В зависимости от способа ввода пробы и способа перемещения хроматографич. зон по слою сорбента различают след. варианты хроматографии: проявительный (или элюентный), фронтальный и вытеснительный. В наиб. часто используемом проявительном варианте анализируемую смесь периодически импульсно вводят в поток подвижной фазы; в колонке анализируемая смесь разделяется на отдельные компоненты, между к-рыми находятся зоны подвижной фазы.

Во фронтальном варианте хроматографии пробу, содержащую разделяемые в-ва, непрерывно подают в колонку. Можно также подавать в колонку одновременно пробу и подвижную фазу. Во фронтальной хроматографии только первый, наименее сорбируемый компонент можно получить в чистом виде на выходе из колонки, вторая и последующая зоны содержат по два и более компонентов разделяемой смеси.

В вытеснительном варианте хроматографии в колонку после подачи разделяемой смеси вводят спец. в-во (т. наз. вытеснитель), к-рое сорбируется лучше любого из разделяемых компонентов. В вытеснительной хроматографии образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых в-в. Во фронтальном и вытеснительном вариантах хроматографии необходима регенерация колонки перед след. опытом.

4.1 Хромотография на бумаге.

БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, вид хроматографии, основанный на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси по бумаге в потоке р-рителя (элюента). Хроматограммой в этом случае называют картину расположения хроматографич. зон на бумаге после завершения разделения. В бумажной хроматографии используется гл. обр. спец. хроматографич. бумага, к-рая должна быть максимально однородной и содержать только целлюлозные волокна. Она может служить неподвижной фазой или инертным носителем неподвижной фазы.

В распределительной бумажной хроматографии неподвижная фаза - адсорбированная бумагой вода или неполярные орг. р-рители, к-рыми пропитывают бумагу (вариант с обращенными фазами), а элюент - соотв. смеси орг. р-рителей с водой, часто содержащие также к-ты, комплексообразующие и др. в-ва, или водные р-ры неорг. к-т и солей. Скорость перемещения компонентов зависит от коэф. их распределения между фазами и от соотношения объемов этих фаз.

В адсорбционной бумажной хроматографии разделение компонентов смеси происходит благодаря различию в их сорбируемости адсорбентом - бумагой. В кач-ве элюента используются гл. обр. смеси орг. р-рителей с водой.

В ионообменной бумажной хроматографии используют бумагу, пропитанную ионообменными смолами. Скорость миграции компонентов в этом случае зависит гл. обр. от констант ионного обмена и рН элюента.

Осадочная бумажная хроматография осуществляется на бумаге, импрегнированной р-ром реагента-осадителя, образующего с разделяемыми в-вами малорастворимые соединения. Скорость движения компонентов определяется произведениями р-римости этих соединений.

В лигандообменной бумажной хроматографии бумагу предварительно обрабатывают р-рами ионов металлов, напр. Сu²⁺ при разделении аминов и аминокислот. При этом компоненты перемещаются в зависимости от констант устойчивости их комплексных соед. с ионами металлов.

На практике часто реализуются одновременно неск. механизмов разделения. Бумажная хроматография осуществляется в стеклянных хроматографич. камерах или др. закрытых сосудах. Для улучшения воспроизводимости их часто кондиционируют, покрывая внутр. стенки фильтровальной бумагой, смоченной соответствующим р-рителем. В камеру помещают лоток с элюентом, в к-рый опускают край хроматографич. бумаги после нанесения на нее пробы разделяемых в-в (обычно объемом 1-10 мкл). Элюент движется под действием капиллярных и гравитац. сил. По расположению бумаги и направлению тока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную бумажную хроматографию. Хроматографирование можно проводить также в центробежном поле или в условиях градиента т-ры, что увеличивает эффективность и скорость разделения. В т. наз. двумерной бумажной хроматографии пробу наносят в один из углов квадратного листа и после завершения хроматографирования в одном элюенте бумагу высушивают и, повернув на 90°, погружают в др. элюент. На двумерной хроматограмме получают до n² хроматографич. зон, где и -число зон, образующихся при обычной (одномерной) бумажной хроматографии.

После подъема р-рителя на определенную высоту бумагу вынимают из камеры, высушивают и выявляют хроматографич. зоны. Если зоны не окрашены, хроматограмму опрыскивают р-рами специфич. реагентов, образующих с компонентами разделяемой смеси окрашенные или флуоресцирующие соединения. Используют также ферментативные и биол. методы детектирования, напр., для выявления ферментов хроматограмму обрабатывают р-ром соответствующих субстратов. Радиоактивные в-ва обнаруживают, экспонируя хроматограмму на рентгеновскую пленку.

Положения хроматографич. зон в бумажной хроматографии характеризуют величиной R_f, представляющей собой отношение пути, пройденного центром хроматографич. зоны, к пути, пройденному фронтом р-рителя: R_f= 1/[1 + (K_dV_s/V_m)], где К_s и V_т- объемы соотв. неподвижной и подвижной фаз, К_d-коэф. распределения в-ва между этими фазами. Погрешность определения R_f ок. 5%. В стандартизованных условиях эта величина постоянна для каждого в-ва и используется для его идентификации.

Количеств. анализ проводят непосредственно на хрома-тограммах или после отделения в-ва хроматографич. зон от целлюлозной основы. В первом случае компоненты определяют с помощью сканирующей денситометрии, флуориметрии, фотометрии или по размеру хроматографич. зон, а также активац. методами (при использовании последних двух методов зоны предварительно вырезают). Пределы обнаружения в-в в зонах по окрашенным производным составляют 0,1-10 мкг, флуориметрически -10^-3-10^-2 мкг, активационным методом - 10^-4-10^-10 мкг. Отделение компонентов от целлюлозной основы осуществляют экстрагированием, сжиганием бумаги или кипячением ее в смеси к-т. Затем компоненты определяют любым подходящим методом, обычно спектрофотометрическим, титриметрическим или кинетическим. Погрешность количеств. анализа не превышает 10%.

С помощью бумажной хроматографии можно разделить и анализировать практически все классы хим. соед., в т.ч. аминокислоты, сахара, стероиды. Кроме того, бумажная хроматография в сочетании с двумерным электрофорезом используется как микропрепаративный метод разделения природных в-в, в частности пептидов.

Достоинства бумажной хроматографии: возможность разделения малых кол-в (0,001-1 мкг) в-в, высокая чувствительность, простота аппаратуры. Недостаток метода: сильное размывание хроматографич. зон, связанное с неоднородностью бумаги. Вследствие этого для разделения сложных смесей в-в необходимо использовать листы длиной ок. 1 м, что приводит к увеличению длительности эксперимента (для двумерной бумажной хроматографии до 15-20 ч) и большому расходу р-рителя.

4.2 Газовая хроматография.

Газовая хроматография -- разновидность хроматографии, метод разделения летучих компонентов, при котором подвижной фазой служит инертный газ (газ-носитель), протекающий через неподвижную фазу с большой поверхностью. В качестве подвижной фазы используют водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ. Газ-носитель не реагирует с неподвижной фазой и разделяемыми веществами.

Различают газо-твёрдофазную и газо-жидкостную хроматографию. В первом случае неподвижной фазой является твёрдый носитель (силикагель, уголь, оксид алюминия), во втором -- жидкость, нанесённая на поверхность инертного носителя.

Разделение основано на различиях в летучести и растворимости (или адсорбируемости) компонентов разделяемой смеси.

Этот метод можно использовать для анализа газообразных, жидких и твёрдых веществ с молекулярной массой меньше 400, которые должны удовлетворять определённым требованиям, главные из которых -- летучесть, термостабильность, инертность, лёгкость получения. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют, как правило, органические вещества, поэтому газовую хроматографию широко используют как серийный метод анализа органических соединений.

Главным прибором для этого метода исследований является газовый хроматограф.

4.3 Газо-адсорбционная хроматография.

Газо-адсорбционная хроматография - это вариант хроматографии, в котором разделение производится с помощью подвижной газовой фазы, проходящей вместе с анализируемой смесью над твердым сорбентом. В качестве сорбента используют силикагель, молекулярные сита, пористые полимеры и т. д. Более подробно рассмотрим метод газо-жидкостной хроматографии, в котором неподвижной фазой служит нелетучая жидкость, нанесенная в виде пленки на твердый сорбент. Основу метода ГЖХ составляет процесс распределения веществ между двумя фазами: неподвижной (нелетучей жидкостью) и подвижной (газом-носителем), осуществляемый в аналитическом приборе, называемом газовым хроматографом .

4.4 Жидкостная хроматография высокого давления.

Этот совсем недавно введенный метод хроматографии вновь выдвинул на передний край исследований хроматографию на колонках -- самую старую форму аналитического искусства. Основное достижение, благодаря которому стало возможным применение нового метода, -- это техника получения частиц, устойчивых к высокому давлению и имеющих одинаковый диаметр менее 50 мкм. Эти частицы обычно имеют твердый центр, например из стекла.

5. Методы, основанные на испускании излучения.

Методы анализа, основанные на поглощении электромагнитного излучения анализируемыми веществами, представляют обширную группу абсорбционных оптических методов, получивших широкое распространение как на промышленных предприятиях, так и в научно-исследовательских лабораториях. При поглощении света атомы и молекулы поглощающих веществ переходят в новое возбужденное состояние. В зависимости от вида поглощающих частиц и способа трансформирования поглощенной энергии различают.

Атомно-абсорбционный анализ, основанный на поглощении световой энергии атомами анализируемых веществ;

молекулярно-абсорбционный анализ, основанный на поглощении света молекулами анализируемого вещества и сложными ионами в УФ, видимой и ИК областях спектра (колориметрия, спектрофотометрия, фотоколориметрия, ИК-спектроскопия).

Турбидиметрия, нефелометрия - анализ по поглощению и рассеянию световой энергии взвесями анализируемого вещества.

Люминесцентный (флюорометрический) анализ, основанный на измерении излучения, возникающего в результате выделения энергии возбужденными молекулами анализируемого вещества при облучении Уф лучами.

Несмотря на различия, все эти методы иногда объединяют в группу спектрохимических или спектроскопических.

5.1 Атомно-обсорбционная спектрофотометрия.

Пламенная атомная абсорбционная спектрофотометрия, или пламенная абсорбционная спектрофотометрия, -- процесс, во время которого атомы, ионы или ионные комплексы элемента, распыленного до основного состояния в пламени, поглощают свет при длине волны, характерной для данного элемента. Если процесс поглощения протекает в пламени при воспроизводимых условиях, величина поглощения (обратный логарифм пропускаемое™) пропорциональна числу поглощающих атомов. На этом основании можно построить калибровочные кривые, позволяющие оценивать неизвестные величины поглощения в единицах концентрации элемента в растворе. Следует отметить, что, помимо пламенной атомной абсорбционной спектрофотометрии, разрабатывается методика беспламенной атомной абсорбционной спектрофотометрии.

Атомно-абсорбционный анализ (ААА).

ААА основан на способности свободных атомов определяемого элемента селективно поглощать теоретическое резонансное излучение определенной для каждого элемента длины волны. Для этого анализируемую пробу переводят в раствор обычным способом. Для наблюдения поглощения раствор вдувают в виде аэрозоля в пламя горелки, в котором происходит термическая диссоциация и атомизация молекул: МеХМе+Х.

Большинство образующихся при этом атомов находится в нормальном невозбужденном состоянии. Они способны поглощать собственное излучение, проходящее через пламя горелки от внешнего стандартного источника излучения, например, лампы с полым катодом, изготовленным из металла определяемого элемента. В результате этого внешний (оптический) электрон атома переходит на более высокий энергетический уровень, а пропускаемое через пламя излучение ослабляется.

Для определения состава различных веществ по атомным спектрам поглощения созданы специальные приборы - атомно-абсорбционные спектрофотометры, работающие по двух- или однолучевой схеме. В двухлучевом приборе излучение лампы с полым катодом зеркалами разделяется на два луча. Один луч проходит через пламя горелки, в которое распыляется анализируемый раствор, а другой луч обходит это пламя. При помощи прерывателя, вращающегося перед световыми потоками диска с отверстием, световые потоки 1 и 2 поочередно попадают на монохроматор, пропускающий на фотоэлектрический приемник света (фотоумножитель) только аналитическую линию анализируемого элемента. Фотоумножитель и электронная схема попеременно регистрируют аналитическую линию потоков 1 и 2. Прибор измеряет отношение или непосредственно , которое при выбранной схеме измерения зависит только от концентрации элемента в анализируемом растворе.

Однолучевой прибор измеряет усредненное отношение световых потоков прошедших через пламя до (I₀) и после (I) поглощения, т.е. после введения в пламя анализируемого раствора. точность определения однолучевым прибором меньше, чем двухлучевым.

Искомую концентрацию элемента определяют по методу градуировочного графика.

В настоящее время в заводских лабораториях широко применяются абсорбционные спектрофотометры, среди которых зарубежные приборы ААС-1 (Германия), "Сатурн"(США) и др.

Данный метод характеризуется быстротой и простотой выполнения, доступностью и несложностью применяемой аппаратуры. Чувствительность для большинства элементов достигает 5 ?10^-7 %, при этом расходуется от 0,1 до нескольких миллилитров анализируемого раствора. Относительная погрешность метода 1-4 %.

6. Флуоресцентные методы.

Основаны на способности веществ флуоресцировать в УФ- свете , обусловленной либо химической структурой самих органических веществ, либо продуктов их диссоциации, сольволиза, других превращений Способностью флуоресцировать обладают обычно органические соединенияс симметричной структурой молекул, в которых имеются сопряженные связи (нитро, нитрозо, азо, амидные,карбонильные или карбоксильные группы).

6.1 Флуориметрия.

Используется не только для установления подленности, но и определения малых количеств веществ, т.к. интенсивность флуорисценции имеет линеиную зависимость от концентрации. Линеиная зависимость сохраняется при постоянстве квантового выхода и интенсивности возбуждающего света для низких концентраций веществ. При высоких концентрациях эта зависимость нарушается .Идентификацию проводят по цвету излучаемого света специфичного для флуорисцирующих веществ . Спектор даёт широкие полосы излучения( от 100 до 200 нм) .Метод отличается очень высокой чувствительностью. Количественное опредиление выполняют на спекрофлуориметрах. Расчет концентрации проводят с помощью калибровочного графика или шкалы стандартных растворов.

7. Методы основанные на использовании магнитного поля.

7.1 Спектрометрия ядерного магнитного резонанса.

Ямдерный магнимтный резонамнс (ЯМР) -- резонансное поглощение электромагнитной энергии веществом, содержащим ядра с ненулевым спином во внешнем магнитном поле, обусловленное переориентацией магнитных моментов ядер.

Явление магнитного резонанса было открыто в 1945--1946 гг. двумя независимыми группами ученых. Вдохновителями этого были Ф. Блох и Э. Пёрселл ^{[1] [2]}.

Одни и те же ядра атомов в различных окружениях в молекуле показывают различные сигналы ЯМР. Отличие такого сигнала ЯМР от сигнала стандартного вещества позволяет определить так называемый химический сдвиг, который обусловлен химическим строением изучаемого вещества. В методиках ЯМР есть много возможностей определять химическое строение веществ, конформации молекул, эффекты взаимного влияния, внутримолекулярные превращения. Расщепление энергетических уровней ядра с I = 1/2 в магнитном поле. В основе явления ядерного магнитного резонанса лежат магнитные свойства атомных ядер, состоящих из нуклонов с полуцелым спином 1/2, 3/2, 5/2…. Ядра с чётными массовым и зарядовым числами (чётно-чётные ядра) не обладают магнитным моментом, в то время как для всех прочих ядер магнитный момент отличен от нуля.

Таким образом, ядра обладают угловым моментом , связанным с магнитным моментом соотношением.

,

где  -- постоянная Планка,  -- спиновое квантовое число,  -- гиромагнитное отношение.

Угловой момент и магнитный момент ядра квантованы, и собственные значения проекции и углового и магнитного моментов на ось z произвольно выбранной системы координат определяются соотношением:

и ,

где  -- магнитное квантовое число собственного состояния ядра, его значения определяются спиновым квантовым числом ядра

то есть ядро может находиться в состояниях. Так, у протона (или другого ядра с I = 1/2 -- ¹³C, ¹⁹F, ³¹P и т. п.) может находиться только в двух состояниях

,

такое ядро можно представить как магнитный диполь, z-компонента которого может быть ориентирована параллельно либо антипараллельно положительному направлению оси z произвольной системы координат. Следует отметить, что в отсутствие внешнего магнитного поля все состояния с различными имеют одинаковую энергию, то есть являются вырожденными. Вырождение снимается во внешнем магнитном поле, при этом расщепление относительно вырожденного состояния пропорционально величине внешнего магнитного поля и магнитного момента состояния и для ядра со спиновым квантовым числом I во внешнем магнитном поле появляется система из 2I+1 энергетических уровней

,

то есть ядерный магнитный резонанс имеет ту же природу, что и эффект Зеемана расщепления электронных уровней в магнитном поле.

В простейшем случае для ядра со спином с I = 1/2 -- например, для протона, расщепление

и разность энергии спиновых состояний:

7.2 Масс спектроскопия.

Масс-спектрометрия (масс-спектроскопия, масс-спектрография, масс-спектральный анализ, масс-спектрометрический анализ) -- метод исследования вещества путём определения отношения массы к заряду (качества) и количества заряженных частиц, образующихся при том или ином процессе воздействия на вещество (см.: ионизация). История масс-спектрометрии ведётся с основополагающих опытов Джона Томсона в начале XX века. Окончание «-метрия» термин получил после повсеместного перехода от детектирования заряженных частиц при помощи фотопластинок к электрическим измерениям ионных токов.

Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия непосредственно детектирует сами частицы вещества. Масс-спектрометрия в широком смысле -- это наука получения и интерпретации масс-спектров, которые в свою очередь получаются при помощи масс-спектрометров.^[1]

Масс-спектрометр -- это вакуумный прибор, использующий физические законы движения заряженных частиц в магнитных и электрических полях, и необходимый для получения масс-спектра.

Масс-спектр, как и любой спектр, в узком смысле -- это зависимость интенсивности ионного тока (количества) от отношения массы к заряду (качества). Ввиду квантования массы и заряда типичный масс-спектр является дискретным. Обычно (в рутинных анализах) так оно и есть, но не всегда. Природа анализируемого вещества, особенности метода ионизации и вторичные процессы в масс-спектрометре могут оставлять свой след в масс-спектре (см. метастабильные ионы, градиент ускоряющего напряжения по местам образования ионов, неупругое рассеивание). Так ионы с одинаковыми отношениями массы к заряду могут оказаться в разных частях спектра и даже сделать часть его непрерывным. Поэтому масс-спектр в широком смысле -- это нечто большее, несущее специфическую информацию, и делающее процесс его интерпретации более сложным и увлекательным.

Ионы бывают однозарядные и многозарядные, причём как органические, так и неорганические. Большинство небольших молекул при ионизации приобретает только один положительный или отрицательный заряд. Атомы способны приобретать более одного положительного заряда и только один отрицательный. Белки, нуклеиновые кислоты и другие полимеры способны приобретать множественные положительные и отрицательные заряды.

Атомы химических элементов имеют специфическую массу. Таким образом, точное определение массы анализируемой молекулы, позволяет определить её элементный состав (см.: элементный анализ). Масс-спектрометрия также позволяет получить важную информацию об изотопном составе анализируемых молекул (см.: изотопный анализ).

В органических веществах молекулы представляют собой определённые структуры, образованные атомами. Природа и человек создали поистине неисчислимое многообразие органических соединений. Современные масс-спектрометры способны фрагментировать детектируемые ионы и определять массу полученных фрагментов. Таким образом, можно получать данные о структуре вещества.

Глава 2: Теория методов по спектрометрии и фотоколореметрии в видимой области спектра.

Наиболее широко из методов молекулярно-абсорбционного анализа применяют колориметрию, фотоколориметрию и спектрофотометрию, объединяемые общим названием фотометрия.

Фотометрия основана на пропорциональной зависимости между концентрацией однородных систем (например, растворов) и их светопоглощением в видимой и УФ областях спектра. Различия в фотометрических методах видны из табл. 1

Фотометрические методы подразделяют на прямые и косвенные (фотометрическое титрование). В прямых определяемый ион переводят в светопоглощающее (как правило, комплексное) соединение, а затем по измеренной величине светопоглощения находят содержание иона в растворе. Как косвенный метод фотометрию используют для индикации момента эквивалентности при титровании, когда в этот момент титруемый раствор меняет светопоглощение за счет разрушения или образования цветных комплексов.

Таблица 1.

Название	Область спектра	Монохроматор	Способ регистрации светопоглощения
Колори- метрия	Видимая	Без монохроматора или с ним (т.е. со светофильтром)	Визуальный
Фотоколо-риметрия	Видимая	Светофильтры	Фотоэлектрический
Спектро-фотометрия	Видимая, УФ	Дифракционная решетка, призма	То же

Из ФХМА фотометрические методы наиболее распространены вследствие сравнительной простоты оборудования, высокой чувствительности и возможности использования для определения почти всех элементов как при больших концентрациях (20-30 %), так и микроколичеств (10^-3 -10^-4 %).

Общая схема фотометрических исследований такова: немонохроматизированное или монохроматизированное (т.е. с одной длиной волны) излучение направляют на пробу, помещенную в кювету (т.е. стаканчик из кварцевого стекла с параллельными стенками и строго определенным расстоянием между ними (l)) определенной толщины, в которой происходит поглощение падающего света.

Интенсивность света, прошедшего через окрашенный раствор(1), отличается от интенсивности света, прошедшего через растворитель I₀ на величину поглощения света окрашенным раствором (рис. 2.5.1). Потери при отражении и рассеянии будут практически одни и те же при прохождении обоих пучков, так как форма и материал обеих кювет одинаковы, и они содержат один и тот же растворитель. Величину называют пропусканием (коэффициентом пропускания) или прозрачностью раствора. Взятый с обратным знаком логарифм T называют светопоглощением, поглощением или абсорбционностью (А).

Обозначение А соответствует первой букве в названии этой величины (ранее которую называли оптической плотностью и обозначали D

Уменьшение интенсивности света при прохождении через окрашенный раствор подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера:

Связь интенсивности светопоглощения () с концентрацией () определяемого компонента называют также основным законом фотометрии.

Молярный коэффициент поглощения - светопоглощение при с=1 моль/л и l=1 см зависит от падающего света, природы растворенного вещества, температуры раствора и не зависит от объема раствора, толщины поглощающего слоя l, концентрации вещества c и интенсивности освещения. Поэтому является мерой поглощательной способности вещества при данной длине волны и характеристикой чувствительности фотометрического анализа - чем больше, тем больше чувствительность.

Если раствор подчиняется основному закону фотометрии, что является необходимым условием для ряда фотометрических методов, то зависимость - линейная, характеризующаяся прямой, исходящей из начала координат, если нет, то прямолинейность нарушается. Поэтому перед фотометрическим определением выявляют пределы концентраций, для которых применим закон Бугера-Ламберта-Бера. В соответствии с этим выбирают и фотометрический метод. Например, выполнение этого закона не обязательно для некоторых вариантов колориметрического метода.

Для обеспечения максимальной чувствительности метода в фотометрии строят так называемые "спектры поглощения вещества", т.е. графики зависимости () при 1 моль/л и =10 мм. Спектр поглощения каждого вещества графически представляет собой сложную кривую .Каждая полоса поглощения (пик на кривой).

Имеет в максимуме определенное значение. Измерения следует проводить в участках спектра, отвечающих максимальному значению величины. Измерения при максимальном значении достигается монохроматизацией падающего светового потока, т.е. выделением из сплошного спектра узкого участка. Чем больше монохроматизация, тем точнее можно измерить и, следовательно, тем точнее можно определить концентрацию вещества. Выбор в качестве монохроматора светофильтра основан на следующей зависимости спектров пропускания и поглощения: минимум спектра пропускания (максимум спектра поглощения) определяемого вещества должен совпадать с максимумом пропускания (минимумом поглощения) светофильтра .

Если спектральная характеристика анализируемого раствора неизвестна, то светофильтр выбирают по дополнительному цвету к окраске раствора (табл. 2). Более совершенна монохро-матизация с помощью призм и дифракционных решеток. В фотометрии могут быть использованы все способы определения концентрации, изложенные в главе 2.1. В визуальной колориметрии в основном используют три метода: стандартных серий, колориметрического титрования и уравнивания. При этом два первых метода не требуют соблюдения основного закона фотометрии.

Таблица 2.

Анализируемый	раствор	Светофильтр
Цвет	Полоса поглощения, нм	Цвет
Красный	625-750	Зелено-синий
Оранжевый	590-625	Сине-зеленый
Желтый	574-590	Синий
Желто-зеленый	500-575	Фиолетовый
Зеленый	500-560	Пурпурный
Зелено-синий	490-500	Красный
Сине-зеленый	480-490	Оранжевый
Синий	450-480	Желтый
Фиолетовый	400-450	Желто-синий

В методе стандартных серий анализируемый раствор в слое определенной толщины сравнивают с набором стандартных растворов такой же толщины слоя. Сравнивают интенсивность окраски анализируемого раствора с эталонной серией. Концентрация С_х принимается равной концентрации эталонного раствора, одинакового с ним по интенсивности окраски.

В методе уравнивания (сравнения с эталоном) добиваются на колориметре погружения (Дюбоска) равенства оптических плотностей анализируемого и стандартного растворов изменением толщины поглощающего слоя, через который проходит световой поток, т.е. добиваются или , откуда . В методе колориметрического титрования параллельно титруют равные объемы окрашенного анализируемого раствора и дистиллированной воды, добавляя из двух бюреток равные по объему порции дистиллированной воды к анализируемому раствору и окрашенного стандартного раствора к воде. Одинаковая интенсивность окраски достигается при равных количествах определяемого вещества в обоих объемах. Зная исходный объем исследуемого раствора V_x и объем стандартного раствора, V_ст добавленного до уравнивания окраски, а также титр стандартного раствора Т_ст, находят Т_х:

В фотоэлектрометрии и спектрофотометрии определение неизвестной концентрации проводят методами добавки или стандартных серий.

Фотоколориметрический метод основан на фотоэлектрическом измерении интенсивности окраски растворов. Общий принцип всех систем фотоэлектроколориметров заключается в том, что световой поток, прошедший через кювету с окрашенным раствором, попадает на фотоэлемент, преобразующий световую энергию в электрическую, измеряемую гальванометром. фотоэлектроколориметры в зависимости от числа используемых при измерении фотоэлементов делят на две группы: 1) с одним фотоэлементом (однолучевые) - КФК-2 и др.; 2) с двумя фотоэлементами (двухлучевые) - ФЭК-М, ФЭК-56М, ФЭК-Н-57, ФЭК-60 и др.

Фотоэлектроколориметрирование уменьшает трудоемкость и повышает точность и объективность анализа.

Спектрофотометрический метод основан на измерении с помощью спектрофотометра светопоглощения раствора в монохроматическом потоке света, т.е. потоке света с определенной длиной волны. Светопоглощение в спектрофотометре также измеряется фотоэлементами. Однако в нем имеется призма или дифракционная решетка и щель, позволяющие разложить световой поток в спектр, отобрать и направить на кювету с анализируемым раствором свет с необходимой длиной волны или световой пучок с узким участком спектра, который преимущественно поглощает анализируемое соединение раствора. Измерение светопоглощения при длине волны, соответствующей максимуму светопоглощения, увеличивает чувствительность и облегчает определение одного окрашенного соединения в присутствии другого. Для анализа используют спектрофотометры типа СФ-4, СФ-4А, СФ-5, СФ-10, СФД-2, ИКС-12, "Specol"(Германия) и др.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ, метод исследования и анализа в-в, основанный на измерении спектров поглощения в оптич. области электромагн. излучения. Иногда под спектрофотометрией понимают раздел физики, объединяющий спектроскопию (как науку о спектрах электромагн. излучения), фотометрию и спектрометрию [как теорию и практику измерения соотв. интенсивности и длины волны (или частоты) электромагн. излучения]; на практике спектрофотометрию часто отождествляют с оптич. спектроскопией. По типам изучаемых систем спектрофотометрию обычно делят на молекулярную и атомную. Различают спектрофотометрию в ИК, видимой и УФ областях спектра (см. Инфракрасная спектроскопия, Ультрафиолетовая спектроскопия).

Применение спектрофотометрии в УФ и видимой областях спектра основано на поглощении электромагн. излучения соединениями, содержащими хромофорные (напр., С = С, С=С, С=О) и ауксохромные (ОСН₃, ОН, ?H₂ и др.) группы (см. Цветность органических соединений}. Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением электронов ?-, ?-и n-орбиталей осн. состояния и переходами молекул в возбужденные состояния: ? : ?*, n : ?*, ? : ?* и n : ?* (переходы перечислены в порядке уменьшения энергии, необходимой для их осуществления; см. также Молекулярные спектры). Переходы ? : ?* находятся в далекой УФ области, напр. у парафинов при ~ 120 нм. Переходы n : ?* наблюдаются в УФ области; напр., орг. соед., содержащие n-электроны, локализованные на орбиталях атомов О, ?, Hal, S, имеют Полосы поглощения при длине волны ок. 200 нм. Линии, соответствующие переходам ? : ?*, напр., в спектрах гетероциклич. соединений проявляются в области ок. 250-300 нм и имеют большую интенсивность. Полосы поглощения, соответствующие переходам n : ?*, находятся в ближней УФ и видимой областях спектра; они характерны для соед., в молекулах к-рых имеются такие хромофорные группы, как С = О, C = S, N = N. Так, насыщ. альдегиды и кетоны имеют максимумы поглощения при длине волны ок. 285 нм. Переходы типа n : ?* часто оказываются запрещенными, и соответствующие полосы поглощения обладают очень малой интенсивностью.

Переходы типа ? : ?* могут сопровождаться переходом электрона с орбитали, локализованной гл. обр. на одной группе (напр., С=С), на орбиталь, локализованную на др. группе (напр., С=О). Такие переходы сопровождаются переносом электрона с одного атома на другой и соответствующие спектры наз. спектрами с переносом заряда. Последние характерны для разл. комплексов (напр., арома-тич. соединений с галогенами), интенсивно поглощающих в видимой и УФ областях.

Для ионов переходных металлов и их комплексных соед. характерны переходы с участием d-электронов, а для РЗЭ и актиноидов-переходы с участием f-электронов. Соответствующие соед. в р-ре бывают интенсивно окрашенными, причем окраска (спектр поглощения) зависит от степени окисления катиона и устойчивости комплексного соединения. Поэтому спектрофотометрию широко используют при исследовании и анализе комплексных соед. металлов.

Изолированные, не взаимодействующие между собой хромофоры в молекуле поглощают независимо. В случае к.-л. взаимод. между ними аддитивность спектров нарушается. По отклонениям от аддитивности можно судить о характере и величине взаимодействия. Поскольку положение полос в спектре определяется как разность энергий основного и возбужденного состояний молекул, можно определять структуру энергетич. уровней молекул или по известной схеме энергетич. уровней определять положение полос поглощения. Любому электронному состоянию молекул соответствует набор разл. колебат. уровней энергии. Колебат. структура полосы, соответствующей переходу между электронными уровнями, может отчетливо проявляться не только в спектрах газов, но и в спектрах нек-рых р-ров, что дает возможность получать дополнит. информацию о взаимод. молекул. Спектрофотометрич. исследование спектров молекул в видимой и УФ областях позволяет установить вид электронных переходов и структуру молекул. При этом часто исследуют влияние разл. типов замещения в молекулах, изменения р-рителей, т-ры и др. физ.-хим. факторов.

В ИК области проявляются переходы между колебат. и вращат. уровнями (см. Колебательные спектры, Вращательные спектры). Среди частот колебаний молекул выделяют т. наз. характеристические, к-рые практически постоянны по величине и всегда проявляются в спектрах хим. соед., содержащих определенные функц. группы (вследствие чего эти частоты иногда называют групповыми; см. табл. на форзаце 2-го тома). Теория колебаний сложных молекул позволяет расчетным путем предсказать колебат. спектр соединений, т. е. определить частоты и интенсивности полос поглощения.

Колебат. спектры молекул чувствительны не только к изменению состава и структуры (т.е. симметрии) молекул, но и к изменению разл. физ. и хим. факторов, напр. изменению агрегатного состояния в-ва, т-ры, природы р-рителя, концентрации исследуемого в-ва в р-ре, разл. взаимод. между молекулами в-ва (ассоциация, полимеризация, образование водородной связи, комплексных соед., адсорбция и т. п.). Поэтому ИК спектры широко используют для исследования, качеств. и количеств. анализа разнообразных в-в.

В ближней ИК области (10000-4000 см^-1, или 1-2,5 мкм), где расположены обертоны и составные частоты осн. колебаний молекул, полосы поглощения имеют интенсивность в 10²-10³ раз меньше, чем в средней ИК области (4000-200 см^-1). Это упрощает подготовку образцов, т.к. толщина поглощающего слоя м. б. достаточно большой (до неск. мм и более). Эксперим. техника для работы в этой области относительно проста. Однако чувствительность и селективность определения отдельных соед. невелики. Тем не менее высокое отношение сигнал:шум (до 10⁵) создает хорошие условия для количеств. анализа при содержании определяемого соед. ок. 1% и выше. Подобные анализы выполняются за 1 мин. В дальней ИК области (200-5 см^-1) могут наблюдаться чисто вращат переходы.

Интенсивность полосы поглощения молекулы определяется вероятностью соответствующего электронного (или колебательного) перехода. Для характеристики интенсивности полосы служит молярный коэф. поглощения ? (см. Абсорбционная спектроскопия), определяемый, согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, как ? = A/Cl, где А = = -- lgT= -- lg(I/I₀), T-пропускание, I₀ и I-интенсивности соотв. падающего и прошедшего через в-во излучения, С-молярная концентрация в-ва, поглощающего излучение, l-толщина поглощающего слоя (кюветы), в см. Обычно ?<10⁵, в ИК области ?<2·10³ (л/моль·см). Закон Бугера-Ламберта-Бера лежит в основе количеств. анализа по спектрам поглощения.

Для измерения спектров используют спектральные приборы-спектрофотометры, осн. части к-рого: источник излучения, диспергирующий элемент, кювета с исследуемым в-вом, регистрирующее устройство. В качестве источников излучения применяют дейтериевую (или водородную) лампу (в УФ области) и вольфрамовую лампу накаливания или галогенную лампу (в видимой и ближней ИК областях). Приемниками излучения служат фотоэлектронные умножители (ФЭУ) и фотоэлементы (фоторезисторы на основе PbS). Диспергирующими элементами прибора являются призмен-ный монохроматор или монохроматор с дифракц. решетками. Спектр получают в графич. форме, а в приборах со встроенной мини-ЭВМ-в графической и цифровой формах. Графически спектр регистрируют в координатах: длина волны (нм) и(или) волновое число (см^-1)-пропускание (%) и(или) оптич. плотность. Осн. характеристики спектрофотометров: точность определения длины волны излучения и величины пропускания, разрешающая способность и светосила, время сканирования спектра. Мини-ЭВМ (или микропроцессоры) осуществляют автоматизир. управление прибором и разл. мат. обработку получаемых эксперим. данных: статистич. обработку результатов измерений, логарифмирование величины пропускания, многократное дифференцирование спектра, интегрирование спектра по разл. программам, разделение перекрывающихся полос, расчет концентраций отдельных компонентов и т. п. Спектрофотометры обычно снабжаются набором приставок для получения спектров отражения, работы с образцами при низких и высоких т-рах, для измерения характеристик источников и приемников излучения и т.п.

Для исследования спектров в ИК области используют обычно спектрофотометры, работающие в интервале от 1,0 до 50 мкм (от 10000 до 200 см^-1). Осн. источниками излучения в них являются стержень из кароида кремния (глобар), штифт из смеси оксидов циркония, тория и иттрия (штифт Нернста) и спираль из нихрома. Приемниками излучения служат термопары (термоэлементы), болометры, разл. модели оптико-акустич. приборов и пироэлектрич. детекторы, напр. на основе дейтерированного триглицинсульфата (ТГС). В спектрофотометрах, сконструированных по "клас-сич." схеме, в качестве диспергирующих элементов применяют призменный монохроматор или монохроматор с дифракц. решетками. С кон. 60-х гг. 20 в. выпускаются ИК фурье-спектрофотометры (см. Фурье-спектроскопия), к-рые обладают уникальными характеристиками: разрешающая способность-до 0,001 см^-1, точность определения волнового числа v-до 10^-4 см^-1 (относит. точность b?v/v ! ! 10 ^-8), время сканирования спектра может достигать 1 с, отношение сигнал:шум превышает 10⁵. Эти приборы позволяют изучать образцы массой менее 1 нг. К ним также имеются разл. приставки для получения спектров отражения, исследования газов при малых или высоких давлениях, разных т-рах и т. п. Встроенная в прибор мини-ЭВМ управляет прибором, выполняет фурье-преобразования, осуществляет накопление спектров, проводит разл. обработку получаемой информации. ИК фурье-спектрофотометры могут содержать программы по автоматич. идентификации образца неизвестного состава и определению содержания примесей, напр. в полупроводниковых материалах.

Спектрофотометрию широко применяют для исследования орг. и неорг. в-в, для качеств. и количеств. анализа разл. объектов (в частности, природных), для контроля технол. процессов. Так, разработаны спектрофотометрич. методы определения в р-рах Сu и Rb (пределы обнаружения 3·10^-6% по массе), Со (2,5 · 10 ^-5 % по массе), Hf и Zr (0,5 мкг/мл); V (0,2 мкг/мл), гликозидов (0,05 мкг), белков (0,2 мкг/мл), тимола (1-2 мкг/мл); в атмосфере можно определить СО, оксиды азота, этилен, О₃, NH₃, CH₄ с пределами обнаружения ~ 10^-7% по массе.

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (ФА), совокупность методов мол.-абсорбционного спектрального анализа, основанных на избират. поглощении электромагн. излучения в видимой, ИК и УФ областях молекулами определяемого компонента или его соед. с подходящим реагентом. Концентрацию определяемого компонента устанавливают по закону Бугера -Ламберта - Бера (см. Абсорбционная спектроскопия). ФА включает визуальную фотометрию (см. Колориметрический анализ), спектрофотометрию и фотоколориметрию. Последняя отличается от спектрофотометрии тем, что поглощение света измеряют гл. обр. в видимой области спектра, реже - в ближних УФ и ИК областях (т. е. в интервале длин волн от ~ 315 до ~ 980 нм), а также тем, что для выделения нужного участка спектра (шириной 10-100 нм) используют не моно-хроматоры, а узкополосные светофильтры.

Приборами для фотоколориметрии служат фотоэлектроко-лориметры (ФЭК), характеризующиеся простотой оптич. и электрич. схем. Большинство ФЭК имеет набор из 10-15 светофильтров и представляет собой двухлучевые приборы, в к-рых пучок света от источника излучения (лампа накаливания, редко ртутная лампа) проходит через светофильтр и делитель светового потока (обычно призму), к-рый делит пучок на два, направляемые через кюветы с исследуемым р-ром и с р-ром сравнения. После кювет параллельные световые пучки проходят через калиброванные ослабители (диафрагмы), предназначенные для уравнивания интенсивно-стей световых потоков, и попадают на два приемника излучения (фотоэлементы), подключенные по дифференциальной схеме к нуль-индикатору (гальванометр, индикаторная лампа). Недостаток приборов - отсутствие монохроматора, что приводит к потере селективности измерений; достоинства -простота конструкции и высокая чувствительность благодаря большой светосиле. Измеряемый диапазон оптич. плотности составляет приблизительно 0,05-3,0, что позволяет определять мн. элементы и их соед. в широком интервале содержаний - от ~ 10^-6 до 50% по массе. Для дополнит. повышения чувствительности и селективности определений существенное значение имеют подбор реагентов, образующих интенсивно окрашенные комплексные соед. с определяемыми в-вами, выбор состава р-ров и условий измерений. Погрешности определения составляют ок. 5%.

При т. наз. дифференциальном ФА оптич. плотность анализируемого р-ра измеряют относительно оптич. плотности (к-рая не должна быть меньше 0,43) р-ра сравнения. Последний содержит определяемый компонент в концентрации, близкой к концентрации этого компонента в анализируемом р-ре. Это позволяет определять сравнительно большие концентрации в-в с погрешностью 0,2-1% (в случае спектрофо-тометрии). При фотометрич. титровании получают зависимость оптич. плотности титруемого р-ра от объема прибавляемого титранта (кривую титрования). По излому на этой кривой определяют конечную точку титрования и, следовательно, концентрацию исследуемого компонента в р-ре (см. Титриметрия}.

Иногда ФА понимают более широко, как совокупность методов качеств. и количеств. анализа по интенсивности ИК, видимого и УФ излучения, включающую атомно-абсорбцион-ный анализ, фотометрию пламени, турбидиметрию, нефелометрию, люминесцентный анализ, спектроскопию отражения и мол .-абсорбционный спектральный анализ.

Глава 3: Применение спектрометрических и фотоколореметрических методов в анализе лекарственных средств

В 3 главе рассмотрим применение спектрометрических и фотоколореметрических методов в анализе лекарственных средств таких как Левомицетин, Новокаин, Фурацилин, Метилтестостерон, Преднидазол, Прогестерон.

Левомицетин

В медицинской практике нашел широкое применение антибиотик хлорам-феникол или его синтетический аналог левомицетин, -- ароматическое соединение, производное нитрофенилалкиламина:

Как было установлено, левомицетин представляет собой D-(-)-mpeo-\-n-нитрофенил-2-дихлорацетиламино-пропандиол-1,3.

Левомицетин относится к D-ряду как и конфигурационный стандарт D-гли-цериновый альдегид:

Определение подлинности. Для определения подлинности левомицетина проводят реакцию щелочного гидролиза при нагревании, наблюдая образование соединения кирпично-красного цвета. Присутствие алифатической аминогруппы и спиртового гидроксида объясняет возможность образования окрашенных комплексных соединений с солями тяжелых металлов.

Находящаяся в молекуле левомицетина нитрогруппа может быть восстановлена цинковой пылью в кислой среде до аминогруппы. Образующееся ами-носоединение диазотируют и превращают в азокраситель в результате реакции азосочетания, например с р-нафтолом:

Для определения аминопроизводного левомицетина можно использовать любую реакцию, применяемую для амидов сульфаниловой кислоты. Так, при реакции конденсации с альдегидами образуется продукт, окрашенный в желто-оранжевый цвет (основание Шиффа):

Подлинность левомицетина может быть определена физико-химическими методами: методом инфракрасной спектрометрии или хроматографически.

Определение примесей. Хлорамфеникол, используемый для приготовления инъекционных форм, должен быть протестирован на содержание бактериальных эндотоксинов.

Количественное определение. Для количественного определения левомицетина используют спектрофотометрию в ультрафиолетовой области (спиртовые растворы, Х_тах = 272 нм).

Возможно применение броматометрии (бромирование ароматического ядра), фотоколориметрии (образование азокрасителя после восстановления нитро-группы). Кроме того, после восстановления нитрогруппы может быть применен метод нитритометрии.

Для эфиров левомицетина возможно фотоколориметрическое определение в виде окрашенных гидроксаматов железа.

Новокаин

Являясь сложным эфиром новокаин при взаимодействии с гидроксиламином в щелочной среде образует гидроксамовые кислоты:

Выполняя гидроксамовую реакцию следует строго соблюдать требования методики т.к. она дает положительные результаты только при определенном значении рН

Фурацилин

Подлиность производных 5-нитрофурана устанавливают по цветной реакции с водным раствором гидроксида натрия.Структура образующихся продуктов находится в зависимости от условий проведения реакции, осбености химического строения 5- нитрофурана,температуры,растворителя и концентрации реактива. Нитрофуран при использовании растворов разбавленных щелочей образует ацисоль , окрашенную в оранжево-красный цвет:

При нагревании нитрофурала в растворах гидроксидов щелочных металлов происходит разрыв фуранового цикла и образуется карбонат натрия , гидразин и аммеак.Последний обнаруживают по изменению окраски влажной лакмусовой бумаги:



Прогестерон

Реакцию осаждения 2,4-денитрофенилгидразона используют для количественного определения прогестерона и для испытания его подлиности

Метилтестостерон

Тестостерона пропионат и метилтестостерон , содержащие в положении 3 кетонную группировку , при действии гидроксиламином образуют оксимы с температурой плавления соответственно 166-171 и 210-216 градусов по цельсию. Оксим метилтестостерона образуется по схеме:

Метандиенон идентифицируют по образованию гидразона (окрашенного в оранжево-красный цвет) при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразином:

Преднидазол

При нагревании на водяной бане смеси спиртового раствора кортикостироида и реактива Фелинга выпадает красно-оранжевый осадок. Реакция обусловлена восстановленными свойствами а- кетольной группировки которая легко окисляется до карбоксильной:

В присутствии реактива Фелинга:

Восстанавливающие свойства а-кетольной группы лежат в основе реакции «серебряного зеркала», которое образую ряд кортикостероидов (кортизона ацетат, гидрокортизон, преднизолон):

Кортикостероиды, содержащие а-кетольную группу (кортизон и его аналоги), дают цветную реакцию, основанную! окислении 0,5%-ным раствором хлорида трифенилтетразолия в этаноле в присутствии 10%-ного раствора гидроксидая траметиламмония. Появляется красная окраска, обусловленная образованием формазана:

Заключение

В последнее время методы спектрофотометрии и фотоколориметрии нашли широкое применение.

Физико - химические методы основаны на использовании зависимости физических свойств и химического состава веществ. В большинстве случаев физико - химические методы отличаются быстротой выполнения, избирательностью, высокой чувствительностью, возможностью унификации и автоматизации. Поэтому данная группа методов приобретает все большое значение для объективной оценки качества ЛС, в том числе для испытания на подлинность, испытания на чистоту и для количественного определения.

Литература

1. Л.С. Гузей, В.Н. Кузнецов. “Новый справочник по химии”. Москва. 1998 г. С-261.

2. Б.Н. Степаненко. “Органическая химия”. Москва. 1980г. С-253. Методическое пособие (фотометрический анализ).

3. Э.Т. Оганесян. “Руководство по химии поступающим в вузы”. Москва. 1992 г. С-447.

4. Фармацевтическая химия. Глущенко Н.Н., Плетенева Т.В., Попков В.А

5. Фармацевтическая химия. В 2-х частях. Беликов В.Г