1

8

От 51 до 100 включ.

2

16

От 100 до 300 включ.

3

30

7.4 По показателям группы 1 контролируют всю выборку в соответствии с таблицей 4.

Таблица5 в штуках

Выборка	Объем выборки	Группа 1
		Приемочное число	Браковочное число
1	8	1	2
2	16	1	4
3	30	2	6

7.5 По показателям группы 2 контролируют образцы, взятые из выборки по 6.4, в соответствии с таблицей 5.

Таблица 6 в штуках

Выборка	Объем выборки	Группа 1
		Приемочное число	Браковочное число
1	4	0	2
2	8	1	3
3	15	2	5

6.6 Решение о партии

6.6.1 Партию принимают, если количество дефектных матриц в выборке по каждому показателю меньше или равно приемочному числу, указанному в таблицах 4 и 5.

6.6.2 Если в выборке количество матриц, не соответствующих требованиям настоящих технических условий, больше или равно браковочному числу, то проводят повторный контроль на удвоенном количестве матриц, взятых от той же партии.

Результаты контроля второй выборки являются окончательными и распространяются на всю партию.

8 Методы контроля

8.1 Внешний вид матриц контролируют визуально, согласно образцу эталону на каждый тип матриц, утвержденному в установленном порядке.

8.2 Внешний вид матриц под микроскопом так же оценивают визуально, согласно теоретическому изображению - эталону, гексагональной упаковки микросфер (Приложение А). Используют световой микроскоп с тринокулярной насадкой и объективом х10 МПБ 3М или другое аналогичное устройство.

8.2.1 Просматривают последовательно всю поверхность матрицы.

8.3 Плотность упаковки оценивают используя световой микроскоп с тринокулярной насадкой и объективом х10 МПБ 3М или другое аналогичное устройство, укомплектованное так же камерой Moticam 1000 или другой аналогичной с разрешением не ниже 1,3 млн. пикселей.

8.3.1 Покровное стекло с матрицей помещают под объектив микроскопа, добиваются того, чтобы изображение сфер было не в фокусе (сферы темные или имеют цвет, отличный (темнее) цвета фона).

8.3.2 С помощью компьютерной программы МекосЦ или другой аналогичной программы захвата изображения делают 10 фотографий в произвольных областях матрицы.

8.3.3 С помощью компьютерной программы ImageJ Launcher или другой аналогичной рассчитывают площадь поверхности, занятую микросферами на каждом из 10 изображений одного образца. За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение 10 измерений.

8.4 Биологическую совместимость клеток и матрицы определяют, оценивая время жизни макрофагов J774 на поверхности матрицы.

8.4.1 Макрофаги J774 выращивают на среде DMEM с 10% сывороткой эмбрионов коров (СЭК) в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37^оС.

8.4.2 После чего макрофаги рассеивают в 24-х луночные плашки, на дне ячеек которых располагают требуемое для анализа данной партии образцы матриц. Клетки культивируют в инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37^оС в течении 24 дней.

8.4.3 Количество рассеянных клеток на одну лунку рассчитывается с помощью камеры Горяева (приложение Б). В каждую лунку с покровным стеклом рассеивают по 100000 клеток.

8.4.4 По истечению 24 дней матрицы с клетками изымают из инкубатора.

8.4.5 Стёкла дважды промывают буферным раствором от не прикрепившихся клеток, который содержит 88 г/л NaCl, 30,26 г/л Na₂HPO₄·2H₂O и 2,35 г/л NaH₂PO₄·H₂O. Перед использованием раствор разбавляют в 10 раз и доводят до рабочего pH=7,4.

8.4.6 Затем матрицы помещают в раствор фиксатора (2%-ый раствор глутарового альдегида в буферном растворе PBS (фосфатного буфера)). Матрицы хранят в этом растворе в течение суток при температуре 4^єС для окраски клеток перед микроскопией.

8.4.7 Микроскопию матриц проводят используя конфокальный микроскоп Nikon Eclipse E800 (объектив х10) или другое аналогичное устройство.

8.4.8 Покровное стекло с матрицей помещают под объектив микроскопа.

8.4.9 С помощью компьютерной программы МекосЦ или другой аналогичной программы захвата изображения делают 10 фотографий в произвольных областях матрицы.

8.4.10 С помощью компьютерной программы ImageJ Launcher или другой аналогичной рассчитывают площадь поверхности, занятую клетками на каждом из 10 изображений одного образца. За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение 10 измерений. Если она составляет не менее 20% от площади матрицы, то матрица считается биологически совместимой с клетками.

8.5 Пролиферативную активность клеток на матрицах определяют, оценивая площадь, занимаемую макрофагами J774 на поверхности матрицы.

8.5.1 Макрофаги J774 выращивают на среде DMEM с 10% сывороткой эмбрионов коров (СЭК) в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37^оС.

8.5.2 После чего макрофаги рассеивают в 24-х луночные плашки, на дне ячеек которых располагают требуемое для анализа данной партии образцы матриц. Клетки культивируют в инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37^оС в течении 24 часов.

8.5.3 Количество рассеянных клеток на одну лунку рассчитывается с помощью камеры Горяева (приложение Б). В каждую лунку с покровным стеклом рассеивают по 100000 клеток.

8.5.4 По истечению 24 дней матрицы с клетками изымают из инкубатора.

8.5.5 Стёкла дважды промывают буферным раствором от не прикрепившихся клеток, который содержит 88 г/л NaCl, 30,26 г/л Na₂HPO₄·2H₂O и 2,35 г/л NaH₂PO₄·H₂O. Перед использованием раствор разбавляют в 10 раз и доводят до рабочего pH=7,4.

8.5.6 Затем матрицы помещают в раствор фиксатора (2%-ый раствор глутарового альдегида в буферном растворе PBS (фосфатного буфера)). Матрицы хранят в этом растворе в течение суток при температуре 4^єС для окраски клеток перед микроскопией.

8.5.7 Микроскопию матриц проводят используя конфокальный микроскоп Nikon Eclipse E800 (объектив х10) или другое аналогичное устройство.

8.5.8 Покровное стекло с матрицей помещают под объектив микроскопа.

8.5.9 С помощью компьютерной программы МекосЦ или другой аналогичной программы захвата изображения делают 10 фотографий в произвольных областях матрицы.

8.5.10 С помощью компьютерной программы ImageJ Launcher или другой аналогичной рассчитывают площадь поверхности, занятую клетками на каждом из 10 изображений одного образца. За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение 10 измерений.

9 Транспортировка и хранение

9.1 Матрицы транспортируются всеми видами транспорта в соответствии с правилами перевозки грузов, действующими на каждом виде транспорта.

9.2 Матрицы хранят в отапливаемом помещении с температурой 24єС и относительной влажностью не более 60% в пыле - влагозащитных пластиковых контейнерах, на расстоянии не менее 2 метров от нагревательных приборов, защищенной от прямого воздействия солнечных лучей, при отсутствии в помещении кислотной, щелочной и других агрессивных сред.

10 Гарантии изготовителя

10.1 Изготовитель гарантирует соответствие матриц требованиям настоящих технических условий при соблюдении условий упаковки, транспортировки и хранения.

10.2 Гарантийный срок хранения устанавливается 3 год со дня изготовления.

Выводы

1. Изучена законодательная нормативная и научно-техническая литература по монослойным матрицам для тканевой инженерии.

2. Сформулированы и обоснованы технические параметры качества для полимерных матриц.

3. Выбраны и описаны методы контроля предлагаемых параметров качества полимерных матриц.

4. Разработан проект технических условий на монослойные полимерные матрицы для тканевой инженерии.

5. Проект технических условий представлен на рассмотрение и утверждение в организацию-производитель матриц (НИИФХМ).

Список литературы

1. Kelvin G.M. Brockbank, Inc., Tissue Engineering Constructs and Commercialization 2005.

2. Tissue engineering from MedBioTech.info (http://medlog.rusmedserv.com)

3. Tissue Engineering, Cell Therapy and Transplantation: Products, Technologies & Market Opportunities. 2005, MedMarket Diligense, LLC

4. Федеральный закон «о техническом регулировании».

5. Федеральный закон «о единстве измерений».

6. ГОСТ 2.114-95 «ЕСКД. Технические условия» - Минск.: Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации. - 1995

7. N.D. Denkov, O., et.al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir 1992,8,3183-3190.

8. Nam YS, Part TG. Porous biodegradable polymeric scaffolds prepared by thermally induced phase separation. J Biomed Mater Res 2002:8-17.

9. Hoi-Yan Cheung, Kin-Tak Lau, Tung-Po Lu, David Hui. A critical review on polymer-based bio-engineered materials for scaffold development.

10. Y. Ikada. Challenges in tissue engineering. // J. R. Soc. Interface. 2006, 3, 589-601.

11. http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/Products/tissueengineering/scaffold.shtm

12. Ratner BD, Hoffman AS, Schoen FJ, Lemons JE, editors. Biomaterials science: an introduction to materials and medicine. UK: Elsevier; 2004.

13. O'Brien FJ, Harley BA, Yannas IV, Gibson. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials 2005;26: 433-41.

14. Neves N, Kouyumdziev A, Reis RL. The morphology, mechanical properties and ageing behaviour of porous injection molded starchbased blends for tissue engineering scaffolding. Mater Sci Eng C 2005;25:195-200.

Приложение А

Гексагональная упаковка микросфер

Рис. А.1 - теоретическая схема гексагональной упаковки атмосфер.

Приложение Б

Камера Горяева

Камера Горяева - прибор для подсчета клеток по типу счетной камеры Бюркера и снабженный сеткой Горяева.

Счетная камера представляет собой толстую стеклянную пластину (предметное стекло) с углублением в центре, равным 0,1 мм (рис. Б.1). На дне камеры нанесены 2 сетки Горяева, разграниченные поперечной канавкой. Сбоку от сеток расположены стеклянные прямоугольные пластины, к которым притирается шлифованное покровное стекло.

Рис. Б.1 Схематическое изображение камеры Горяева

Каждая сетка Горяева (рис. Б.2) состоит из 225 больших квадратов, 25 из которых разделены еще на 16 малых квадратов каждый. Сторона большого квадрата равна 0,2 мм, сторона малого квадрата -- в 4 раза меньше (0,05 мм). Соответственно, площадь большого квадрата составляет 0,04 мм2 (4x10-2 мм2), малого квадрата -- 0,0025 мм2 (25x10-4 мм2).



Рис. Б.2 Сетка Горяева для подсчета клеток.

После заполнения камеры ее оставляют на 1-2 минуты в горизонтальном положении для оседания клеток.

Подсчет клеток проводят при малом увеличении микроскопа (объектив 10x), в несколько затемненном поле зрения (при прикрытой диафрагме и опущенном конденсоре).

Клетки подсчитывают в 5 расположенных по диагонали сетки квадратах, разделенных на малые, т. е. в 80 малых квадратах. Для этого под микроскопом находят верхний левый квадрат сетки (разделенный на 16 малых) и подсчитывают число клеток в нем. При этом целесообразно придерживаться определенной последовательности подсчета клеток: передвигаться из одного малого квадрата в другой по горизонтали, например, один ряд справа налево, другой ряд слева направо и т. д. (рис. Б.3).



Рис Б.3 Последовательность подсчета клеток в больших квадратах.

В каждом малом квадрате подсчитывают клетки, находящиеся внутри него, а также расположенные, например, на левой и верхней границе квадрата, пропуская эритроциты, лежащие на нижней и правой границе (рис. Б.4). Это позволяет добиться того, чтобы клетки, расположенные на границе квадратов, не попали в счет дважды.

Рис Б.4 Учет клеток в малом квадрате.

Количество клеток в 1 мкл (1 мм³) культуры рассчитывают по следующей формуле:

X = a/b*80

где Х -- число клеток в 1 мкл культуры, а -- число сосчитанных клеток, b - объем малого квадрата (2,5x10^-4 мкл), 80 -- число малых квадратов, в которых производился счет. Введя в эту формулу значение объема одного малого квадрата сетки Горяева, получим упрощенную формулу:

Количество клеток в 1 мкл (Х) равно числу клеток, подсчитанных в 80 малых квадратах, умноженному на 200.

Hапример, в 5 больших квадратах (80 малых) сосчитано 456 клеток. Тогда количество клеток в 1 мкл составит 91200, или примерно 9,1x10⁴/мкл.

Размещено на Allbest.ru