Основные положения биофармацевтического анализа

В зависимости от цели проведения хроматографического процесса различают:

- аналитическую хроматографию (качественный и количественный анализ); - препаративную хроматографию (для получения веществ в чистом виде, для концентрирования и выделения микропримесей);

- промышленную (производственную) хроматографию для автоматического управления процессом (при этом целевой продукт из колонки поступает в датчик).[4,17]

Классификация по способам проведения анализа подразделяет хроматографию на три вида:

1) фронтальный;

2) проявительный;

3) вытеснительный

Тонкослойная хроматография (ТСХ) широко применяется в биофармацевтическом анализе, ввиду высокой разрешающей способности и чувствительности (рис.2.1).

Рис.2.1. Тонкослойная хроматография

Повысить разрешающую способность тонкослойная хроматография можно, используя метод двумерной хроматографии. Тонкослойная хроматография отличается простотой выполнения, однако при анализе сложных смесей, содержащих большое число компонентов, этот метод не всегда позволяет достигнуть нужного эффекта. Биофармацевтический анализ методом ТСХ чаще всего сочетают с УФ-спектрофотометрией и флуоресцентным методом (хроматоспектрофотометрия, хроматофлуоресценция).[4]

Газовая хроматография (ГФ) и широко применяемый ее вариант - газожидкостная хроматография (ГЖХ) - ввиду высокой чувствительности, хорошей воспроизводимости и точности стоят на одном из первых мест среди физико-химических методов, используемых для анализа лекарственных веществ и их метаболитов в биологических жидкостях. Главным прибором для этого метода исследований является газовый хроматограф (рис.2.2.).

Рис.2.2. Принципиальная схема газового хроматографа:

1 - система подготовки газов; 2 - система дозирования;

3 - устройство для ввода пробы; 4 - хроматографическая колонка; 5 - система детектирования; 6 - блок питания детектора; 7 -регистратор; 8 - измеритель скорости потока газа-носителя

Газовая хроматография позволяет определить микрограммовые и нанограммовые количества этих веществ. Непосредственное введение биологической жидкости в хроматографическую колонку, как правило, не дает положительных результатов. До выполнения анализа методом газовой хроматографии необходимо осуществлять многократную экстракцию (чаще эфиром, хлороформом или этилацетатом) лекарственного вещества или его метаболитов.[5]

Высокоэффективная или высокоскоростная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) отличается от газовой хроматографии тем, что позволяет испытывать соединения, обладающие термической неустойчивостью и молекулярной массой более 400. Для этих соединений исключается фаза перевода в летучие производные. Для идентификации лекарственного препарата исследуются в первую очередь экстракты из мочи и желчи, поскольку, как правило, в этих объектах лекарственные препараты присутствуют в высоких концентрациях. Для количественного определения исследуем экстракты из крови, поскольку только для крови имеются данные по терапевтическим, токсическим и летальным дозам. Жидкость-жидкостная экстракция в делительных воронках, применяемая в настоящее время, имеет ряд недостатков: необходим большой объем биожидкости (до 100 мл), большой расход реактивов, многостадийность, длительность (кровь при подкислении и подщелачивании образует с экстрагентами стойкую суспензию), неточность. Поскольку для исследования методом ВЭЖХ необходимо всего 5-10 мкл пробы, нами исследована возможность проведения однократной экстракции лекарственных препаратов из одной пробы крови (мочи и желчи) объемом 0,6 мл в пробирках «Эппендорф». Предлагаемый метод имеет ряд преимуществ: значительно снижает трудоемкость анализа, снижает стоимость анализа за счет уменьшения объемов используемых реактивов, сокращает случайные и систематические ошибки в процессе подготовки проб, избирателен и чувствителен. По сравнению с тонкослойной хроматографией метод ВЭЖХ требует меньших затрат времени на выполнение анализа. Это обусловило широкое внедрение метода в практику биофармацевтического анализа.[14,16]

2.2 Фотометрические методы анализа

Наиболее часто в биофармацевтическом анализе используют фотометрические методы анализа. Фотометрические методы анализа основаны на избирательном поглощении электромагнитного излучения анализируемым веществом и служат для исследования строения, идентификации и количественного анализа светопоглощающих соединений.

В зависимости от используемой аппаратуры в фотометрическом анализе различают спектрофотометрические методы - анализ по поглощению веществами монохроматического излучения (спектрофотометрия, в УФ-, видимой и ИК-областях спектра); фотоколориметрические - анализ по поглощению веществами немонохроматического излучения (фотоколориметрия, экстракционная фотоколориметрия).

Сравнительно редко в биофармацевтическом анализе используют фотоколориметрию. Этот метод применяют главным образом тогда, когда нужно определить большие концентрации лекарственного вещества или сумму лекарственного вещества и метаболитов, содержащихся в биологической жидкости. Недостаток использования фотоколориметрических методик заключается в сравнительно невысокой их точности.

Весьма перспективен более чувствительный экстракционно-фотометрический метод, основанный на экстракции лекарственного вещества из биологической жидкости с последующим взаимодействием с кислотными или основными красителями (бромтимоловым синим, метиловым оранжевым, бромкрезоловым зеленым и др.). Образующиеся окрашенные продукты (ионные ассоциаты) нередко специфичны для лекарственного вещества и количественно экстрагируются органическим растворителем (хлороформом, бензолом, дихлорэтаном).

Наиболее часто в биофармацевтическом анализе используют спектрофотометрию в УФ- и видимой областях спектра. Этот метод отличается простотой выполнения и достаточной точностью, не требует большого количества операций при подготовке к анализу испытуемого образца. [6,17]

Сравнительно невысокая чувствительность спектрофотометрических методик (от 1 мкг/мл до 1 мг/мл) ограничивает применение данного метода для тех групп лекарственных веществ, суточная доза которых составляет около 1 г.

Масс-спектроскопия -- метод, позволяющий определить массу ионов, ионизированных молекул или фрагментов молекул по отклонению в магнитных и электрических полях или по кинетической энергии. Следовательно, первое, что надо сделать для того, чтобы получить масс-спектр, превратить нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы - ионы, этот процесс называется ионизацией. На разработку способов ионизации органических соединений были затрачены значительные усилия, однако из всего их многообразия только два реально обеспечили возможность анализа жидкостей и используются в современных масс-спектрометрических комплексах:

образование ионов при распылении раствора анализируемого соединения в электрическом поле (электроспрей) (рис.2.3);

десорбция ионов из органической матрицы лазерным излучением (МАЛДИ)

Рис.2.3. Схема ионизации способом электроспрей:

МС - масс-спектрометрический; М - анализируемая молекула; Н+- протон

Естественно, приборы, которые используются в этом методе, называются масс-спектрометры или масс-спектрометрические детекторы (рис.2.4).

Рис.2.4. Схема масс-спектрометра

1 -- система подготовки и введения исследуемого вещества; 2 -- ионный источник; 3 -- масс-анализатор; 4 -- приемник ионов; 5 -- усилитель; 6 -- регистрирующее устройство; 7 -- ЭВМ; 8 -- система электрического питания; 9 -- откачные устройства.

Метод отличается очень высокой разрешающей способностью, в десятки раз превышающей другие методы. Это позволяет проводить, например, анализ примесей при их относительном содержании менее 10-9, определять элементный и изотопный состав пробы с большой точностью. Известны также различные варианты масс-спектрометрии. [22]

Особенно хорошие результаты в биофармацевтическом анализе были достигнуты при комбинированном применении газожидкостного хроматографа и масс-спектрометра в одном приборе (хромато-масс-спектрометрия). На основе такого сочетания был создан принципиально новый метод анализа трудноразделяемых смесей - масс-фрагментография. Суть метода заключается в том, что масс-спектрометр используется как высокочувствительный детектор к газовому хроматографу. Основное достоинство масс-фрагментографии - чрезвычайно большая чувствительность, достигающая нескольких пикограммов (1 пг = 10-12г). Это в 1000-10000 раз выше, чем у ГЖХ. Высокая специфичность позволяет анализировать неразделенные компоненты этих смесей, а высокая чувствительность дает возможность определять метаболиты лекарственных веществ, применяемых в очень малых терапевтических дозах. [7,22]

2.3 Методы, основанные на использовании магнитного поля

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) -- метод, основанный на регистрации индуцированных радиочастотным полем переходов между ядерными магнитными энергетическими уровнями молекул вещества, помещенного в магнитное поле. Метод позволяет изучать магнитные переходы ядер со спиновыми квантовыми числами больше нуля (ядра 'Н, 13С, 19Р, 31Р). Совокупность сигналов переходов между энергетическими уровнями ядер молекул составляет спектр ЯМР. Каждый спектр ЯМР регистрируется для одного типа ядер и специфичен для каждого вещества. Чаще всего используют спектроскопию на протонах (ПМР) и ЯМР. Спектры регистрируют при помощи ЯМР-спектрометров (рис.2.5).

Рис.2.5. Схема спектрометра ЯМР:

1 - катушка с образцом; 2 - полюса магнита; 3 -генератор радиочастотного поля; 4 -усилитель и детектор; 5 - генератор модулирующего напряжения; 6 - катушки модуляции поля В0; 7 - осциллограф.

Спектр представляет собой совокупность пиков с различной шириной, площадью и интенсивностью сигналов. По характеру протонных сигналов можно сделать заключение о наличии в молекуле тех или иных групп атомов. Величина химического сдвига имеет порядок 10~6 или млн~! (миллионная доля). Метод ЯМР-спектроскопии используют для объективной идентификации органических лекарственных веществ и для количественного определения относительного содержания вещества или примеси. Подлинность может быть подтверждена либо путем сравнения со стандартным образцом, либо по наиболее характерным сигналам спектра, либо по полному набору спектральных параметров. [24,23]

2.4 Люминисцентные методы анализа. Флуориметрия

Люминесценция, как явление известно, давно, но её практическое применение началось только в конце 19 века, когда были сформулированы основные понятия и разработаны некоторые её теоретические положения. Под люминесценцией понимают свечение вещества, которое возникает после поглощения им энергии возбуждения. Существует несколько способов классификации люминесценции:

По способу возбуждения различают следующие виды люминесценции:

фотолюминесценция - возбуждение электромагнитным излучением оптических частот;

хемилюминесценция - возбуждение за счет энергии химических реакций;

радиолюминесценция - возбуждение под действием различных видов радиоактивного излучения;

рентгенолюминесценция - возбуждение за счет энергии рентгеновских лучей;

сонолюминесценция - возбуждение при воздействии интенсивных звуковых волн на жидкость;

триболюминесценция - возбуждение за счет превращения механической энергии в световую.

При комнатной температуре большинство молекул вещества находятся на самом низком колебательном уровне основного электронного состояния (т.е. в нормальном невозбужденном состоянии). Для большинства соединений это состояние является синглетным. Поглощение молекулой световой энергии приводит к переходу электронов на колебательные уровни одного из возбужденных состояний. Это состояние неустойчиво, система стремится отдать избыток энергии, при этом электроны молекулы переходят с высшего колебательного уровня синглетного возбужденного состояния на более низкий энергетический уровень синглетного состояния или в триплетное возбужденное состояние, эти переходы будут происходить без излучения энергии (процессы внутренней или интеркомбинационной конверсии). Люминесценцию характеризуют спектрами поглощения и люминесценции, энергетическим выходом, квантовым выходом. Знание величины выхода люминесценции и влияния различных факторов на эту величину имеет очень большое значение для люминесцентного анализа. Чем больше выход люминесценции для какого-то определенного вещества, тем чувствительнее аналитическая реакция, основанная на излучении этого вещества.[2]

Спектры поглощения и люминесценции у многих веществ тесно связаны между собой и подчиняются ряду важных закономерностей или правил. Согласно правилу Стокса -- Ломмеля спектр излучения в целом и его максимум по сравнению со спектром поглощения и его максимумом всегда сдвинут в сторону длинных волн. Это можно объяснить тем, что в результате различных безызлучательных процессов возбуждённая молекула теряет часть поглощённой энергии - поэтому энергия флуоресценции оказывается меньше поглощённой, с максимум сдвинутым в сторону длинных волн (рис.2.6).

Рис.2.6.Зеркальная симметрия спектров флуоресцирующих веществ: 1 -- спектр поглощения; 2 -- спектр излучения флуоресцирующего вещества

Установлено зеркальное подобие спектров поглощения и излучения для обширного ряда веществ -- правило Левшина. Его можно сформулировать следующим образом: спектры поглощения и излучения, изображенные в функции, оказываются зеркально-симметричными относительно прямой, проходящей перпендикулярно к оси частот через точку пересечения обоих спектров. Спектры поглощения и флуоресценции пересекаются в точке, которая соответствует возбуждению электрона и излучению кванта без потерь на безызлучательные переходы. Во многих случаях спектральные характеристики флуоресценции органических веществ позволяют идентифицировать эти соединения по их спектрам. В простейшем случае качественное определение веществ может быть проведено по цвету флуоресцентного излучения.

В свою очередь количественный люминесцентный анализ основан на зависимости интенсивности флуоресценции растворов от концентрации. Количественный флуоресцентный анализ необходимо проводить при невысоких температурах и определенных значениях рН.

На интенсивность флуоресценции существенным образом влияет:

природа вещества;

температура (в большинстве случаев с повышением температуры выход и интенсивность флуоресценции уменьшаются, то есть происходит температурное гашение флуоресценции);

рН среды (зависимость носит сложный характер); присутствие в растворе побочных веществ (гашение флуоресценции).

Особый интерес для аналитической химии имеет метод объемного титрования с использованием люминесцентных индикаторов. Сочетание люминесцентного и хроматографического методов используется в люминесцентной хроматографии.

При анализе растворов, содержащих мешающие определению примеси, исследуемое вещество экстрагируют органическим растворителем. Этот способ используют и в том случае, когда в результате фотометрической реакции получают малорастворимые в воде, но хорошо растворимые в органических растворителях комплексные соединения. Исследуемое вещество, способное к флуоресценции, выделяют экстракцией и определяют обычным способом. Этот метод анализа называется экстракционно-люмжесцентным. Использование комбинированных методов флуориметрии и концентрирования позволяет существенным образом повысить чувствительность анализа.[2,6]

Флуориметрия - метод фотометрического анализа, основанный на измерении интенсивности флюоресценции испытуемых веществ.

Принцип метода флуориметрии заключается в пропорциональности между интенсивностью фотолюминесценции анализируемого образца и количеством определяемого вещества.
Флуориметрия находит применение в таких направлениях, как:

Идентификация. Характер спектра флуоресценции, а также цвет излучаемого света специфичны для любого флуоресцирующего вещества.

Количественный анализ. При количественных определениях интенсивность флуоресценции испытуемого образца сравнивают с интенсивностью флуоресценции стандартного образца вещества с известной концентрацией, измеренной в идентичных условиях на одном и том же приборе.

Методика. Согласно фармакопейной статье испытуемый образец растворяют в растворителе или в смеси растворителей. Переносят раствор в кювету флуориметра и освещают лучом возбуждающего света с указанной в методике длиной волны.

Интенсивность флюоресценции в разбавленных растворах определяется следующим уравнением:

F = I0 2,3 c b ,

где F - общая интенсивность флюоресценции, квант/c;

I0 - интенсивность возбуждающего света, квант/c;

- молярный коэффициент поглощения;

c - концентрация раствора моль/л;

b - толщина флюоресцирующего слоя, см;

- квантовый выход флюоресценции, зависящий от природы вещества.

Чувствительность флуоретического анализа около 0,01 мкг/мл. По сравнению с УФ-спектрофотометрией она выше в 10-100 раз. Поэтому с помощью флуориметрических методик можно подвергать биофармацевтическому анализу лекарственные вещества, суточные дозы которых составляют несколько миллиграммов. Особенно высокой чувствительностью отличаются спектрофлуориметрические определения. Недостатком метода является необходимость тщательной очистки испытуемых веществ многократным повторением процессов экстракции или разделения. Это вызвано тем, что в биологических жидкостях организма нередко содержатся вещества, обладающие флуоресценцией. Флуоресцировать могут и метаболиты лекарственного вещества. [2,6,16]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биофармацевтический анализ играет важную роль в оценке эффективности, обеспечении безопасности и индивидуальной переносимости организмом человека лекарственных веществ (ЛВ). При этом современные методы анализа ЛВ в биологических объектах представляют собой в своей совокупности своеобразный инструмент для проведения биофармацевтических исследований на различных этапах создания и клинического применения лекарственных средств. Они включают определение фармако - и токсикокинетических параметров ЛВ, оценку и контроль состояния метаболических систем организма и целенаправленную регуляцию их ферментативной активности для достижения оптимального фармакологического эффекта. Все выше сказанное обуславливает необходимость разработки более совершенных методов биофармацевтического анализа для установления фармакокинетических параметров тест-препаратов процессов метаболизма в биологических жидкостях. Последнее служит основой индивидуализации дозирования ЛВ, учета биохимических фенотипов при терапии различных патологических состояний и проведения мониторинга лекарственных препаратов. При этом сложный многокомпонентный состав биологических жидкостей особенно при низких содержаниях анализируемых веществ требует использования избирательных и чувствительных методов определения ЛВ. В то же время не менее значимым является требование высокой производительности, надежности и возможности получения большого объема аналитической информации при проведении биофармацевтического анализа в клинических условиях. Таким требованиям удовлетворяют хроматографические и оптические методы, которые все более интенсивно используются в контроле генетически детерминированных биохимических процессов метаболизма ЛВ в организме человека. Биофармацевтические и фармакокинетические исследования позволяют решить ряд практических задач, например, дать рекомендации по изменению физических или химических свойств лекарственных веществ для повышения их фармакологической активности; обосновать оптимальный выбор биофармацевтических факторов при производстве тех или иных лекарственных форм. Практическое значение имеют и такие рекомендации, как уточнение показаний и противопоказаний, установление рациональных терапевтических доз и периодичности их приема в течение суток, определение оптимальных путей введения лекарственных средств в организм, разработка научно обоснованных схем лечения тех или иных заболеваний.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Антонова М.И., Прокопов А.А., Ахапкина В.И. Количественный анализ фенотропила в биологических объектах методом газожидкостной хроматографии // Химико.-фарм. журн. - 2003.- Т. 37, № 10. - С. 46-47.

2. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. Учебное пособие для фарм. факультетов и фак. мед. ин-тов. - М.: МЕДпресс-информ, 2008. - 624 с.

3. Буркин А.А. Имуноферментный анализ веществ и их метаболитов. Сообщение 2. Лизиноприл и эналаприл // Химико-фарм. журн. - 2004. - Т. 38, № 6. - С. 54-56.

4. Буланова А.В., Полюкова Ю.Л. «Хроматография в биологии и медицине»: учебное пособие, 2-е изд.- Самара: Издательство «Самарский университет», 2006.-116 с.

5. Винарский В.А. Хроматография: Курс лекций: В 2 ч. Ч. 1. Газовая хроматография. - Минск: БГУ, 2002. - 192с

6. Григорьев О.А. «Введение в биофармацевтический анализ».-Курск: КГМУ,2002.-132 с.

7. Евгеньев М. И., Гармонов С. Ю. Спектрофотометрическое определение фосфабензида в биологических жидкостях // Химико-фарм. журн. - 2005. - Т. 29, № 8. - С. 59-61.

8. Иванов А.В., Родионова Г.М., Байкова В.Н., Арзамасцев А.П. «Сравнительная оценка методов количественного определения концентрации метотрексата в биологических жидкостях» Вопросы биологической медицины и фарм. химии. - 2004.- № 3. - С. 49-52.

9. Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., «Фармакокинетика».- Ростов на Дону: издательство Феникс, 2001.-383 с.

10. Киселёва Г.С. «Биоэквивалентность и качество лекарственных средств» Издательство «Основа», 1998.-448 с.

11. Краснов Е.А., Кадырова Т.В. Стандартизация лекарственных средств: Учебное пособие. - Томск, 2005. - 125 с.

12. Кондратенко С.Н. «Фармакокинетика и относительная биодоступность ранитидина» Химико-фарм. журн. - 2003. - Т. 37, № 6. - С. 14-15.

13. Кокорина Н.О. «Скрининг лекарственных препаратов в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», Москва - Тюмень, 2005. С. 146-147.

14. Крупина Н.А., Краснова Р.Р., Пашовкина Р.Н. «Химико-токсикологический анализ лекарственных веществ в крови (плазме, сыворотке) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», Москва - Тюмень, 2005. С. 173-175.

15. Лакин К.М., Крылов Ю.Ф. «Биотрансформация лекарственных веществ». - М.: Медицина, 2001. - 342 с.

16. Мирошниченко И.И., Юрченко Н.И. Определение омепразола и лансопразола в плазме крови методом ВЭЖХ // Химико-фарм. журн. - 2002. - Т. 36, № 7. - С. 48-49.

17. Мельникова Н.Б., Пожидаев В.М. и др. Введение в хроматографический анализ: методические разработки для студентов V курса фармацевтического факультета. - Нижний Новгород: НижГМА, 2005. - 32 с.

18. Перцев И.М., Зупанец И.А. Шевченко Л.Д. и др. «Фармацевтические и медико-биологические аспекты лекарств» -Т.1, издательство УкрФа,1999.-464с.

19. Раменская В.Г. ВЭЖХ-анализ верапамила и его метаболитов в плазме крови // Фармация. - 2003. - Т. 37, № 2. - С. 3-8.

20. Соколова Л.И., Черняев А.П. Определение антибиотиков цефалоспоринового ряда в биологических объектах методом обращённо-фазовой ВЭЖХ // Химико-фарм. журн. - 2002. - Т. 36, № 6.- С. 39-45.

21. Тихонов А.И, Ярных Т.Г., Зупанец И.А.; Под ред. Тихонова А.И. «Биотрансформация»: Учебник для студ. фармацевтических вузов и факультетов. Издательство НФаУ; Харьков, 2003.-240с.

22. Maurer H.H. Liquid chromatography-mass spectrometry in forensic and clinical toxicology // J.сhromatography B. Biomed. Sci. Appl. - 2005.- V. 713, № 1. - Р. 3-25.

23. Масс-спектроскопия в биофармацевтическом анализе. Режим доступа: http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2448.html (посещение 21.05.2014)

24. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Режим доступа: http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2/5462.html (посещение 19.05.2014)

25. Основные положения биологической доступности лекарств. Режим доступа:http://tought.ucoz.ru/news/osnovnye_polozhenija_biologicheskoj_dostupnosti_le/2013-06-20-28 (посещение 25.05.2014)

Размещено на Allbest.ru