Зверобой. Итоги и перспективы создания лекарственных средств

Простанорм (Рrostanorm): ФСП 42-0238-0950-01.

Представляет собой комбинированный препарат на растительной основе, предназначенный для лечения хронического простатита и доброкачественной гиперплазии предстательной железы. В его состав входят трава зверобоя, трава золотарника канадского, солодки корни, корневища эхинацеи пурпурной. Применяется внутрь, 2,5 мл (разводят в 50 мл воды) 3 раза в день за 30 мин до еды или через 40 мин после еды. Курс лечения -- 4--6 недель.

Бруснивер (Species "Brusniverum"): ВФС42-2115-92; ФСП 42-0038-2426-00. Представляет собой сбор, состоящий из листьев и побегов брусники по 25%, травы зверобоя и плодов шиповника по 20%, травы череды трехраздельной 10%. Сбор предназначен для применения внутрь или наружно для орошения, спринцевания, ванночек, примочек и микроклизм. Применяется в качестве диуретического средства в комплексной терапии: заболевания в урологии, гинекологии и проктологии.

Бруснивер-Т (Species "Brusniverum-Т"): ВФС 42-2748-96; ВФС 42-2748-06. Представляет собой сбор, состоящий из листьев толокнянки 25%, травы зверобоя и плодов шиповника по 20%, травы череды трехраздельной 10%. Сбор предназначен для применения внутрь или наружно для орошения, спринцевания, ванночек, примочек и микроклизм. Применяется в комплексной терапии: заболевания в урологии, гинекологии и проктологии в качестве диуретического средства.

Арфазетин (Species "Arphasetinym"): ФС 42-0296-2139-01.

Имеет в составе побегов черники и створок плодов фасоли 20%, корней аралии маньчжурской или корневищ с корнями заманихи 15%, плодов шиповника 15%, травы хвоща полевого, травы зверобоя и цветков ромашки по 10%. Является гипогликемическим средством растительного происхождения. Предназначен для внутреннего употребления при лечении сахарного диабета 2 типа (легкой и средней тяжести, как самостоятельно, так и в сочетании с сулъфамидными ЛС и инсулином). Оказывает гипогликемическое действие, способствует снижению содержания глюкозы в крови, повышает толерантность к углеводам и усиливает гликогенобразующую функцию печени.

Полифитовое масло "Кызылмай" (Oleum polyphyticum "Kyzylmai"). Представляет собой масляное извлечение из травы зверобоя, листьев крапивы, плодов шиповника, травы чабреца, корней солодки и облепихового масла. Является противомикробным, противовоспалительным, противоязвенным, противоожоговым средством, стимулирует регенерацию тканей. Применяется внутрь и наружно при лечении кожи и слизистых оболочек.

Панта-Форте бальзам (Раnta-Forte balsamum): ФСП 42- 2906-97.

Является общетонизирующим средством растительного происхождения, состоящее из экстрактов листьев бадана, коры дуба, травы зверобоя, цветков лабазника, корневищ левзеи, плодов перца стручкового, травы тысячелистника, корневищ с корнями родиолы розовой и пантокрина. Применяется внутрь за 30 мин до еды по 1 ч. ложке 2 раза в день в первой половине суток.

Сибектан (Sibectanum): ВФС 42-2734-96.

Является таблетированным желчегонным средством растительного происхождения. Имеет в составе листья березы, траву зверобоя, силимар и танацехол. Оказывает гепатопротекторное, мембраностабилизирующее, антиоксидантное и желчегонное действие. Применяется при лечении хронического некалькулезного холецистита, гипомоторной дискинезии желчного пузыря, хронического персистирующего гепатита, цирроза печени, жировой дистрофии печени алкогольного генеза. Применяется внутрь, по 2 таблетки 4 раза в день за 20--40 мин до еды.

Сбор Гепафит (Неpaphyt): ВФС 42-2868-97.

Состоит из цветков календулы и кукурузных столбиков по 20%, травы горца птичьего, травы зверобоя, листьев подорожника большого, плодов шиповника по 13,3%, корней одуванчика 6,67 %. Является желчегонным средством, применяется внутрь в виде настоя при лечении холецистита, холангита, гепатита, дискинезии желчевыводящих путей.

Трава зверобоя служит также источником получения ряда других препаратов, среди которых "Панта-Форте", "Колхури", "Полигемостат", "Люкрам", "Доппельгерц Энерготоник", "Фитогаленика".

Следует отметить, что неправильное применение препаратов травы зверобоя может привести к побочным эффектам. Так, длительное использование препаратов травы зверобоя может, прежде всего, негативно отразиться на состоянии желудочно-кишечного тракта. Могут возникать стойкие запоры, дисбактериоз и атрофия слизистой оболочки желудка вследствие высокого содержания в траве зверобоя дубильных веществ, обладающих вяжущим и бактерицидным действием. Усиление желчеотделения может привести к закупорке желчных протоков конкрементами, а длительное применение вызывает боли и неприятные ощущения в области печени, горечь во рту. Мочегонный эффект зверобоя достигается раздражением почечной паренхимы, что нежелательно при наличии гломерулонефритов. При длительном бесконтрольном приеме могут быть нарушения электролитного баланса, повышение свертываемости крови и уровня сахара в крови. Отмечаются аллергические реакции на траву зверобоя. Считают, что многолетнее употребление настоев травы зверобоя приводит к снижению потенции у мужчин и маскулинизации у женщин. Антраценпроизводные зверобоя, обладающие выраженным фотосенсибилизирующим действием, могут существенно повышать чувствительность кожи человека к ультрафиолетовому свету. Отмечаются случаи повышения артериального давления у пациентов, регулярно применявших настой зверобоя. Могут возникнуть негативные явления со стороны психики, заключающиеся в агрессивности, бессоннице, повышенной возбудимости. Не следует применять зверобой перед оперативным вмешательством, так как отмечены случаи пролонгирования действия опиоидов и анестетиков, а также антибиотиков группы тетрациклина, которые, как и зверобой, усиливают светочувствительность. Нельзя применять препараты зверобоя совместно с антидепрессантами и противосудорожными препаратами, так как их эффекты могут суммироваться с непредсказуемым результатом. Препараты зверобоя повышают эффект МАО, увеличивая при этом риск развития гипертонических кризов. Совместное применение с флуоксетином, парсетином, сертралином, флувоксамином или циталопрамом утяжеляет гемолитические реакции и течение "серотонинового синдрома", который заключается в повышенном потоотделении, треморе, головокружении, тошноте, рвоте, головной боли, боли в эпигастрии, беспокойстве, тревоге. БАС травы зверобоя являются активаторами микросомального окисления и могут угнетать терапевтическую активность других лекарственных средств. Они удлиняют сон, вызванный средствами для общей анестезии и наркотическими анальгетиками, но укорачивают сон, вызванный барбитуратами. При совместном использовании препаратов зверобоя, этинилэстрадиола и дезогестрела возрастает риск развития кровотечений. По некоторым данным, препараты зверобоя могут снижать эффективность оральных противозачаточных средств, а также противоастматического средства "Теофиллин".

На наш взгляд, проявление побочных эффектов во многом связано с нерациональным применением препаратов зверобоя. По нашим прогнозам, уменьшение общепринятой дозировки (примерно в три раза) позволит минимизировать проявления побочных эффектов не в ущерб эффективности. Наглядным примером может служить использование таких препаратов, как "Деприм", "Негрустин" и "Гелариум Гиперикум". Содержание основной субстанции -- сухого экстракта зверобоя -- в данных лекарственных формах существенно колеблется: от 60 мг (Деприм) в одной таблетке до 285 мг (Гелариум гиперикум) в 1 драже и 425 мг (Негрустин) в одной капсуле. При этом все вышеперечисленные препараты рекомендуется применять практически в одинаковом режиме дозировки, хотя содержание основной субстанции существенно отличается. Непонятно также, что представляет собой "Сухой экстракт зверобоя", стандартизированный по зарубежным требованиям. Это может быть и просто высушенный экстракт зверобоя и экстракт, смешанный с лактозой и другими вспомогательными веществами.

Глава 4. Современные проблемы стандартизации зверобоя травы

4.1 Исследование качественного состава травы и препаратов зверобоя

Актуальность вопроса связана с тем, что трава зверобоя имеет очень сложный химический состав, не изученный до настоящего времени в полной мере. Основными группами БАС травы зверобоя являются флавоноиды, антраценпроизводные и дубильные вещества.

Ведущей группой действующих веществ травы зверобоя являются флавоноиды, причем основными компонентами являются рутин и гиперозид. В методике анализа зверобоя травы присутствуют качественная реакции на флавоноиды, которая заключается в прибавлении к извлечению из травы раствора хлорида алюминия. Флавоноиды травы зверобоя действительно способны вступать в реакцию с раствором хлоридом алюминия и образовывать при этом растворимые комплексы желто-зеленого цвета, имеющие желто-зеленую флуоресценцию при длине волны 366 нм. Но, вместе с тем, острой необходимости в ее проведении нет. Ведь тоже самый аналитический эффект наблюдается в мерных колбах при приготовлении растворов для количественного определения. Поэтому, целесообразно оценивать наличие флавоноидов в извлечении из травы с помощью другой реакции или метода тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Методики анализа препарата "Зверобоя настойка" основаны на качественных реакциях на дубильные вещества с раствором хлорида окисного железа и на флавоноиды с раствором хлорида алюминия. При этом еще одним из методов определения подлинности является ТСХ на пластинках "Сорбфил" или "Силуфол", где в качестве растворов "свидетелей" используются растворы ГСО рутина, ГСО гиперозида и ГСО кверцетина. Как известно, ТСХ является наиболее объективным методом анализа для сырья и препаратов, однако система растворителей (этилацетат, муравьиная кислота, 2 н хлористоводородная кислота в соотношении 85:6:9), предложенная в данной ФС, состоит из агрессивных компонентов, которые возможно заменить.

Содержание в траве зверобоя кверцетина -- агликона рутина и гиперозида отмечают многие авторы. Однако, использование раствора ГСО кверцетина в методике анализа нецелесообразно, так как экстрагентом для промышленной настойки является 40% этиловый спирт, а он практически не извлекает кверцетин. Скорее всего, кверцетин является артефактом в настойке зверобоя, образуясь из рутина и гиперозида в ходе технологического процесса в результате отщепления сахаров. Как отмечают некоторые авторы, кверцетин содержится в осадке, образующемся при длительном хранении настоек зверобоя, что косвенно подтверждает предположения об артефактной природе данного соединения в обсуждаемом препарате.

Следует отметить, что наиболее эффективным современным методом исследования является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Однако применение этого метода к анализу зверобоя травы мало отражено в литературных источниках, хотя ВЭЖХ используется для определения отдельных компонентов -- рутина, гиперозида. Недостатком этих исследований, является то обстоятельство, что большинство исследователей не имеют возможности применить метод добавок конкретных веществ для идентификации пиков хроматограмм. То есть судят о содержании веществ по времени удерживания, идентифицируя полученные пики по атласам, что не всегда приводит к правильным выводам.

На основании данных литературных источников и собственных исследований были предложены подходы для проведения качественной оценки сырья и препаратов зверобоя, сочетающие в себе тонкослойную хроматографию и качественные реакции. Основным методом качественного анализа для травы и препаратов зверобоя предложено использовать метод тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol UV 254", "Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ" или "Сорбфил-ПТСХ-А-А-УФ". Системами растворителей могут служить различные сочетания растворителей. Так, ранее была предложена смесь хлороформ -- метиловый спирт -- вода в соотношении 26:14:3. Однако метиловый спирт является нежелательным компонентом данной системы растворителей, являясь высокотоксичным растворителем. Поэтому остановились на сочетании хлороформ-этиловый спирт-вода в соотношении 26:16:3. Данная система позволяет эффективно разделять анализируемые компоненты. Результаты четко оцениваются при просматривании хроматограммы в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм, а также после проявления раствором диазотированной сульфаниловой кислоты или диазобензолсульфокислоты. Данный метод позволяет оценить не только содержание флавоноидов в траве зверобоя, но и наличие антраценпроизводных и фенилпропаноидов. По данным исследований, на уровне пятна кверцетина в условиях, рекомендованных в ФС42-1889- 95, на самом деле обнаруживается сумма веществ, среди которых доминирует бисапигенин -- вещество с близким значением R_f. Предлагаемые авторами условия хроматографирования позволяют разделить пятна, соответствующие кверцетину (он присутствует только в настойке и экстрактах травы зверобоя) и бисапигенину.

Для анализа дубильных веществ, которые методом ТСХ определить невозможно, целесообразно использование качественных реакций с раствором железоаммонийных квасцов или раствора хлорида окисного железа. Аналитическим эффектом реакции служит появление черно-зеленого окрашивания. Извлечение зверобоя травы, предназначенное для проведения качественных реакций, имеет ярко-красный цвет и красную флуоресценцию в УФ-свете при длине волны 366 нм. Это является аналитическим эффектом наличия конденсированных антраценпроизводных, типичных для травы зверобоя. При прибавлении раствора гидроксида натрия к извлечению из травы зверобоя наблюдается зелено-желтое окрашивание, а последуюее прибавление раствора хлористоводородной кислоты дает восстановление первоначальной красной окраски раствора. Эта реакция также типична для антраценпроизводных травы зверобоя.

Эффективным методом качественного анализа является УФ-спектроскопия извлечений из травы зверобоя. Взаимодействие с раствором алюминия хлорида позволяет обнаружить совпадение максимумов для основных флавоноидов травы зверобоя -- рутина и гиперозида, а также раствора извлечения из травы зверобоя.

4.2 Количественный анализ зверобоя травы

4.2.1 Анализ суммы флавоноидов зверобоя травы

С целью количественного определения флавоноидов различными авторами предложены разнообразные методики анализа. Чаще всего, это дифференциальная спектрофотометрия. Этот метод позволяет определить сумму флавоноидов в сырье и препаратах зверобоя. Некоторые авторы предлагают использовать для определения флавоноидов хроматоспектрофотометрию, но этот метод применяется значительно реже вследствие трудоемкости метода, хотя в этом случае возможно определение содержания всех имеющихся флавоноидов в траве зверобоя в отдельности. Следует отметить, что разные авторы использовали этот метод в различных вариантах. Например, отдельные флавоноиды выделяли с помощью двухмерной бумажной хроматографии. Некоторые исследователи использовали тонкослойную хроматографию. Метод хроматоспектрофотометрии позволил определить, что содержание рутина

в траве зверобоя превышает содержание гиперозида. В то же время, исследователи травы зверобоя, заготовленной в горных районах, отмечают, что в ряде случаев содержание гиперозида значительно превышает содержание рутина и кверцетина. Следует отметить, что с целью определения содержания отдельных флавоноидов, возможно использовать более совершенный метод, а именно ВЭЖХ.

Дифференциальная спектрофотометрия в качестве метода стандартизации используется и в настоящее время для зверобоя травы (ГФ СССР ХI издания, ст. 52). С помощью этого метода рассчитывается сумма флавоноидов в пересчете на рутин.

Следует отметить, что выбранный в ГФ СССР ХI метод, является оптимальным для травы зверобоя, однако в тексте статьи допущен ряд ошибок, существенно искажающих суть методики. Поэтому, прежде всего, изучались вопросы количественного анализа суммы флавоноидов травы зверобоя, в результате которых был выбран в качестве метода количественного анализа дифференциальная спектрофотометрия. Так, исследовалась зависимость выхода действующих веществ от концентрации экстрагента. Следует отметить, что во всех случаях использовался идентичный образец травы зверобоя. Результаты данных исследований свидетельствуют о том, что оптимальным подходом будет однократная экстракция травы зверобоя в течение 90 мин на кипящей водяной бане, где в качестве экстрагента используется 70% этиловый спирт.

4.2.2 Анализ суммы антраценпроизводных зверобоя травы

Фитохимический анализ антраценпроизводных также описан в литературе. Для определения этой группы используются методы фотоэлектроколориметрии и спектрофотомерии. Один из методов спектрофотометрии, который наиболее часто используют исследователи, предполагает предварительную очистку травы зверобоя от сопутствующих веществ (каротиноидов и хлорофиллов) с помощью хлороформа. Затем следует экстракция ацетоном, упаривание под вакуумом и растворение полученного остатка в метаноле. Аналогичная методика используется в НД на препарат "Деприм", содержащий сухой экстракт зверобоя, качество которого оценивается по содержанию антраценпроизводных. В данном случае методикой качественного анализа служит метод тонкослойной хроматографии на пластинках Мегk (НРТLС) в системе этилацетат-ледяная уксусная кислота-муравьиная кислота-вода в соотношении (100:11:11:27) по объему. В качестве стандарта выбран рабочий стандарт экстракта зверобоя, растворенный при нагревании в метаноле. Для проявления пластинок используется 1% раствор в-этил- аминоэфир дифенилборной кислоты в метаноле или 5% раствор полиэтиленгликоля 4000 в этаноле. Количественное содержание гиперицина в препарате, растворенного в метаноле, оценивают с помощью прямой спектрофотометрии при длине волны 590 нм, в качестве раствора сравнения используют метанол. Удельный показатель поглощения для 1% раствора в кювете с толщиной 1 см при этом составляет 718. В методике анализа препарата "Деприм" для оценки степени растворения таблеток используется еще один максимум для гиперицина 335 нм, но он близок максимумам поглощения флавоноидов. Следует отметить, что данная методика предполагает использование редких и дорогостоящих химических реактивов и оснащения, не используемых широко в фармацевтическом анализе. Кроме того, совершенно очевидно, что данный метод предполагает использование высокотоксичных реактивов, что нежелательно с точки зрения безопасности. В тоже время, в нашей стране есть опыт успешной замены в ряде случаев анализа антраценпроизводных в траве зверобоя метанола на этанол.

4.3 Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве зверобоя продырявленного

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера 1 мм. Около 1 г сырья (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ± 0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем колбу закрывают той же пробкой снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через рыхлый комочек ваты и остужают в течение 30 мин (извлечение из травы). Испытуемый раствор для анализа флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (испытуемый раствор А). Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл извлечения из травы помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (раствор сравнения А).

Параллельно готовят раствор ГСО рутина. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А рутина, помещенного в мерную колбу на 25 мл, и доведенный 95 % спиртом до метки (раствор сравнения Б рутина).

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность раствора ГСО рутина; m₀ - масса ГСО рутина, в граммах;

m - масса сырья, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании, в процентах.

4.4 Методика колличественного определения суммы антраценпроизводных в траве зверобоя продырявленного

5 мл полученного извлечения из травы помещают в мерную колбу, вместимостью 50 мл и доводят 95% этиловым спиртом до метки. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 591 нм. Раствором сравнения при этом является этиловый спирт. Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

718 - удельный показатель поглощения 1% раствора гиперицина;

m - масса сырья, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании, в процентах.

4.5 Исследование суммы дубильных веществ в траве и препаратах зверобоя

Чаще всего для анализа этой группы веществ используется метод перманганатометрии (метод Левенталя), включенный ГФ СССР ХI. Причем некоторое время эта методика служила методом количественного анализа для препарата "Зверобоя настойка" с целью оценки содержания суммы дубильных веществ. Недостатком этого метода является его неизбирательность, в результате чего определятся сумма окисляемых веществ водного извлечения из травы зверобоя, в котором наряду с дубильными веществами содержатся флавоноиды, фенилпропаноиды и другие БАС, способные окисляться. Описанный в литературе комплексометрический метод титрования, основанный на осаждении дубильных веществ солями цинка, затем восстановлении их кислотой и титровании раствором трилона Б, называется многими авторами как более селективный. Данные, полученные этим методом в 2--3 раза ниже, чем в случае использовании перманганатометрии. В то же время известно, что комплексометрический метод предназначен для определения гидролизуемых дубильных веществ, хотя в траве зверобоя продырявленного присутствуют значительные количества конденсированных дубильных веществ. Компромиссным решением этого вопроса стала методика, предложенная Н.А. Дербенцовой, которая, занимаясь вопросами количественной оценки дубильных веществ методом перманганатометрии, разделяла извлечения из травы зверобоя на отдельные фракции, содержащие танины и полифенолы. По данным этого автора, при содержании в траве зверобоя 14,3 % дубильных веществ в сумме, 7,5 % приходится на долю танидов, а 6,8 % -- на долю полифенолов.

Глава 5. Исследование различных видов сырья зверобоя

5.1 Исследование различных видов сырья зверобоя продырявленного

Анализ образцов зверобоя травы, собранных по общим правилам, показал, что грубые одревесневшие части стеблей могут составлять примерно 25% от всей массы сырья.

При этом общее содержание стеблей в данном образце сырья превышает 60 %, хотя данное сырье было собрано с учетом всех правил и рекомендаций сбора и длина стеблей зверобоя травы не превышала 30 см. Следует отметить, что Государственная фармакопея СССР ХI (ст. 52) регламентирует содержание в сырье стеблей в зверобоя траве не более 50%. Проведенное исследование содержания основных действующих веществ в различных видах сырья зверобоя продырявленного, представляющих собой листья, стебли, цветки, плоды, а также образцы цельной травы зверобоя.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольшее содержание действующих веществ обнаружено в случае цветков (6,93 %) и листьев зверобоя (5,90 %), причем если содержание флавоноидов в этих частях сырья примерно одинаково, то содержание антраценпроизводных в цветках (0,810 %) отличается от других видов сырья, например, в листьях, примерно в 3 раза (табл. 1).

Таблица 1 -- Содержание флавоноидов и антраценпроизводных в различных видах сырья зверобоя

№ п/п	Части сырья	Содержание флавоноидов в пересчете на рутин (%)	Содержание антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	Цветки	6,93 ± 0,1040	0,810 ± 0,0324
2.	Плоды	2,61 ± 0,0392	0,084 ± 0,0034
3.	Стебли	1,33 ± 0,0199	0,091 ± 0,0037
4.	Листья	5,90 ± 0,0885	0,262 ± 0,0104
5.	Трава	6,08 ± 0,0912	0,506 ± 0,0202
6.	Грубые части стеблей	0,01 ± 0,0002	0,010 ± 0,0004
7.	Корневища с корнями	0,01 ± 0,0002	0,025 ± 0,0010

5.2 Исследование травы зверобоя в зависимости от длины стебля

С целью определения оптимальной длины стеблей заготавливаемых надземных частей зверобоя, были проанализированы на содержание суммы флавоноидов и антраценироизводных образцы сырья зверобоя с различной длиной стеблей.

Для исследования содержания действующих веществ в зависимости от длины стеблей были использованы образцы воздушно-сухой травы зверобоя продырявленного, заготовленные в течение одного дня на территории Самарской области в фазу цветения в июле 2007 года.

Процент различных сырьевых частей находили по массе в процентах от общего количества. Анализ показал, что содержание основных действующих веществ -- антраценпроизводных и флавоноидов снижается при увеличении длины стеблей зверобоя травы (табл. 2).

Таблица 2 -- Содержание флавоноидов и антраценпроизводных в образцах зверобоя травы с различной длиной стеблей

№ п/п	Длина стеблей зверобоя травы (см)	Содержание стеблей в сырье (%)	Содержание листьев в сырье (%)	Содержание цветков в сырье (%)	Содержание флавоноидов в пересчете на рутин (%)	Содержание антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	5	25	15	60	5,30 ± 0,08	0,719 ± 0,028
2.	10	30	20	50	5,16 ± 0,08	0,688 ± 0,28
3.	15	40	25	35	4,77 ± 0,07	0,568 ± 0,023
4.	20	45	28	27	4,65 ± 0,07	0,540 ± 0,022
5.	30	50	30	20	4,55 ± 0,07	0,489 ± 0,020
6.	40	57	28	15	4,44 ± 0,07	0,417 ± 0,017

Таким образом, в целях получения сырья высокого качества надземные части заготавливаемой травы не должны, превышать длину 20 см. Следует отметить, что способ заготовки сырья зверобоя путем срезания всей надземной части вредит зарослям этого растения.

5.3 Исследование динамики накопления биологически активных соединений в траве зверобоя

Немаловажным является изучение вопроса накопления действующих веществ в траве зверобоя в онтогенезе растения. Динамика накопления биологически активных соединений (БАС) зверобоя травы изучалась различными авторами, но это касалось в основном витаминов и дубильных веществ.

Литературные источники свидетельствуют, что наибольшее количество различных БАС накапливает трава зверобоя, произрастающая на влажных супесчаных и суглинистых почвах.

Как отмечают литературные источники, уровень содержания флавоноидов в сырье сильно колеблется в исследуемых образцах, собранных в различные годы в разных местах обитания: он составляет от 2 до 7% и выше. В то же время, анализируя литературные данные, можно обнаружить, что климат более северных районов обитания способствует большему накоплению флавоноидов.

Накопление флавоноидов в траве зверобоя повышается и при увеличении высоты над уровнем моря.

Можно также отметить, что содержание суммы флавоноидов в траве зверобоя продырявленного выше, чем в траве зверобоя пятнистого, произрастающего в тех же условиях. Однако в различных условиях произрастания может меняться уровень отдельных компонентов. Те же авторы отмечают, что содержание БАС в траве зверобоя независимо от особенности условий его обитания достигает максимума в момент цветения травы, как правило, это конец июня -- начало июля.

Другие авторы отмечают самое высокое содержание каротиноидов и флавоноидов на период начала цветения, а содержание дубильных веществ нарастает к периоду массового цветения растения, то есть, именно к моменту сбора травы зверобоя. В литературе также имеются данные о содержании антимикробных веществ в траве зверобоя, извлекаемых ацетоном (по методике получении препарата "Новоиманин").

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что содержание антимикробных веществ непостоянно в течение всего периода вегетации растения. Так, оно нарастает к моменту начала цветения, после чего наблюдается небольшой спад, затем вновь нарастание к периоду массового цветения, после чего идет плавное снижение к моменту плодоношения.

5.4 Исследование степени измельченности сырья, используемого для анализа

Учитывая то обстоятельство, что степень измельченности является важной характеристикой растительного сырья, авторами проведено исследование извлечений из зверобоя травы, подготовленной для анализа с разной степенью измельченности .

Наибольшие количества флавоноидов и антраценпроизводных извлекаются из образцов сырья со степенью измельчения 1 мм, как и регламентировано в нормативной документации. Однако это обстоятельство, связано не только с тем, что данная степень измельчения оптимальна для высвобождения основных БАС из сырья.

Главная причина кроется в том, что образцы, прошедшие сквозь сито 1 мм представляют собой в основном порошок листьев и цветков зверобоя, в то время как более грубая степень измельчения позволяет попадать в образцы для анализа измельченным стеблям, содержащим значительно меньшие количества действующих веществ. Следовательно, в условиях производства в некоторых случаях может наблюдаться несоответствие между уровнем содержания БАС в сырье и выходом их из сырья в ходе технологического процесса.

5.5 Сравнительное исследование сырья различных видов рода зверобой (HYPERICUM L..)

Весьма актуальными представляются сравнительные исследования химического состава видов рода (Нуреricum L.). Были использованы воздушно-сухие образцы надземной части зверобоя олимпийского (Нуреricum оiутрiсит L.), зверобоя большого (Нуреricum ascyron L.), зверобоя красивого (Нуреricum аndrosaemum L.), заготовленные от растений, культивируемых в Ботаническом саду Самарского государственного университета. Надземная часть Нуреricum maculatum Grants. (Нуреricum quadrangulum L .) была заготовлена в Кировской области от дикорастущих растений. Сырье Нуреricum perforatum L, Нуреricum hirsutum L. и Нуреricum elegans Steph. было заготовлено от дикорастущих видов на территории Самарской области. Сбор образцов сырья для всех видов осуществляли в период начала цветения растений в течение июня-июля 2007--2008 гг.

Исследование сырья, заготовленного от других видов зверобоя, показало, что все образцы содержат различные количества флавоноидов и антраценпроизводных (табл. 3).

Отмечено, что все проанализированные образцы значительно уступают по содержанию основных БАС траве зверобоя продырявленного.

Анализ извлечений, проведенный методом ТСХ, также показывает отличия химического состава травы зверобоя от других видов.

Таблица 3 -- Содержание флавоноидов и антраценпроизводных в траве некоторых видов рода Нуреricum

№ п/п	Название вида зверобоя	Содержание флавоноидов в пересчете на рутин (%)	Содержание антраценпроизводных в пересчете на гиперицин (%)
1.	Нуреricum оiутрiсит L.	4,26 ± 0,06	0,200 ± 0,008
2.	Нуреricum ascyron L.	4,77 ± 0,07	0,059 ± 0,002
3.	Нуреricum аndrosaemum L.	4,27 ± 0,06	0,038 ± 0,002
4.	Нуреricum maculatum Grants. (Нуреricum quadrangulum L.)	3,16 ± 0,05	0,059 ± 0,002
5.	Нуреricum hirsutum L.	3,09 ± 0,05	0,070 ± 0,003
6.	Нуреricum elegans Steph	2,89 ± 0,04	0,262 ± 0,01

Глава 6. Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств на основе травы зверобоя

6.1 Оптимизация способа получения препарата "Зверобоя настойка"

В настоящее время экстрагентом для получения препарата "Зверобоя настойка" является 40% этиловый спирт, однако в ходе аналитических исследований было показано, что оптимальным экстрагентом для флавоноидов и антраценпроизводных травы зверобоя является 70% этиловый спирт. Поэтому в лабораторных условиях был получен ряд образцов настоек травы зверобоя, экстрагентом для которых служил как 40%, так и 70% и 90% этиловый спирт. Все образцы настоек были получены в соотношении сырье-экстрагент 1:5 методом ремацерации из идентичных образцов зверобоя травы, измельченных до размера частиц 3 мм. Кроме того, для сравнительного анализа были использованы промышленные образцы лекарственных средств: таблетки "Деприм", капсулы "Негрустин" и драже "Гелариум Гиперикум, а также препарата "Зверобоя настойка".

Для анализа препарата "Зверобоя настойка" были использованы те же методы, что и для травы зверобоя. За основу разработанной методики количественного определения суммы флавоноидов в препарате "Зверобоя настойка" взят метод, изложенный в ФС 42-1889-95 и НД 42-7991-97, который был усовершенствован авторами в ходе исследований. Методика заключается в определении суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на рутин, при длине волны 412 нм, с использованием раствора ГСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору. При этом из расчетной формулы исключен показатель плотности препарата. Сумма антраценпроизводных в пересчете на гиперицин в препаратах оценивалась с применением прямой спектрофотометрии при аналитической длине волны 591 нм. Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4 -- Содержание флавоноидов и антраценпроизводных в водно-спиртовых препаратах зверобоя

№ п/п	Экстрагент	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, (%)	Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин, (%)
1.	40% этиловый спирт	0,28 ± 0,01	0,002 ± 0,0001
2.	40% этиловый спирт	0,30 ± 0,01	0,008 ± 0,0003
3.	70% этиловый спирт	0,55 ± 0,02	0,018 ± 0,0007
4.	90% этиловый спирт	0,43 ± 0,02	0,012 ± 0,0004

Проведенные исследования свидетельствуют о возможности создания отечественных антидепрессантных лекарственных средств на основе травы зверобоя, близких по химическому составу с зарубежными препаратами. Однако для создания эффективных отечественных препаратов необходимым условием является правильная дозировка БАС травы зверобоя в лекарственной форме.

Таблица 5 -- Содержание суммы флавоноидов и антраценпроизводных в различных препаратах зверобоя импортного производства

Препарат	Содержание флавоноидов	Содержание антраценпроизводных
	препарат, %	лек. форма, мг	препарат, %	лек. форма, мг
Таблетки "Деприм"	2,97	7,71	0,131	0,340
Капсулы "Негрустин"	9,98	54,6	0,326	1,784
Драже "Гелариум Гиперикум"	8,47	46,86	0,318	1,756

В ходе дальнейших исследований был изучен в сравнительном плане компонентный состав полученных образцов препаратов с помощью ТСХ, причем с применением аналогичных подходов, как и в случае сырья зверобоя. Были проанализированы как промышленные образцы настоек, так и настойки, полученные авторами в лабораторных условиях. Результаты проведенного анализа лишний раз доказывают эффективность метода ТСХ, позволяющего обнаруживать не только флавоноиды, но и другие БАС, в частности, антраценпроизводные (гиперицин), характерные для данного растения. При этом показано, что использование ГСО кверцетина нецелесообразно, так как, в методике анализа на уровне пятна данного вещества на самом деле находится сумма веществ, среди которых преобладает 3,8¹¹-бисапигенин. Из представленной хроматограммы видно (рис. 14), что образцы настоек, полученные нами на 70 % этиловом спирте, приближаются по составу к препаратам "Деприм", "Негрустин" и "Гелариум Гиперикум".

Рис. 14 ТСХ различных препаратов зверобоя

Другим важным выводом можно считать то обстоятельство, что флавоноид кверцетин практически отсутствует в настойке зверобоя, полученной на 40 % этиловом спирте. При этом он может образовываться в процессе хранения препарата в результате отщепления сахаров от рутина и гиперозида. Этот процесс возможен в результате действия ферментов травы зверобоя, которые содержатся в траве и извлекаются 40 % спиртом. В образцах настоек, полученных на 70% этиловом спирте, условия для проявления ферментативного гидролитического расщепления флавоноидных гликозидов практически отсутствуют. Кроме того, как показали исследования, в траве зверобоя кверцетин содержится в незначительных количествах. Все это говорит о нецелесообразности использования ГСО кверцетина в методике анализа препарата "Зверобоя настойка" (ФС 42-7991-97) в качестве одного из стандартов. Кроме того, в данной фармакопейной статье используется система растворителей, состоящая из этилацетата, муравьиной кислоты и хлористоводородной кислоты в соотношении 85:6:9, хотя оптимальной являются система хлороформ -- этиловый спирт -- вода в соотношении 26:16:3. Данная система более проста в приготовлении и не содержит агрессивные реагенты. Следует также отметить, что в фармакопейной статье на настойку зверобоя предлагается проявление хроматографической пластинки осуществлять раствором алюминия хлорида, что позволяет обнаружить только флавоноиды. Целесообразнее использовать просмотр пластинок в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм, а также проявление раствором диазотированной сульфаниловой кислоты или диазобензолсульфокислоты. Данный реактив позволяет надежно оценить содержание не только флавоноидов, но и других биологически активных фенольных соединений, характерных для травы зверобоя.

Кроме того, в тексте фармакопейной статьи приведены две качественные реакции на флавоноиды с раствором хлорида алюминия и на дубильные вещества с раствором хлорида окисного железа. В случае добавления к настойке раствора хлорида окисного железа наблюдается черно-зеленое окрашивание, характерное для конденсированных дубильных веществ, содержащихся в траве зверобоя. Однако в случае реакции на флавоноиды травы зверобоя аналогичное зелено-желтое окрашивание можно наблюдать в мерных колбах при приготовлении раствора для количественного анализа. Следовательно, проводить эту реакцию отдельно, не имеет смысла, тем более что наличие флавоноидов в препарате четко обнаруживается с помощью метода ТСХ.

6.2 Методика количественного определения суммы флавоноидов и антраценпроизводных в препарате "Зверобоя настойка"

5 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора 70% спиртом до метки, содержимое колбы тщательно перемешивают (испытуемый раствор А). 1 мл испытуемого раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% раствора хлорида алюминия в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл испытуемого раствора А, доведенной до метки 95% этиловым спиртом в мерной колбе, вместимостью 25 мл (раствор сравнения Б).

Параллельно готовят раствор ГСО рутина. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А рутина, помещенных в мерную колбу на 25 мл и доведенный 95 % спиртом до метки (раствор сравнения Б рутина).

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в процентах (Х) вычисляют по формуле:



где D -- оптическая плотность испытуемого раствора

D₀ -- оптическая плотность раствора ГСО рутина

m₀ -- масса ГСО рутина

Для определения суммы антраценпроизводных в препарате "Зверобоя настойка" 1 мл препарата помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора этиловым спиртом 95 % до метки и перемешивают. В качестве раствора сравнения используют 95 % этиловый спирт.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 591 нм. Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где D -- оптическая плотность испытуемого раствора

718-- удельный показатель поглощения 1% раствора гиперицина.

6.3 Исследование по разработке препарата "Зверобоя экстракт жидкий"

Одной из главных задач наших исследований является изучение возможности создания антидепрессантных препаратов зверобоя, аналогичным по действию импортным лекарственным средствам ("Деприм", "Негрустин" и "Гелариум Гиперикум"). Поэтому в дальнейшем исследовался вопрос получения жидкого экстракта травы зверобоя. Для этого в лабораторных условиях был получен различными технологическими способами ряд извлечений на 70 % этиловом спирте в соотношении сырье -- экстрагент 1:1. Все образцы жидких экстрактов были исследованы на содержание действующих веществ. Содержание флавоноидов и антраценпроизводных в данных извлечениях значительно больше, чем в настойках, полученных ранее. При этом, следует отметить, что во всех образцах жидких экстрактов соотношение суммы флавоноидов и антраценпроизводных примерно 30:1, как и в других препаратах, полученных на основе 70% этилового спирта.

Далее исследовались технологические параметры получения сухого экстракта травы зверобоя. Для этого высушивали жидкий экстракт травы зверобоя при различной температуре под вакуумом до получения сухого порошка, влажность которого не превышала 5%. Полученные экстракты исследовали на содержание действующих веществ. Установлено, что жидкий экстракт целесообразно сушить при температуре не выше 50 ⁰С, как и многие другие экстракты из лекарственного растительного сырья.

6.4 Исследования по разработке препарата "Зверобоя экстракт сухой"

Таблеточную массу получали смешиванием сухого экстракта травы зверобоя и различными вспомогательными веществами в соотношении 1:1. В качестве вспомогательных веществ нами были использованы лактоза, сорбит и микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ). В каждом случае полученную смесь растирали в фарфоровой ступке пестиком и использовали в дальнейшем для получения таблеток прямым прессованием. Часть каждой полученной субстанции была смешана с кальция стеаратом из расчета 1% на таблеточную массу. Этим, как известно, достигается увеличение сыпучести прессуемого порошка. Другая часть каждой субстанции для той же цели прошла влажное гранулирование с применением 70% этилового спирта. Во всех полученных таблеточных массах определяли содержание основных БАС -- флавоноидов и антраценпроизводных, в том числе по компонентному составу. Проведенный ТСХ-анализ показал высокое качество полученного сухого экстракта . Кривые поглощения УФ-спектров растворов сухих экстрактов зверобоя, полученные с добавлением различных вспомогательных веществ не выявило каких-либо различий . Все это говорит о том, что все используемые вспомогательные вещества достаточно инертны в отношении сухого экстракта зверобоя. Исследования показывают, что технология получения водно-спиртовых препаратов травы зверобоя сильно влияет на содержание основных действующих веществ. Наиболее предпочтительными методами для получения как препарата "Зверобоя настойка", так и жидкого экстракта травы зверобоя являются методы перколяция и модифицированная мацерация (ремацерация). Жидкий экстракт травы зверобоя может служить основой для получения сухого экстракта травы зверобоя, который в свою очередь может быть использован для получения таблетированных импортозамещающих анпридепрессантных лекарственных средств. В качестве вспомогательных веществ для таблетированных препаратов могут быть использованы следующие компоненты: лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, сорбит, стеарат кальция.

6.5 Анализ препарата "Зверобоя экстракт жидкий"

2 мл жидкого экстракта помещают в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки 70% этиловым спиртом (испытуемый раствор А). 1 мл испытуемого раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% раствора хлорида алюминия в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл испытуемого раствора А, доведенной до метки 95% этиловым спиртом в мерной колбе, вместимостью 25 мл (раствор сравнения Б).

Параллельно готовят раствор ГСО рутина. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А рутина, помещенного в мерную колбу на 25 мл и доведенный 95 % спиртом до метки (раствор сравнения Б рутина).

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где D -- оптическая плотность испытуемого раствора

D₀ -- оптическая плотность раствора ГСО рутина

m₀ -- масса ГСО рутина, в граммах. Для определения суммы антраценпроизводных в жидком экстракте травы зверобоя в качестве испытуемого раствора используют раствор сравнения А, полученный в методике количественного определения флавоноидов. В качестве раствора сравнения используют 70% этиловый спирт. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 591 нм. Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где D -- оптическая плотность испытуемого раствора

718-- удельный показатель поглощения 1% раствора гиперицина

6.6 Анализ препарата "Зверобоя экстракт сухой"

Навеску препарата массой около 0,1 г (точная навеска) помещают в мерную колбу, вместимостью 25 мл, заливают 15 мл 70% этилового спирта и растворяют при нагревании на водяной бане (раствор А). После полного растворения раствор охлаждают и доводят 70% спиртом до метки. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой. 1 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу на 25 мл прибавляют 1 мл 3% раствора алюминия хлорида (испытуемый раствор Б). Параллельно готовят раствор сравнения: для этого 1 мл раствора А помещают в мерную колбу на 25 мл доводят этиловым спиртом до метки (раствор сравнения Б).

Параллельно готовят раствор ГСО рутина. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А рутина, помещенных в мерную колбу на 25 мл и доведенный 95 % спиртом до метки (раствор сравнения Б рутина).

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где D -- оптическая плотность испытуемого раствора; D₀ -- оптическая плотность раствора ГСО рутина; m₀ -- масса ГСО рутина, в граммах;

m -- навеска препарата, в граммах; W -- влажность, в процентах. Для анализа антраценпроизводных в качестве испытуемого раствора использовали раствор сравнения А, полученный в методике количественного определения флавоноидов. Раствором сравнения служил 70% этиловый спирт. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 591 нм. Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где D -- оптическая плотность испытуемого раствора;

718-- удельный показатель поглощения 1% раствора гиперицина;

m -- навеска препарата, в граммах

W -- влажность, в процентах.