Открытие принципов введения специфических генных модификаций мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток

Оливер Смитис был лидером в этом развитии. Вместе с Нобуйо Маэдой он сосредоточился на двух важных, сложных заболеваниях-гипертонии и атеросклерозе. Близнецы исследования показывают, что генетические факторы могут составлять около 70% семейной агрегации эссенциальной гипертензии. Однако, по крайней мере 10 генов были показаны, что изменяют кровяное давление и их продукты гена кажутся, что взаимодействуют в сложных путях.

Несмотря на открытие, что полиморфизм гена ангиотензиногена (AGT) связан с эссенциальной гипертензией, генетика этого заболевания остается малоизученной [16] . Мало что известно о количестве генов, фактически участвующих в развитии эссенциальной гипертензии у человека, их количественном влиянии на артериальное давление, способе их передачи или их взаимодействии с другими генами и компонентами окружающей среды.

Генный таргетинг был исключительно полезен в исследованиях рака. Большое количество протоонкогенов, генов-супрессоров опухолей, ангиогенетических факторов и др. были нацелены на различные ткани у мышей, чтобы пролить свет на индукцию и распространение опухолей [15]. Генное таргетирование генов-супрессоров опухолей помогло уточнить их роль в формировании опухолей.

Например, мыши, несущие целевой ген р53, были предрасположены к развитию опухоли [14]. Условное таргетирование (с использованием технологии Cre-lox) гена adenomatous polyposis coli (APC) индуцирует колоректальные опухоли у мышей, и APC-таргетные мыши стали полезными моделями для исследования солидных опухолей [15] . Таргетирование генов эндотелиальных факторов роста и протеолитических ферментов имеет важное значение для понимания механизмов неоангиогенеза и метастазирования солидных опухолей, а также используется для разработки терапевтических стратегий по предотвращению их распространения [14] .

Современные исследования большинства, если не всех основных заболеваний человека, включают в себя генное таргетирование у мышей, и существуют “нокаутирующие модели” для эндокринных, метаболических, неврологических, воспалительных и других расстройств. Ген-таргетные модели мышей также становятся все более важными в исследованиях защиты хозяина от патогенов. Действительно, мышиные гены-мишени стали незаменимыми практически во всех аспектах медицинских исследований.

4.2 Примеры использования нокаутированных мышей для изучения функций генов и наследственных заболеваний человека

Существует много примеров использования классического нокаута генов для изучения биологических функций индивидуальных генов или семейств генов. Рассмотрим лишь некоторые из них.

Изучение функций генов.

1) Ген Nuk, член семейства рецепторов тиронинкиназы, который был изучен с помощью делеций и модификаций. У мышей с отсутствием продукта этого гена нарушался контроль прорастания нейронов к клетке-мишени. Однако белок Nuk - трансмембранный белок. Чтобы дифференцировать роль внутриклеточных и внеклеточных доменов в миграции аксонов были модифицированы участки гена, кодирующие оба типа доменов. В результате этой работы было показано, что в прорастании аксонов к мишеням основную роль играет внутриклеточный домен белка Nuk [11].

2) Для изучения процессов созревания лимфоцитов была внесена точечная мутация (стоп-кодон) в ген б-цепи рецептора иммуноглобулина. Мутантные мыши имели незначительные дефекты в раннем развитии В-лимфоцитов, но сильные отклонения в созревании и функциях зрелых лимфоцитов [24].

3) Метод классического нокаута гена был использован и для получения партеногенетических мышей. Гены Igf2 и H19 - одни из основных импринтируемых генов млекопитающих, действующих в цис-положении и играющих ключевую роль в развитии организма. При этом для нормального развития необходимо наличие как отцовского, так и материнского набора хромосом. При развитии партеногенетических зародышей, получивших обе хромосомы от матери, ген Igf2 оказывается неактивен, что приводит к терминации развития. Делеция гена H19 в одной хромосоме позволила активировать ген Igf2 и получить условно партеногенетическое животное [17,18].

Модели генетических нарушений и заболеваний человека, созданные с использованием технологии нокаута генов:

1) Мутации гена TnI были обнаружены у пациентов с гипертрофической кардиомиопатией. Чтобы изучить влияние мутации в данном гене на развитие заболевания были созданы мыши с нокаутом по гену TnI. Гомозиготные нокаутированные животные умирали через 18 дней после рождения вследствие развившейся кардиомиопатии. Таким образом была доказана непосредственная связь мутации гена TnI с данным заболеванием [13].

2) Для изучения генетических основ развития алкоголизма было инактивировано 18 генов (альдегиддегидрогеназа, рецепторы дофамина, ГАМК-рецепторы, нейропептид Y и др.), предположительно участвующих в этом процессе. Все мутанты были охарактеризованы по поведенческим и фармакологическим тестам, что позволило оценить вклад изучаемых генов в развитие заболевания [4].

3) Большая работа с использованием методики нокаута генов проводилась с целью изучения функции опиоидной системы мозга. 4) Инактивация гена FMR-1 мыши позволила создать модель синдрома ломкой Х хромосомы и изучить отклонения в поведении животных и молекулярные механизмы заболевания [2,6,9].

5) С помощью нокаута была показана роль рецептора инсулина и внутриклеточных белков-мессенджеров в развитии диабета второго типа [30], роль цитокинов и хемокинов в развитии астмы и др. респираторных заболеваний [27]. Также показано участие генетических факторов в развитии некоторых инфекционных заболеваний [7], участие NO синтазы в развитии атеросклероза [14], влияние продукта гена, кодирующего VI-a рецептор вазопрессина, на формирование социального поведения и поведения беспокойства у мышей [3].

Выводы по 4 главе

Генное таргетирование изменило физиологию и медицину. Среди основных биомедицинских наук трудно представить себе современные медицинские исследования без использования генно-целевых моделей. Способность генерировать предсказуемые конструкторские мутации в генах мышей привела к проникновению новых знаний в области развития, иммунологии, нейробиологии, физиологии и метаболизма.

Это также позволило создать модели заболеваний патологий человека в податливой системе млекопитающих и, следовательно, позволило экспериментально рассечь состояния болезни, идентифицировать новые цели терапии и разработать тест-системы для фармакологии. Наконец, очевидно, что разработка в будущем новых методов лечения для исправления генетических дефектов у человека будет основываться на опыте модификации генов у мышей, который основан на открытиях, сделанных Марио Капекки, Мартином Эвансом и Оливером Смитисом.

Заключение

В ходе курсовой работы была проанализирована научная литература.

Составлено представление об экспериментах, на основе которых открыты и изучены механизмы введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток. Были исследованы пути открытия принципов введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток. Были освоены методы, на которых были основаны открытия принципов введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток. Раскрыта важнейшая роль исследования ученых.

Соединенные вместе открытия троих исследователей дали четкое представление о принципах введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток.

В ходе написания курсовой работы нами были раскрыты принципы введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток, метод нокаута гена и генное таргетирование. Прежде ученые могли просто выявлять те или иные изменения в генетическом материале животных и пытаться с помощью отбора выделить "чистые линии" обладающих теми или иными особенностями мышей. Этот пассивный путь не давал и толики той свободы, которую исследователи обрели, научившись напрямую воздействовать на нужный ген.

Самое продуктивное использование этой технологии - "выключать" те или иные гены и смотреть, какое влияние оказало это выключение на организм животного. Таким образом можно точно установить функцию каждого гена, а значит, понять механизмы нормального развития организма и формирования определяемых наследственностью заболеваний - рака, диабета, болезней сердца и т.д. Это "выключение" получило название "генетического нокаута". В наследственном материале мышей, по современным представлениям, функционирует около двадцати тысяч генов, каждый из которых, упрощенно говоря, отвечает за какой-либо признак в организме животного. К моменту присуждения Капекки, Смитису и Эвансу нобелевской премии ученым удалось исследовать последствия выключения половины из них, то есть десяти тысяч. Как говорится в сообщении Нобелевского комитета, в ближайшем будущем генетики надеются провести последовательный нокаут каждого из мышиных генов.

Нокаут, таким образом, дает возможность "препарировать" каждое генетическое заболевание и каждый аспект нормального развития живого существа, что делает его универсальным методом, приложимым практически в любой сфере исследований. В наши дни трансгенные организмы перестают быть редкостью и значение их для биологии и медицины трудно переоценить. Искусственное включение практически любого интересующего исследователей гена позволяет физиологам изучать на трансгенных животных различные отклонения в гомеостазе организма, иммунной системе, в эмбриогенезе и во многих других случаях. Исследования в биомедицине сосредоточены в основном на том, чтобы создать широкий спектр моделей заболеваний человека, включая такие, как атеросклероз, диабет, гипертонию, болезнь Альцгеймера, ретинобластому, онкологические и многие другие заболевания. Модели трансгенных животных, как правило мышей, позволяют изучать механизмы развития и лечения болезней человека. Трансгенные мыши являются также незаменимой модельной системой и для тестирования генетических конструкций перед получением сельскохозяйственных трансгенных животных-биореакторов, способных с молоком продуцировать белки человека.

Список использованной литературы

1.Анисимов В.Н. Фактор времени в многостадийном канцерогенезе // Вопросы онкол.- 1990.- T. 36.- C. 771-784.

2. Анисимов В.Н. Канцерогенез и онтогенез: основные направления и результаты исследований // Вопросы онкологии. - 1997. - Т. 43, N 1. - С. 88- 94.

3. Анисимов В.Н. Роль индуцируемой 5-бромодезокcиуридином нестабильности генома в механизмах ускоренного старения и канцерогенеза // Успехи геронтологии. - 1997. -- Т. 1. - С. 50-56.

4. Бауэр Э.С. Теоретическая биология. - М.; Л.: Изд.-во Всесоюзного института экспериментальной медицины, 1935. - 206 с.

5. Газиев А.И., Подлуцкий А.Я. Бредбери Р. Увеличение с возрастом частоты спонтанных и индуцированных g-радиацией hprt-мутаций в лимфоцитах селезенки мышей // Докл. РАН. - 1994. - Т. 339. - С. 276-278.

6. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцрогенеза // Биохимия. - 2000. - 65, № 1. - С. 5-33.

7. М.П.Мошкин. Горизонты науки // Постгеномная Эра. - 2016.- №3.- С.24.

8. Мартин Эванс. [Электронный доступ], Режим доступа: https://info-farm.ru/alphabet_index/m/martin-ehvans.html.

9. Нобелевская премия за отключение генов. [Электронный доступ]. Режим доступа:https://www.peoples.ru/medicine/geneticist/mario_capecchii/

10. Пушкарьов В.М., Ковзун О. I., Тронько М.Д. Роль протеинкиназ // Украинский биохимический журнал -2005. - 77, № 1. - С. 65-71.

11. Оливер Смитиз. [Электронный доступ]. Режим доступа:https://info-farm.ru/alphabet_index/o/oliver-smitiz.html.

12. Репин В.С. Эмбриональная стволовая клетка: от фундаментальной биологии к медицине // Успехи физиологических наук. - 2001. - Т. 32, №1. - С. 3-18.

13. Тронько М.Д., Пушкарев В.М. Механизмы нокаута генов // Эндокринология. - 2003. - 8, № 2. - С. 228-243.

14. Bardoni B., Mandel J.L., Fisch G.S. FMR1 gene and fragile X syndrome // Am. J. Med. Genet. - 2000. - Vol. 97, №2. - P. 153-163.

15. Bielsky I.F., Hu S.B., Szegda K.L., Westphal H., Young L.J. Profound impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice // Neuropsychopharmacology. - 2004. - Vol. 29, №3. - P. 483-493.

16. Capecchi M.R. Altering the genome by homologous recombination // Science. - 1989. - Vol. 244. - P. 1288-1292.

17. Chen L., Toth M. Fragile X mice develop sensory hyperreactivity to auditory stimuli // Neuroscience. - 2001. - Vol. 103, №4. - P. 1043-1050.

18. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. - 1981. - Vol. 292, №5819. - P. 154-156.

19. Frankland P.W., Wang Y., Rosner B., Shimizu T., Balleine B.W., Dykens E.M., Ornitz E.M., Silva A.J. Sensorimotor gating abnormalities in young males with fragile X syndrome and Fmr1-knockout mice // Mol. Psychiatry. - 2004. - Vol. 9. - P. 417-425.

20. Henkemeyer M., Orioli D., Henderson J.T., Saxton T.M., Roder J., Pawson T., Klein R. Nuk controls pathfinding of commissural axons in the mammalian central nervous system // Cell. - 1996. - Vol. 86. - P. 35-46.

21. Kawashima S., Yokoyama M. Dysfunction of endothelial nitric oxide synthase and atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2004. - Vol. 24, №6. - P. 998-1005

22. Kieffer B.L., Gaveriaux-Ruff C. Exploring the opioid system by gene knockout // Prog. Neurobiol. - 2002. - Vol. 66, №5. - P. 285-306.

23.Kilby N.J., Snaith M.R., Murray J.A.H. Site-specific recombinases: tools for genome engineering // Trends Genet. - 1993. - Vol. 9. - P.413-421.

24.Kono T., Obata Y., Wu Q., Niwa K., Ono Y., Yamamoto Y., Park E.S., Seo J.S., Ogawa H. Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood // Nature. - 2004. - Vol. 428, №6985. - P. 860-864.

25.Loebel D.A., Tam P.P. Genomic imprinting: mice without a father // Nature. - 2004. - Vol. 428, №6985. - P. 809-811.

26.Mansour S.L., Thomas K.R., Capecchi M.R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes // Nature. - 1988. - Vol. 336, №6197. - P. 348-352.

27.Reeves R.H. Exploring development and disease through germ-line genetic engineering in the mouse // Anat. Rec. - 1998. - Vol. 253, №1. - P. 19-23.

28.Thomas K.R., Capecchi M.R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells // Cell. - 1987. - Vol. 51, №3. - P. 503-512.

29.Vasquez Y.R., Spina D. What have transgenic and knockout animals taught us about respiratory disease? // Respir. Res. - 2000. - Vol. 1, №2. - P. 82-86.

30.Volarevic S., Pende M., Pullen N. Manipulating mammalian genome by gene targeting // Croat. Med. J. - 1999. - Vol. 40, №3. - P. 368-374.

Размещено на Allbest.ru