Вакцинация и иммунопрофилактика инфекционных болезней

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали беспородных белых мышей линии СВА массой 20-25 грамм.

Фосфотидилхолин (ФХ) был получен в соответствии с методикой (Singleton et al., 1965).

Холестерин (Хол), сапонин из Quillaja saponaria (QuillA) использовали производства Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, U.S.A.).

Моногалактозилдиацилглицерол (МГДГ), дигалактозилдиглицерол (ДГДГ), сульфохиновазиндиглицерол (СХДГ) выделяли из морских водорослей Laminaria japonica, Ulva finistrata в соответствии с методикой, описанной (Sanina et al., 2003).

Кукумариозид А2-2 (КД) - тритерпеновый гликозид из Cucmaria japonica, обладающий свойствами сапонина, был предоставлен сотрудниками лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ (Заведующий лаборатории Стоник В.А.).

Иммуностимулирующий препарат «Кукумариазид» был разработан на основе комплексов, состоящих из кукумариозида А-2 (рис.4) из Cucumaria japonica и холестерина. Исследование иммуномодулирующей активности серии кукумариозидов из голотурии Cucumaria japonica показало, что в сверхнизких дозах моносульфатированные кукумариозиды оказывают влияние как на клеточное, так на гуморальное звенья иммунитета. Тритерпеновые гликозиды голотурий способны значительно стимулировать лизосомальную активность перитонеальных мышиных макрофагов. При этом сумма кукумариозидов этой голотурии не обладает мутагенной активностью и разрешена к практическому применению в ветеринарии. Но их применение в составе вакцин до настоящего времени не изучено.

Рис. 4 Кукумариозид А2-2

Данные гликолипиды обладают различной биологической активностью, что привлекает внимание диетологов, фармацевтов, биотехнологов к этой филогенетически разнообразной группе растений. Возможно, биологическая активность морских макрофитов связана с высоким содержанием гликоглицеролипидов, но их медико-биологические свойства до сих пор плохо изучены, хотя известно, что моногалактозилдиацилглицерол зеленых водорослей проявляет противоопухолевую активность. Сульфохиновозилдиацилглицерол из морских водорослей ингибирует ДНК-полимеразу и ВИЧ-обратную транскриптазу. Биологическую активность морских гликоглицеролипидов связывают как со структурой углеводной составляющей, так и с присутствием большого количества полинасыщенных жирных кислот.

Липид-сапониновые комплексы получали следующим образом: растворы холестерина и МГДГ в хлороформе при весовом соотношении холестерина и МГДГ 2:6 упаривали под вакуумом до удаления хлороформа и добавляли 3 весовые части 0,4 % водного раствора QuillA (или КД). Полученную липидную пленку суспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (pH 7,2), доводя суммарную концентрацию липидов (холестерина и МГДГ) до 2 мг, после чего липидную суспензию озвучивали ультрозвуковым дезинтегратором «УЗДН 2Т» (Россия) в течении 5 минут. Полученные данной процедурой препараты представляют собой водную суспензию липид-сапониновых комплексов, стабильную при температуре (-4є С) более трех месяцев.

Образующиеся липид-сапониновые комплексы оценивали электронно-микроскопически при увеличении X50000 как описано раннее (Ли и соавт.,2004). В зависимости от электронно-микроскопической картины образующиеся структуры разделяли на тубуляро-искомальные (ТИ) комплексы, тубулярно-липосомальные (ТЛ) комплексы, классические ИСКОМы и ИСКОМы, модифицированные заменой фосфолипида на МГДГ (ИСКОМ-МГДГ).

В качестве объектов сравнения при изучении иммуноадъювантных свойств ТИ-комплекса использовали липидные носители, способные переносить антиген и обеспечивать адъювантный эффект: ПАФ, классические ИСКОМы (на основе сапонина QuilA, холестерина и фосфатидилхолина в соотношении QuilA : Холл : ФХ = 3:2:6), ИСКОМы, модифицированные заменой ФХ на МГДГ в эквивалентных количествах (ИСКОМ-МГДГ), а также ИСКОМы, модифицированные заменой только QuillA на КД в соотношении КД : Хол : ФХ = 3:2:6 (морфологически охарактеризованные как тубулярно-липосомальные (ТЛ) комплексы).

В качестве модельного антигена использовали термически обработанную, гидрофобную, мономерную форму порообразующего белка наружной мембраны возбудителя псевдотуберкулеза Yersinia pseudotuberculosis с молекулярной массой около 36 кД.

Образцы сыворотки были анализированы на содержание антител методом ELSA (иммуноферментный метод). Анализ проводился на полистироловых микропланшетках. Лунки покрывались пориновым белком как антигены в концентрации 10 мг/л. Антиген разводили в буферном растворе натрия бикарбоната pH 9,6 и 100 мкл раствора добавляли в лунки планшета, инкубировали 2 часа при 37°С.

Планшет отмывали в фосфатно-буферном растворе pH 7,4 , содержащем 0,05% по объему Tween 20 (детергент) и высушивали. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание: 200 мкг фосфатного буфера с 0,05% Tween 20 добавляли в лунки, планшеты оставляли на ночь при 4°С. . Затем отмывались три раза и высушивались. 100 мкл аликвоте (стандартный объем) мышинных сывороток каждого опытного образца предварительно разводили от 1:200 до 1:320 буфером, перемешивали, добавляли в лунки и инкубировали 2 часа при 37°С. Контролем служила сыворотка не иммунизированных мышей. Планшеты отмывались как указывалось выше, высушивали и добавляли 100 мкл аликвоты меченного пероксидазой антимышинного Ig (M+G) разведенного 1:1000 в контактном буфере. Планшеты инкубировались 1 час при 37°С, отмывались и высушивались. 100 мкл субстрата (Тетраметилбензидин (ТМБ)) добавляли в лунки и выдерживали в темноте при комнатной температуре 20 минут. Ферментную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 Н Н2SО4. Активность специфических антител определялась фотометрией на многоканальном спектрофотометре при длине волны 492 нм. Сыворотка не иммунизированных мышей использовалась как отрицательный контроль.

Порин-содержащие ТИ-комплексы получали из КД, холестерина и МГДГ, взятых в весовом соотношении 3:2:6, с последующим добавлением поринового белка в необходимой концентрации в ФСБ (рН 7,2) в дозах, соответствующих 0,1-1-10 мкг белка на 1 мкг содержания КД, а именно: 75 мкг, 750 мкг или 7500 мкг на 1 мл полученной смеси. Полученную смесь озвучивали ультразвуковым дезинтегратором в течение 5 мин и оставляли на 3 час. Мономерный пориновый белок из Y. pseudotuberculosis самопроизвольно включается в ТИ-комплекс. Полученный препарат представляет собой водную суспензию порин-липид-сапониновых комплексов, стабильную при температуре (-4оС) более трех месяцев. Подлинность препарата определяется качественным и количественным составом исходных структурных компонентов (КД, холестерина и МГДГ). Для оценки связывания порина с ТИ-комплексом проводили ультрацентрифугирование при 540000 g в течение 45 минут. Содержание несвязанного белка определяли в надосадочной жидкости методом Лоури (Lowry et al., 1951). Количество белка, включенного в ТИ-комплекс, составляло не менее 95%.

Иммунизацию мышей порином производили в/б в дозах 0,01, 0,1, 1, 10, 20, 50 мкг/мышь в объеме 0,2 мл ФСБ. Порин в тех же дозах вводили в составе ТИ-комплексов. В качестве групп контроля использовали порин в смеси с ПАФ, в составе ИСКОМ, ИСКОМ-МГДГ и ТЛ-комплексов. Мышей иммунизировали дважды: повторную иммунизацию производили через 14 дней после первой. На 6-й день после второй иммунизации мышам в подушечку одной из лапок вводили разрешающую дозу порина в половинной дозе от иммунизирующей в объеме 0,02 мл ФСБ. В контрлатеральную лапку вводили такой же объем ФСБ. Забой животных производили на 7-й день после второй иммунизации, оценивая ИВ ГЗТ в %.

Содержание специфических антипориновых антител определяли в сыворотке крови мышей методом иммуноферментного анализа в модификации (Portnyagina et al., 1999). Измерение оптической плотности производили на планшетном спектрофотометре «марка» при длине волны 492 нм. Содержание антипориновых антител выражали в единицах оптической плотности (ОП) при длине волны 492 нм.

Статистическую обработку результатов проводили методом параметрического анализа с использованием критерия t-Стьюдента и медом доверительных интервалов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Представлены результаты по модификации ИСКОМной матрицы методом замены ее структурных компонентов: фосфолипида и сапонина QuillA на структуры морского происхождения - гликолипид МГДГ и сапонин тритерпеновый гликозид кукумариозид А2-2 (КД). Показано, что в результате образуются структуры двух типов: искомоподобные структуры с характерной для них морфологией и размерами, и тубулярные структуры диаметром около 40 нм. Эти структуры названные ТИ-комплексами, характеризуются отсутствием токсичности, характерной для ИСКОМ, способностью включать амфифильный белковый антиген и обеспечивать иммуноадъювантный эффект при экспериментальной вакцинации.

При проведении замены в структуре ИСКОМ фосфолипида на гликолипиды было применено три гликолипида, выделенные методами гель-хромотографии из морской водоросли Laminaria japonica - МГДГ, ДГДГ, СХДГ. Из этих трех гликолипидов только МГДГ оказался способным заменить фосфолипид - образовывать структуры аналогичные ИСКОМам.

Рисунок 5. Комплекс МГДГ - ИСКОМы

При иммунологической оценке таких структур мы не выявили преимуществ комплекса ИСКОМ-МГДГ в сравнении с классическими ИСКОМами, что соответствует результатам других авторов, проводивших, например, замену в матрице ИСКОМ фосфолипида на сфинголипиды. К тому же, это не решало задачи по оптимизации баланса токсичности ИСКОМ и их адъювантной эффективности. Для замены QuillA был применен ряд гликозидов, полученных из морских беспозвоночных (Cucumaria japonica, Stichopos), а также - индивидуальный гликозид женьшеня RH2.

При электронномикроскопическом исследовании получаемых суперструктур, наибольший интерес вызвала замена фосфолипида на МГДГ, полученный из морской водоросли U.finistrata,и QuillA - на гликозид КД, полученный из Cucumaria japonica.

Наряду с классическими гексогональными структурами, характерными для ИСКОМ, образуются тубулярные структуры диаметром около 40 нм и длиной 150-400нм. Данная комбинация тубулярных и искомоподобных структур была названа ТИ-комплексом. Следует отметить, что для образования таких структур требуется присутствие в комплексе одновременно МГДГ и КД. Если замена фосфолипида на гликолипид сохраняет гексогональную структуру, характерную для ИСКОМ, то замена QullA на КД приводит к образованию сети тубул и липосомоподобных везикул - эти структуры названы тубулярно-липосомальными комплексами (ТЛ-комплексы). Искомоподобных структур в последнем случае не обнаруживалось. Таким образом, для эффективной модификации ИСКОМной матрицы, при которой наряду с другими структурами сохраняется присутствие классических ИСКОМ, необходимыми оказались оба компонента - гликолипид МГДГ и сапонин КД. При детальном анализе получаемых структур выявляется интересная закономерность - тубулы оказываются заполнеными искомоподобными структурами, выполняя таким образом функцию контейнера ИСКОМ, возможно, высвобождая искомные структуры порциями в процессе своей деградации и способствуя таким образом пролонгации антигенного раздражения.

Таким образом, примененная техника модификации ИСКОМ приводит к образованию принципиально новой морфологии - ТИ-комплексов, потенциальные свойства которых как адъювантных носителей антигенов были приняты к дальнейшим исследованиям.

В качестве модельного антигена использовали белок порин - небольшой амфифильный мембранный антиген Yersinia pseudotuberculosis с молекулярной массой около 36 КД. При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что процесс взаимодействия порина с ТИ-комплексом не нарушает морфологическую структуру ТИ-комплекса. Связывание порина с ТИ-комплексами происходит с высокой эффективностью - до 95% от свободного белка включается в ТИ-комплекс. Таким образом, получается препарат порина, инкорпарированного в структуру матрицы ТИ-комплекса (то есть потенциально вакцинный препарат). При электронной микроскопии ТИ-комплексы с порином имеют ультромикроскопическую тубулярную структуру, представленную тубулами с диаметром поперечного сечения около 40 нм, сформированными искомоподобными структурами сходного диаметра при наличии последних внутри и между тубулами (рис.6).

Предваряя оценку адъювантной активности ТИ-комплексов, была проведена серия экспериментов с целью анализа собственной адъювантной активности структурообразующих частиц ТИ-комплекса: КД и МГДГ. Работами сотрудников ТИБОХ ДВО РАН ранее было показано, что КД не проявляет эмбриотоксических и мутагенных свойств, повышает неспецифическую устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям в черезвычайно низких нетоксических для организма дозах.

Рис. 6. Электронно-микроскопическая фотография ТИ-комплекса при соотношении компонентов в системе КД: холестерин: МГДГ: порин.

На следующем этапе исследований мы оценили адъювантную активность ТИ-комплексов в отношении иммунного ответа при иммунизации мышей бактериальным антигеном - субъединичным белком порином, выделенным из мембранного поринового белка Y. рseudotuberculosis. Результаты экспериментов по иммунизации мышей порином в большом диапазоне доз 0,01-0,1-1-5-10-20-50 мкг/мышь позволили выбрать в качестве оптимальной дозу в 10 мкг/мышь, которая была использована для иммунизации самостоятельно и в составе различных носителей. На рисунке 7 показаны различия в содержании специфических антипориновых антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных порином самостоятельно и в составе различных адъювантных комплексов.

Результаты данного эксперимента позволяют сделать вывод о том, что иммуногенные свойства порина слабо выражены и при самостоятельном применении он вызывает слабо выраженный специфический гуморальный иммунный ответ, практически не обеспечивающий протективного эффекта при модельной псевдотуберкулезной инфекции у мышей (данные не представлены). Применение ТИ-комплекса как носителя порина позволяет повысить выраженность этого иммунного ответа, то есть ТИ-комплекс проявляет свойства адъювантного носителя. Уровень гуморального иммунного ответа повышается, причем ТИ-комплексы оказываются более эффективными адъювантами, чем ПАФ, ТЛ-комплексы, классические и модифицированные ИСКОМы с порином. При этом следует отметить, что замена фосфолипида в структуре ИСКОМ на гликолипид обеспечивала тенденцию к повышению адъювантной активности модифицированного ИСКОМ, однако наибольший эффект обеспечивала двойная замена фосфолипида и QuillA соответственно на МГДГ и КД, то есть применение ТИ-комплекса.

Рис. 7. Показатели гуморального иммунного ответа мышей при иммунизации порином (в/б) в дозе 10 мкг/мышь самостоятельно и в составе комплексов.

По оси абсцисс - экспериментальные группы животных.

По оси ординат - концентрация антипориновых антител в ед. ОП при длине волны 492 нм.

В рамках стратегии усиления иммуномодулирующих свойств адъювантов мы применили технологию встраивания в структуру адъювантного носителя тималина - препарата тимуса, обладающего широким спектром иммунологической активности.

При применении тималина в качестве самостоятельного адъюванта в экспериментах по иммунизации мышей порином эффект тималина был малозначительным. Однако, при этом таким же оказался и эффект ПАФ, что еще раз подтверждает наше заключение о слабом иммуногеном потенциале порина. Адъювантный эффект ТИ-комплекса в данном эксперименте вновь оказался выше, чем у классических и модифицированных ИСКОМ, однако включение тималина в ИСКОМ оказалось способно поднять адъювантную активность ИСКОМ до уровней незначительно превосходящих действие ТИ-комплекса.

Результаты данного эксперимента подтверждают как правильность выбранной нами стратегии усложнения структуры матрицы адъювантного носителя путем встраивания в нее иммуноактивных препаратов, так и выбора собственно этого препарата. Для оценки вклада тималина в изменение адъювантной активности ТИ-комплексов был проведен следующий эксперимент, при котором встраивание тималина в ТИ-комплекс производили одновременно с добавлением порина (Рис. 7).

Эти результаты демонстрируют способность тималина потенцировать адъювантную активность ТИ-комплексов в отношении порина. Данный эффект наблюдается при всех испытанных разведениях сыворотки, подтверждая специфический характер данного эффекта, то есть связанный с повышением титров специфических антипориновых антител. Учитывая слабость порина как антигена и иммуногена эти результаты представляются значимыми и доказывают перспективность продолжения исследований адъювантной активности таких конструкций, как ТИ-комплексы с антигенами.

ВЫВОДЫ

При иммунизации животных слабым по иммуногенным свойствам белком - порином из Y. Pseudotuberculosis - ТИ- комплексы как носители порина проявляют свойства адъювантного носителя. Уровень гуморального иммунного ответа повышается более значительно, чем при применении других адъювантных носителей: ПАФ, классических ИСКОМ с порином, модифицированных ИСКОМ - МГДГ и ТЛ-комплексов.

Замена в матрице ИСКОМ фосфолипида на МГДГ из морских макрофитов позволяет сохранить суперструктуру и адъювантную функцию, характерные для ИСКОМ.

Замена в матрице ИСКОМ одновременно фосфолипида на МГДГ и сапонина QullA на кукумариозид приводит к качественному изменению образуемых суперструктур - наряду с классическими гексогональными структурами, характерными для ИСКОМ, образуются тубулярные структуры диаметром, сопоставимым с диаметром ИСКОМ (около 40 нм) и длиной 100 - 400 нм - тубулярно-искомальные (ТИ-) комплексы.

Добавление в структуру матрицы ИСКОМ и ТИ-комплексов иммуноактивного препарата тималина способствует повышению эффективности таких адъювантных конструкций.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Костецкий Э.Я., Попов А.М., Санина Н.М. и др. (2006) Носитель и адъювант для антигенов. Заявка на патент № 2006104795/13(005189) от 15.02.2006г.

2. Ли И.А., Попов А.М., Санина Н.М. и др. (2004) Известия РАН. Сер. биолог., 3, 299-304.

3. Портнягина О.Ю.,Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хомченко В.А., Соловьева Ф.Т. Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний. Вестник ДВО РАН. 2004 № 3.

4. Lee I.A., Popov A.M. Sanina N.M. et al. (2004) Acta Biochimica Polonica, 51, 263 -272

5. Sanina N.M., Goncharova S.N., Kostetsky E.Y. (2003) In Advanced Research on Plant Lipids. Murata et al, eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 385-388.

6. Ройт А., и др. Иммунология М. Мир 2000.

7. Барсуков Л.И. Липосомы // Соровский образовательный журнал. 1998 № 10 с.2-9.

8. Мигунов А.И.,Кузнецов О.К., Киселев О.И. Использование липосом для конструирования вакцин. НИИ гриппа РАМН, С.-Петербург 2001.

9. Соболев Б.Н., Поройнов В.В., Оленина Л.В., Колесанова Е.Ф., Арчанов А.И.. Компьютерное конструирование вакцин Биомедицинская химия, 2003 том 49 № 4 с. 309-332.

10. Хавинсон В.Х., Малинин В.В., Чалисова Н.И., Григорьев Е.И. Тканеспецифическое действие пептидов в культуре тканей крыс разного возраста. Успехи геронтологии, 2002 №9 с.278.

11. Kersten G.F.A., Grommelin D.J.A. Liposomes and ISCOMs // Vaccinе. 2003 V. 21. P. 915-920.

Размещено на Allbest.ru