам.

Для адсорбции используется микробная масса в виде живых или убитых бактерий.

Для изготовления адсорбированных агглютинирующих сывороток удобно для адсорбции использовать лиофилизированную микробную массу, полученную из культур, выращенных реакторным методом и убитых формалином или нагреванием. Это позволяет всегда иметь в распоряжении полный набор необходимых адсорбентов с неограниченным сроком хранения.

На качество получаемых адсорбированных сывороток влияет ряд моментов. Показано, что удаление из сыворотки гетерологичных агглютининов зависит от количественных соотношений между антителами сыворотки и добавляемыми адсорбентами. Важно достигнуть в сыворотке минимальной концентрации антител, подлежащих удалению при сохранении достаточного количества гомологичных агглютининов.

После окончания адсорбции микробная масса удаляется центрифугированием или сепарированием на сепараторах АСГ-1А, готовая адсорбированная сыворотка подвергается стерилизующей фильтрации.

Повысить титры готовых адсорбированных сывороток можно путем концентрации их сернокислым аммонием, а также ультрафильтрацией. Сыворотки выпускаются в жидком и сухом виде. Для выпуска неадсорбированных агглютинирующих сывороток в лиофилизированном виде в них добавляют сахарозу, а в адсорбированные -- сахарозо-желатиновую среду. Выпускаются они в наборах, при комплектовании которых учитывается распространенность отдельных видов и типов бактерий.

Применяют агглютинирующие сыворотки для серологической идентификации и типирования микробов в реакции агглютинации на стекле и в развернутой реакции агглютинации. Срок годности жидких сывороток 1 год при температуре +4 С°, сухих -- 3 и больше лет при комнатной температуре.

В настоящее время изготавливаются также различные преципитирующие сыворотки. Так, нашли широкое применение в судебной экспертизе диагностические сыворотки к различным чужеродным белкам (человека, животных, птиц), в медицине и ветеринарии -- преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, в медицине -- диагностические преципитирующие дизентерийная для постановки реакции кольцепреципитации с целью выявления специфических полисахаридов дизентерийных микробов, стрептококковые А, В, С, Д для типирования соответствующего микроба, оспенная, полиомиелитная для постановки реакции преципитации в агаре и другие.

Принципы изготовления различных гипериммунных преципитирующих сывороток примерно одинаковы.

Широко применяется в судебно-медицинской практике преципитирующая сыворотка к чужеродным белкам. Для ее производства используют кроликов. Считается, что лучшими продуцентами являются животные-самцы. Определенное значение имеет возраст кроликов. Некоторые авторы указывают на пониженную способность молодых животных продуцировать преципитирующие сыворотки. Большое значение при производстве преципитирующей с чужеродными белками сыворотки имеет схема иммунизации.

Наиболее оптимальным сроком между первичной иммунизацией и реиммунизацией кроликов гетерогенными белками с целью получения высоких титров преципитинов, является 2 месяца и больше (до 26 месяцев). Весьма эффективна двухкратная реиммунизация с интервалом в 30--60 дней Предложенные различные схемы гипериммунизации включают многократные внутривенные инъекции антигена. При первичной иммунизации вводили внутривенно гетерогенный белок в малых дозах (0,01--0,03 мл), при отдаленной реиммунизации -- двухкратно большие дозы (0,1 мл). С целью увеличения титра антител применяется полный и неполный адъюванты Фрейнда. Лучшее образование преципитинов наблюдалось при использовании последнего.

В последние годы ведутся исследования по получению преципитирующих вирусных сывороток для постановки реакции преципитации в агаре.

Практическое применение находит гипериммунная оспенная кроличья сыворотка в реакции микропреципитации в агаре, основанная на образовании в агаровом геле зон преципитации при взаимодействии оспенного антигена со специфической сывороткой. Реакция применяется для быстрой диагностики натуральной оспы или вакцинии. Этот метод впервые был предложен К- Dumbell, М. Nizamuddin (1959).

Сыворотка для постановки реакции преципитации в агаровом геле была изготовлена К. Dumbell, М. Nizamuddin (1959). Несколько позднее С. С. Маренникова и Н. Н. Мальцева (1961) разработали схему и предложили в производство гипериммунизацию кроликов вирусвакциной, включающую вначале накожную аппликацию вируса и последующие внутривенные инъекции антигена (2--4) в уменьшающихся дозах с интервалом между введениями 5 дней. Кровопускание проводили через 7 дней после последней инъекции антигена.

Большие исследования по совершенствованию схем гипериммунизации кроликов с целью получения высокоактивных преципитирующих оспенных сывороток проведены в Томском институте вакцин и сывороток. Испытание различных вариантов схем и методов введения, выполненные на значительном числе кроликов, показало, что наиболее оптимальной является нанесение антигена на скарифицированную кожу кролика в объеме 0,2--0,3 мл с последующей внутривенной иммунизацией в дозе 1, 6 мл за 2 инъекции с интервалом между инъекциями в 12 дней и кровопусканием на 8-й день после окончания иммунизации. Эта схема позволяет получать сыворотки с титром преципитинов в 1-м цикле 1:8±1,7, во 2-м -- 1:17,3±1,8, в 3ем -- 1:14,5±1,1. Интенсивное образование преципитинов отмечено и при однократном внутривенном введении вируса. Хороший эффект дает использование в качестве антигена штаммов Листеровского (Московский институт вирусных препаратов), Белорусского (Минский институт эпидемиологии и микробиологии), достаточными антигенными свойствами обладают штаммы Ташкентский и белый клон Московского института вирусных препаратов. Очистка и концентрация полученных сывороток методом Диаферм-3 и замораживанием позволяет получать их с более высокими специфическими свойствами.

С целью получения нейтрализующих антител используется метод многократного введения антигена.

Так, специфическая вируснейтрализующая гипериммунная сыворотка против полиомиелита была приготовлена путем многократной иммунизации обезьян, кроликов, ослов, коз, лошадей вирусом полиомиелита, выращенным в культуре ткани. Наиболее высокие титры сывороток наблюдались при гипериммунизации обезьян и кроликов. Рекомендуется использовать антигены, содержащие живые и убитые вирусы, а также аттенуированные вакцинные штаммы Сэбина. При изучении эффективности различных способов введения антигенов и схем гипериммунизации кроликов пришли к выводу, что наиболее экономичной является схема, включающая внутримышечную грундиммуиизацию с использованием адъюванта и в дальнейшем внутривенные инъекции вируса.

При получении иммунных сывороток к арбовирусам рекомендуются схемы, разработанные G. Casals (1947, 1949), D. Clarke, G. Casals (1958). Белым мышам 5--6-недельного возраста вводят внутрибрюшинно по 0,2 мл свежеприготовленной 10%-ной суспензии инфицированного мозга мышей-сосунков четырехкратно с интервалом в 7 дней. Кровь берут через 7 дней после последней инъекции антигена. Если агент патогенный, первые 2 инъекции делают инактивированным вирусом.

Рекомендуется для получения нейтрализующих сывороток к вирусам клещевого и японского энцефалитов осуществлять семикратные внутрибрюшинные инъекции 10%-ной суспензии мозга инфицированных -белых мышей кроликам с интервалом в 7--8 дней, а кровопускания проводить на 10-й день после окончания иммунизации.

Для постановки реакции нейтрализации с целью лабораторной диагностики аденовирусных заболеваний используется типоспецифическая гипериммунная кроличья сыворотка. Были получены сыворотки с титрами нейтрализующих антител от 1:64 до 1:256 при гипериммунизации кроликов вирусом, выращенным на культуре клеток HeLa и FL, или КВ при внутривенных шестикратных инъекциях с интервалами в 3 дня различных доз вируса с титром 103--105 ТЦД/мл, а также при комбинированной (внутривенно и внутрибрюшинно) гипериммунизации.

Для приготовления иммунных сывороток к вирусу бешенства лучше использовать хомяков (самцов в возрасте 6--8 недель) или морских свинок. Животных иммунизируют инактивированной мозговой тканью внутрибрюшинно четырехкратно с 7-дневными интервалами. Антиген применяется в смеси с Arlacel и 8,5 частей минерального масла. На 10--14-й день вводят внутрибрюшинно 1,0 мл 10%-ной вируссодержащей суспензии и на 10--14-й день берут кровь.

Таким образом, для получения специфических вируснейтрализующих сывороток используются различные схемы и способы введения антигенов. Принципиально важным в изготовлении указанных сывороточных диагностических препаратов является обязательный прогрев полученных сывороток с целью инактивации неспецифических термолабильных ингибиторов. Температура прогрева зависит от вида используемых сывороток. Сыворотки обезьян, морских свинок и лошадей инактивируют при 56°, кроликов и белых крыс -- при 60°, петухов -- при 57°, а сыворотки к вирусам СА и лихорадки Денге из-за термолабильности антител прогреву не подлежат. [12]

Характеристика моноклональных антител

Доказательством клональной основы иммунного ответа послужило создание гибридомной технологии для получения моноклональных антител. Технология основана на двух достижениях клеточной биологии:

разработке метода гибридизации соматических клеток (первоначально его использовали преимущественно в генетике);

получении линий миеломных клеток.

В 1976 г. Г. Келер (G. Koehler) и Ц. Мильштейн (C. Milstein) применили соматическую гибридизацию для слияния миеломных и нормальных антителообразующих клеток, что привело к созданию качественно новой клеточной технологии гибридом (рис. 4), революционизировавшей как иммунологию, так и биотехнологию.

Рисунок 4 - схема получения гибридом и моноклональных антител

Несколько ранее Ц. Мильштейн впервые использовал миеломные белки как источник гомогенных иммуноглобулинов, необходимых для изучения структуры V-доменов антител. Иногда удавалось определить специфичность этих моноклональных иммуноглобулинов, но большой проблемой была невозможность получения моноклональных антител заданной специфичности. В данном чисто исследовательском контексте и решалась задача получения гибридом -- клеток, совмещающих два свойства: способность к неограниченному росту, которую они наследуют от миеломных (опухолевых) клеток, и задаваемую иммунизацией специфичность, которую они получают от антителообразующих клеток, присутствующих в селезенке иммунизированных мышей.

Первоначально для слияния клетки обрабатывали вирусом Сендай. Позже с этой целью стали применять полиэтиленгликоль, вызывающий слияние клеточных мембран, благодаря наличию в его составе, наряду с гидрофильными, гидрофобных групп. Для создания гибридом, продуциру ющих чистые моноклональные антитела, были получены мутанты миеломы, не секретирующие иммуноглобулины. Практически все линии миелом, используемые в настоящее время для гибридизации, происходят от культивируемого варианта Р3 миеломы MOPC-2, развившейся у мышей линии BALB/c и продуцирующей IgG к-типа. При получении гибридом чаще других применяют сублинии P3 X63-Ag8.653, NS-Ag4/1 и Sp2/0-Ag14 (последняя сама по себе гибридома -- продукт слияния клеток линии P3 X63-Ag8.653 и нормальных спленоцитов мышей линии BALB/c).

Клетки этих линий, утратившие способность секретировать собственные иммуноглобулины, были отобраны на селективных средах на устойчивость к 8-азагуанину и 6-тиогуанину (что отражено в их обозначениях). У этих клеток блокирован запасной путь синтеза нуклеотидов из гипоксантина и гуанина, используемых в качестве предшественников нуклеотидов. Эти особенности используют для отбора гибридных клеток после слияния. При соблюдении всех деталей технологии доля слившихся клеток с нужными характеристиками (возникших при слиянии клетки миеломы и антителообразующей клетки) невелика, поэтому необходимо создавать особые условия для их селекции. Нормальные партнеры для слияния способны выживать in vitro в течение нескольких дней и затем погибают. Для подавления роста опухолевых партнеров используют селективную среду НАТ, содержащую гипоксантин (Н -- Hypoxantine), аминоптерин (А -- Aminopterine) и тимидин (T -- Thymidine). Аминоптерин -- яд, подавляющий основной путь биосинтеза нуклеотидов, гипоксантин и тимидин -- субстраты для реализации запасных путей, заблокированных у миеломных клеток (о чем свидетельствует устойчивость к 8-азагуанину и 6-тиогуанину), но реализуемых у гибридных клеток, которые наследуют соответствующий ген от нормальной родительской клетки. В результате культивирования на среде НАТ выживают только гибриды нормальных и опухолевых клеток, унаследовавшие от клеток миеломы «бессмертие», а от нормальных клеток -- способность синтезировать нуклеотиды из гипоксантина и тимидина. Неслившиеся опухолевые клетки или гибриды типа «миеломахмиелома» погибают, поскольку в среде HAT нет субстрата для синтеза ими нуклеотидов или этот процесс заблокирован. Неслившиеся нормальные клетки или их гибриды друг с другом погибают, поскольку не способны длительное время выживать in vitro. Выжившие клетки переводят сначала на среду НТ, а затем на обычную ростовую среду RPMI 1640. Затем возникает необходимость в отборе клеток-продуцентов антител нужной специфичности. Это необходимо сделать как можно раньше, чтобы нужный клон не был подавлен другими клетками. Антитела к растворимым антигенам выявляют в иммуноферментной тест-системе, а к мембранным -- методом проточной цитометрии. При выявлении продуцентов антител нужной специфичности их клонируют -- проводят несколько пассажей клеток, постепенно увеличивая их разведение вплоть до одной клетки на лунку. Для каждого пассажа берут клетки из лунок с наибольшим титром антител. Получив несколько клонов, поддерживают те из них, которые обладают преимуществами перед другими по специфичности антител, продуктивности, скорости роста и изотипу (предпочтитение отдают IgG-антителам). Моноклональность подтверждают методом изоэлектрофокусирования, доказательством гомогенности по изотипу и т.д. Обычно на этапах отбора и повторного клонирования теряется много клонов. Отобранные и стабилизированные путем повторных клонирований гибридомы хранят в замороженном состоянии в жидком азоте. Для наработки моноклональных антител клетки гибридомы культивируют in vitro или in vivo в брюшной полости сингенных мышей линии BALB/c или их гибридов с другими линиями.

Несмотря на значительные целенаправленные усилия, не удалось разработать адекватные методы получения гибридом на основе клеток человека, хотя потребность в человеческих моноклональных антителах, которые можно было бы использовать при иммунотерапии, очень велика. В настоящее время эту проблему решают с помощью генно-инженерных подходов. Самый распространенный среди них -- «гуманизация» мышиных антител. Метод состоит в создании генетических комплексов, объединяющих V-гены мышиных антител и С-гены иммуноглобулинов человека. Следующим шагом послужила замена не только С-генов, но и каркасных последовательностей V-генов мыши соответствующими последовательностями генов человека. В этом случае от мышиных антител остаются только гипервариабельные участки, определяющие специфичность антител, но не их антигенность.

В настоящее время получение моноклональных антител стало одним из наиболее доходных направлений биотехнологического бизнеса. Получено огромное число моноклональных антител, с помощью которых решены многие принципиальные проблемы иммунологии и других разделов биологии. Моноклональные антитела широко используют в иммунодиагностике. Проточная цитометрия была усовершенствована и нашла чрезвычайно широкое распространение в значительной степени благодаря применению моноклональных антител. Их используют также для фракционирования клеток, чрезвычайно востребованного в экспериментальных исследованиях, а в последние годы ставшего очень актуальным в связи с быстрым развитием цитотерапии. Наконец, моноклональные антитела используют в иммунотерапии как самостоятельные факторы и основу для создания иммунотоксинов.

Гибридомы получают также путем слияния клеток иной природы, чем антителопродуценты, например Т-лимфоцитов. Однако этот прием используют исключительно в экспериментальной иммунологии. [13]

Заключение

Эпидемическая обстановка в мире никогда не была спокойной. Все время наблюдались вспышки инфекционных заболеваний и появлялись новые виды заразных болезней, а в последние 10 лет поисходит возвращение «старых» инфекций. Генетическая изменчивость циркулирующих штаммов, внутрибольничные инфекции, бактерионосительство, трудности в обеспечении и применении иммунобиологических препаратов требуют усиления работы в области иммунопрофилактики и иммунотерапии. Недостаточное внимание к этим проблемам неминуемо приводит к подъему инфекционной заболеваемости.

Профилактика и лечение, основанные на иммунологических принципах, стали решающим средством снижения детской смертности, увеличения продолжительности и улучшения качества жизни всех возрастных групп населения. Хорошо известно, что профилактика является самым эффективным и самым экономичным способом сохранения здоровья людей.

Изменились наши представления об иммунопрофилактике и иммунотерапии групп повышенного риска. Именно эти группы людей нуждаются в иммунологической помощи, так как они наиболее чувствительны к инфекционным болезням. Резко сократился список противопоказаний к вакцинации и иммунотерапии. В недалеком будущем он будет еще короче.

В реферате были рассмотрены основные принципы производства сывороток и иммуноглобулинов, описаны вопросы подготовки животных, основные принципы гипериммунизации и грундиммунизации, приведена схема выделения и очистки готового продукта. [3]

Список использованных источников

Пол У., Сильверстайн А., Купер М. Иммунология в 3-х т. Т. 1 - М.: Мир, 1988. 467 с.

http://bio-mind.ru/serum/immune-13

Медуницын Н.В., В.И. Покровский. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 512 с.

Новиков Д.К., Генералов И.И. Основы иммунологии. - Витебск, - ВГМУ, 2007 - 160 с.

В.М. Безгин, Н.Н. Быкова, В.Е. Козлов, А.А. Нежута, А.В. Сверчков Основы промышленной иммунобиотехнологии - Курск, 2011

http://bio-mind.ru/serum/immune-35

http://bio-mind.ru/serum/immune-37

http://bio-mind.ru/serum/immune-57

http://bio-mind.ru/serum/immune-67

http://imuno.net/52.php

С.А. Павлович. Основы иммунологии. - М.: Высшая школа, 1997 - 116 с.

http://bio-mind.ru/serum/immune-175

А.А. Ярлин. Иммунология. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010 - 752 с.

Размещено на www.allbest.