Пространственная динамика свертывания крови

Путь PCa

Для активации протеина С тромбином использовались кинетические константы, определенные в эксперименте [32]. Для мезотромбина были использованы те же константы, на основании того, что каталитическая активность мезотромбина по отношению к протеину С совпадает с активностью тромбина [30].

Антитромбин.

Антитромбин -- стехиометрический ингибитор сериновых протеаз, один из важнейших регуляторов системы свертывания. Он ингибирует факторы Xa, IXa, IIa, mIIa путем образования комплекса 1:1, который диссоциирует медленно, поэтому связывание считалось необратимым. Константы образования комплекса были взяты из экспериментальных работ (см. Таблицу 2).

Путь TFPI.

Подробное рассмотрение механизма действия ингибитора пути тканевого фактора проведено в разделе 4.1.

3.2 Математическая модель пространственной динамики свертывания в плазме

При изучении свертывания в цельной крови и плазме модель (9-34) была модифицирована с учетом отличий в биохимии реакций в очищенных в системах и в плазме (см. ниже). Полученная модель состояла из нескольких десятков дифференциальных уравнений. Такая система, давая наиболее адекватное описание, слишком сложна для аналитических и численных исследований, особенно при рассмотрении пространственной задачи типа реакция-диффузия. Поэтому в наших пространственных расчетах использовалась система, полученная из исходной редукцией быстрых (характерное время изменения меньше секунд) и медленных (характерное время изменения больше часа) переменных в соответствии с теоремой Тихонова [6]. Редуцированная система состояла из 16 дифференциальных уравнений. При рассмотрении пространственной задачи это давало 13 дифференциальных уравнений в частных производных (уравнения (44-56) для факторов в объеме плазмы) и 3 обыкновенных дифференциальных уравнения (уравнения (41-43) для поверхностных плотностей факторов на активирующей поверхности). В гомогенном случае, когда диффузией можно пренебречь (уравнения не показаны), численно было показано, что на временах от секунд до часа редуцированная система с точностью до 10% демонстрирует то же поведение, что и нередуцированная. С учетом диффузионных членов редуцированная система в пространстве имеет следующий вид.

Переменные , , описывают кинетику поверхностной плотности факторов свертывания:

(41)

(42)

(43)

Переменные , , , , , , , , , , , , описывают пространственную динамику объемных концентраций факторов свертывания:

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

Граничное условие на левой стенке для факторов VIIa, IXa, Xa имели вид:

(57)

(58)

(59)

При рассмотрении свертывания по внутреннему пути условие для фактора XIa имело вид

(60)

где А был обозначен вток фактора XIa с левой стенки. Для остальных факторов на левой стенке и для всех факторов на правой было задано граничное условие непротекания вида:

(61)

(62)

Значения коэффициентов диффузии определялись на основании молекулярных масс веществ и были равны (мм²/мин): VIIa, =0.0037; VII, =0.0037; IXa, =0.0037; Xa, =0.0037; IIa, =0.0028; VIIIa, =0.0023; VIII, =0.0017; Va, =0.0019; V, =0.0015; PCa, =0.0032; XIa, =0.0021. Диффузией фибриногена и фибрина пренебрегали из-за ее медленности.

Активация свертывания по внешнему пути моделировалось появлением тканевого фактора на левой стенке сосуда. Cчиталось, что 1 клетка фибробласта/мм² соответствует 2.5*10^-20 моль тканевого фактора/мм² [71]. Если не обозначено иное, значения констант реакций соответствовали Таблице 3.

Таблица 3. Кинетические константы реакций системы свертывания, использованные при моделировании свертывания в плазме

Константа	Значение	Ссылка
,	1 нМ-1мин-1, 0.01 мин-1	см. текст (раздел 3.1)
,	1 нМ-1мин-1, 0.01 мин-1	см. текст (раздел 3.1)
,	912 мин-1, 1200 нМ	[26]
,	3.66 мин-1, 2700 нМ	[26]
	770 мин-1	см. текст (раздел 4.1)
,	28 мин-1, 210 нМ	[21]
,	25 мин-1, 310 нМ	[89]
,	420 мин-1, 238 нМ	[17]
,	0.79 мин-1, 10110 нМ	[70]
	1740 мин-1, 4000 нМ	см. текст (раздел 4.4)
	4.1 мин-1, 1080 нМ	[72]
	1140 мин-1, 820 нМ	[83]
	54 мин-1, 147 нМ	[39]
	0.31 мин-1	[63]
	14 мин-1, 71.7 нМ	[57]
	1 нМ	см. текст (раздел 3.1)
	1 нМ	см. текст (раздел 3.1)
	1.2 мин-1, 60000 нМ	[32]
	0.1 мин-1	[33]
	1.2 нМ-1 мин-1	[80]
	0.00006 нМ-1мин-1	[44]
	0.0003 нМ-1мин-1	[31]
	0.0004 нМ-1мин-1	[41]
	6 нМ-1мин-1	см. текст (раздел 4.1)
	0.00005 мин-1, 50 нМ	см. текст (раздел 4.2)
	2 мин-1	[93]
	5040 мин-1, 7200 нМ	[38]

Рассмотрим наиболее существенные изменения, внесенные в модель, описывающую свертывание в плазме, по сравнению с моделью для реконструированных систем.

Редукция мембранных комплексов

При редукции системы уравнений (9-34) применялись, главным образом, два приема. Во-первых, концентрации ряда предшественников, таких, как факторы IX, X, VII, протеин С, мало изменяющиеся за характерные времена свертывания (менее 10% за час), были положены равными константам. Во-вторых, были редуцированы быстрые переменные, соответствующие концентрациям фермент-субстратных и фермент-продуктных комплексов, таких, как Xa-VIIa-TF, а также комплексов внутренней теназы и протромбиназы (кинетические константы ассоциации/диссоциации этих комплексов приведены в Таблице 2). Важно отметить, что во время свертывания концентрация компонентов последних двух комплексов могут значительно превышать константы их диссоциации. Например, концентрация фактора X достигает 2-3 нМ [43], а фактора Va --10 нМ и более [27] при K_d=1 нМ. В предыдущих моделях при редукции комплексов теназы и протромбиназы использовались формулы

(63)

(в работах [11, 94]) или

(64)

(в работе [45]), где [АВ] - концентрация комплекса, а [А] и [В] - полные концентрации компонент комплекса. По указанным выше причинам такой подход может быть не вполне корректным. Поэтому были использованы обладающие более широким диапазоном применимости формулы [5]:

(65)

(66)

Константы и механизмы реакции образования тромбина

Кинетика активации протромбина на в плазме отличается от кинетики очищенных систем, хотя механизмы этого различия не вполне ясны [82]. В отличие от реакции в очищенных системах (см. раздел 3.1), в плазме эта реакция идет без образования промежуточного продукта мезотромбина [82] и строго подчиняется кинетике Михаэлиса [83]. В недавнем исследовании, однако, было показано, что при свертывании в цельной крови может наблюдаться накопление другого интермедиата реакции, претромбина 2 [27]. Поскольку это вещество не обладает каталитической активностью, можно ожидать, что его наличие не изменит кинетику системы в целом. Поэтому в настоящей работе при моделировании свертывания в плазме и цельной крови реакция считалась проходящей по механизму Михаэлиса, а константы были взяты из экспериментальных данных работы [83].

Реакция образования фибрина

Для описания превращения фибриногена в фибрин использовалась константа, полученная в экспериментальной работе [38]. Поскольку концентрация фибриногена в плазме имеет порядок константы Михаэлиса для этой реакции (см. Таблицы 1 и 3), а продукт реакции, фибрин, связывает тромбин с той же аффинностью, что и фибриноген, то все выражения для реакций с участием тромбина изменились, приобретя члены в знаменателе, описывающие тот факт, что часть тромбина связана с фибрином и фибриногеном. Так, выражение для активации фактора XI приобрело вид:

(67)

вместо

(68)

Активация фактора XI

Исследование влияния реакции активации фактора XI на кинетику свертывания и выбор констант для этой реакции проведены в разделе 4.2.

Прочие изменения, связанные с моделированием свертывания в плазме

Поскольку плазма крови содержит ряд веществ, отсутствовавших в моделируемых очищенных системах, в уравнениях модели появился ряд дополнительных членов. Так, была добавлена реакция ингибирования активированного протеина С ингибитором протеина С [33]. Фактор XIa эффективно ингибируется несколькими ингибиторами плазмы, включая антитромбин III, альфа2-макроглобулин, альфа1-антитрипсин и ингибитор протеина С. Для описания этих реакций была использована суммарная константа псевдопервого порядка для ингибирования фактора XIa в плазме [93]. Еще одно изменение связано с реакцией инактивации фактора Va активированным протеином С. Фактор Va в составе комплекса протромбиназы защищен от расщепления, однако присутствие другого плазменного белка, протеина S, способно снять эту защиты [80]. Поэтому в модели, описывающей свертывание в плазме (41-56), весь пул фактора Va доступен для ингибирования, в отличие от модели для очищенных систем (9-34), где может инактивироваться лишь свободный фактор V.

Сравнение теории и эксперимента

При экспериментальном исследовании пространственной динамики свертывания регистрируемой величиной является интенсивность светорассеяния (Рис. 4А). Результатом моделирования того же процесса является фибрин как функция пространства и времени (Рис. 4Б). Интенсивность светорассеяния и концентрация фибрина связаны, вообще говоря, нелинейно. Кроме того, сопоставление серий кривых не очень удобно. Поэтому при сравнении предсказаний модели и результатов эксперимента производилось сравнение зависимостей размера сгустка от времени (напр., Рис. 12). За размер сгустка в каждый момент времени принималась абсцисса точки на профиле фибрина или интенсивности светорассеяния, ордината которой равнялась половине амплитуды бегущего фронта.



Рис. 4. Пространственная динамика свертывания в норме. Панель А, экспериментальные профили светорассеяния. Панель Б, теоретические профили фибрина. Промежуток времени между профилями составляет 2 минуты. Расчеты производились по модели (41-56), концентрация клеток фибробластов на поверхности активатора была равна 100 кл/мм². Экспериментальные данные взяты из [5]

Глава 4. Исследование математической модели системы свертывания

4.1 Регуляция свертывания ингибитором пути тканевого фактора

С механизмом действия TFPI связаны самые сильные предположения из тех, что были допущены при создании модели. Согласно существующему представлению, TFPI связывает фактор Xa, а затем комплекс Xa-TFPI связывает VIIa-TF, выключая внешний путь. В эксперименте, когда в систему очищенных белков-прокоагулянтов системы свертывания добавляется TFPI, изменение в кинетике системы было очень сильно (Рис. 4). Однако, попытки смоделировать эти результаты с помощью математической модели, использующей описанный выше механизм действия, не увенчались успехом. Теоретическое ингибирование, показанное на Рис. 4, намного меньше экспериментального; фактически, кривые для систем в присутствии и в отсутствие TFPI совпадают.

TFPI -- ингибитор типа Кюнитца, содержащий три домена типа Кюнитца [35]. Известно, что первый домен связывает фактор VIIa, а второй -- фактор Xa.

Функция третьего домена пока неизвестна [35]. Свободный TFPI связывает VIIa медленно и слабо по сравнению с фактором Xa [23]. Образующийся комплекс Xa-TFPI способен хорошо связывать VIIa-TF, формируя ингибиторный комплекс Xa-TFPI-VIIa-TF. Исходя из этих данных, и был предложен [23] двухшаговый механизм действия TFPI: TFPI сначала связывает Xa, затем комплекс Xa-TFPI связывает VIIa-TF, полностью ингибируя его активность.



Рис. 5. Влияние TFPI на образование тромбина в очищенной системе, содержащей факторы IX, X, VIII, V, II в концентрациях, указанных в Таблице 1. Активация производится 1.25 пМ комплекса VIIa-TF. Концентрация TFPI 2.5 нМ (Ў) или 0 нМ (¦). Экспериментальные данные взяты из работ [87, 88]. Теоретические расчеты (гладкие кривые) произведены по модели (9-34), с тем исключением, что константы , положены нулевыми (то есть работает только классический механизм действия TFPI)

Недавно было показано [18], что общепринятый двухшаговый механизм действия TFPI не может объяснить экспериментальные данные по кинетике ингибирования комплекса VIIa-TF в процессе активации фактора X. Baugh et al. измерили кинетические константы взаимодействия Xa с TFPI и комплекса Xa-TFPI с VIIa-TF. На основании этих данных в той же работе [18] они построили математическую модель активации фактора Х комплексом VIIa-TF и ингибирующего действия TFPI. Поскольку в этом процессе исходно нет активированной формы фактора Х, модель предсказала довольно слабое уменьшение скорости активации фактора X в присутствии TFPI. В эксперименте в этих же условиях авторы работы [18] получили быстрое и полное ингибирование производства фактора Xа. Для объяснения обнаруженного противоречия они предположили, что основным путем ингибирования является путь, где TFPI ингибирует сформировавшийся ранее комплекс Xa-VIIa-TF. Они предложили схему, согласно которой TFPI может связываться с фактором Xa в процессе его образования уже на стадии фермент-продуктного комплекса Ха-VIIa-TF; затем следует внутримолекулярное превращение в ингибиторный комплекс Xa-TFPI-VIIa-TF. Однако, предложенная схема детально исследована не была.

Чтобы описать кинетику свертывания полной системы, нами было проведено дополнительное исследование блока реакций, связанных с активацией фактора X внешней теназой и регуляцией этой реакции ингибитором пути тканевого фактора. Ниже приведена система уравнений для реакций этого блока, предназначенная для подробного описания систем, включающих факторы VIIa-TF, X, Xa и TFPI. Обозначения системы: S, фактор X; E, VIIa-TF; P, фактор Xa; I, TFPI.

(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)

Система уравнений (69-78) выписана в соответствии со схемой Рис. 5, включающей все гипотетические реакции, которые будет обсуждаться ниже.

Критерии выбора величин констант. Значения констант, использованные в расчетах, и источники информации об этих константах суммированы в Таблице 2. Нам не удалось найти информацию о некоторых константах. Обсудим несколько подробнее критерии выбора значений для этих констант.

Реакция активации фактора Х комплексом VIIa-TF рассматривалась, как протекающая по двухшаговой схеме Михаэлиса-Ментен с добавлением стадии фермент-продуктного комплекса. Мы не нашли литературных данных о кинетических константах образования фермент-субстратного комплекса. Если известна кинетическая константа ассоциации , то, исходя из =435 мин^-1, =238 нМ, можно найти его константу диссоциации из соотношения:

=

Из того же соотношения следует, что

2 нМ^-1мин^-1

Варьирование констант (данные не показаны) показало, что для экспериментов с характерными временами порядка секунд и больше, варьирование значения от 2 нМ^-1мин^-1 до 10 нМ^-1мин^-1 и выше не влияет на кинетику системы. Поэтому мы положили ее равной =5 нМ^-1мин^-1, на основании [43] Это приводит к значению

==770 мин^-1.

Константы образования фермент-продуктного комплекса Xа-VIIa-TF (,) также не были обнаружены в литературе. Однако, было показано, что фактор Xa, связывается с VIIa-TF со сродством, лишь немного меньшим, нежели фактор X [19]. Это можно считать убедительным свидетельством в пользу того, что Xa образует с VIIa-TF комплекс, очень похожий на комплекс X-VIIa-TF. Поэтому моделирование производилось при значениях констант (,), равных значениям (, ).

Значения констант гипотетических реакций: взаимодействия фермент-продуктного комплекса с TFPI, ассоциации Xa-TFPI и VIIa-TF с образованием промежуточного ингибиторного комплекса, и внутримолекулярной перегруппировки ингибиторного комплекса были подобраны так, чтобы описать результаты экспериментов из работы [18] (См. Рис 6).

Необходимо отметить, что на самом деле константы взаимодействия Xa и TFPI, измеряемые в эксперименте и приведенные в [18], являются не истинными константами а эффективными. Если гипотетический путь, исследуемый в этой модели, существует, то измеренные значения сложным образом зависят от истинных констант взаимодействия Xa, VIIa-TF и TFPI -- , , , , и . Например, в первом приближении

=+

Наблюдаемые и невелики. Ввиду этого не будет большой ошибкой считать истинные константы образования конечного комплекса равными наблюдаемым значениям, а константы гипотетических реакций найти отдельно.

Реакция ингибирования X-VIIa-TF комплексом Xa-TFPI была добавлена следующим способом. Мы считали, что Xa-TFPI взаимодействует с фермент-субстратным комплексом X-VIIa-TF, вытесняя субстрат, фактор Х, и образуя промежуточный ингибиторный комплекс TFPI-Xa-VIIa-TF. Предварительные расчеты показали, что константы , , и практически не влияют на кинетику системы. Поэтому мы положили их равными нулю и слагаемые, отвечающие этим реакциям, в систему уравнений не включены.

Результаты исследования модели

На Рис. 5 мы попытались схематически представить возможные молекулярные взаимодействия между всеми участниками процесса. На панели А изображен процесс активации фактора X с учетом стадий фермент-субстратного и фермент-продуктного комплексов, а также общепринятый двух шаговый механизм ингибирования реакции активации. В финальном ингибиторном комплексе фермент Е связан с первым Кюнитц-доменом ингибитора, а продукт реакции Р -- со вторым. Двух шаговая схема Рис. 5А предполагает последовательное связывание сначала продукта с ингибитором, а потом продукт-ингибиторного комплекса с ферментом. Дополнение этой схемы в соответствии с гипотезой Baugh et al (Рис. 5Б) приводит к необходимости внутримолекулярной перестройки ингибиторного комплекса. Как видно из Рис. 5B, связывание ингибитора с фермент-продуктным комплексом должно сначала приводить к возникновению промежуточного комплекс (EPI), в котором продукт, связанный с ферментом, связан также со вторым доменом ингибитора. После внутримолекулярной перестройки возникает окончательный ингибиторный комплекс, в котором фермент уже связан с первым доменом ингибитора. Естественно предположить, что третий Кюнитц-домен TFPI ингибитора образует шарнир, который позволяет провести внутримолекулярную перестройку ингибиторного комплекса без диссоциации. Не исключено, что третий домен участвует не только во взаимодействии с ферментом, но также и с поверхностными структурами клеточной мембраны, с которыми связан фермент.

Рис. 6. Схема реакций пути TFPI. Панель А, активация фактора X комплексом VIIa-TF и ингибирование активации по двухшаговому пути. Панель Б, механизм ингибирования, предложенный в работе [18]. Панель В, дополнительный путь ингибирования фермент-субстратного комплекса комплексом Xa-TFPI. Обозначения: S, фактор X; E, VIIa-TF; P, фактор Xa; I, TFPI.

Математическое моделирование показало, что гипотеза Baugh et al позволяет описать ряд экспериментальных данных (Рис. 6А), которые невозможно было описать с помощью двухшаговой модели. Однако, и эта гипотеза описывает не все экспериментальные данные, в первую очередь, эксперименты по активации фактора X в присутствии преформированного комплекса Xa-TFPI (Рис. 6Б).

Рис. 7. Теоретическое описание эксперимента по ингибированию активации фактора X с помощью гипотезы об ингибировании Xa-VIIa-TF при участии TFPI. Панель A, кривые активации 170 нМ фактора X комплексом VIIa-TF (1024, 512, 384, 256, 192, 128, 64, 32 пМ сверху вниз), в присутствии 2.4 нМ TFPI. Панель Б, кривые активации 170 нМ фактора X комплексом 128 пМ VIIa-TF в присутствии 2.4 нМ TFPI преинкубированного с фактором Xa в концентрации: 1) 0, 2) 0.25, 3) 0.5 и 4) 1 нМ. Теоретические кривые проведены путем численного интегрирования системы (69-78). Значения констант =10 нМ^-1 мин^-1, =0 мин^-1. Все остальные константы соответствуют Таблице 2. Экспериментальные данные взяты из Fig 2 работы [18]

Расхождение можно снять, дополнив гипотезу Baugh et al предположением, что существует взаимодействие Xa-TFPI с фермент-субстратным комплексом X-VIIa-TF или фермент-продуктным Xa-VIIa-TF. Учитывая вероятное сильное сходство между этими комплексами, можно предположить, что Xa-TFPI взаимодействует с обоими. Из Рис. 5В, иллюстрирующего нашу гипотезу, видно, что если комплекс продукта с ингибитором (но не сам ингибитор) вытесняет субстрат с фермента, то это может либо приводить к возникновению промежуточного ингибиторного комплекса, такого же, как тот, что возникает при связывании ингибитора с фермент-продуктным комплексом в гипотезе Baugh et al, либо реакция может сразу идти в конечный ингибиторный комплекс. Модель показывает, что введение взаимодействия Xa-TFPI с фермент-субстратным либо фермент-продуктным комплексами может описать эксперимент (Рис 5А, Б). Наиболее вероятен вариант ингибирования фермент-субстратного комплекса в силу более реалистичных значений получаемых констант. Следует отметить, что из-за малой скорости сборки комплекса Xa-TFPI можно ожидать, что роль этой реакции при физиологических условиях меньше, чем реакции ингибирования Xa-VIIa-TF при участии TFPI. Это подтверждается результатами моделирования систем очищенных белков, имитирующих систему свертывания (Рис. 9).



Рис. 8 Теоретическое описание эксперимента по ингибированию активации фактора X с помощью гипотезы о связывании X-VIIa-TF c Xa-TFPI. Панель А, кривые активации 170 нМ фактора X комплексом VIIa-TF (1024, 512, 384, 256, 192, 128, 64, 32 пМ сверху вниз) в присутствии 2.4 нМ TFPI. панель Б, кривые активации 170 нМ фактора X комплексом 128 пМ VIIa-TF в присутствии 2.4 нМ TFPI преинкубированной с фактором Xa (0, 0.25, 0.5, 1 нМ сверху вниз). Теоретические кривые проведены путем численного интегрирования системы (69-78). Все константы соответствуют Таблице 2. Экспериментальные данные взяты из Fig 2 работы [18]



Рис. 9. Проверка гипотез механизма действия TFPI. Панель А, проверка гипотезы об ингибировании фермент-субстратного комплекса при участии TFPI. Проводилось ингибирование фактора Xa в присутствии и в отсутствие VIIa-TF. Концентрации реагентов: Xa=1 нM, TFPI=1 нM, VIIa-TF=0 или 5 нM. Сверху вниз: кривая в отсутствие VIIa-TF; кривая с VIIa-TF, если реакции нет; кривая с VIIa-TF, если реакция есть. Все константы соответствуют Таблице 2. Панель Б, проверка гипотезы об ингибировании фермент-продуктного комплекса при участии Xa-TFPI. Проводилось ингибирование VIIa-TF комплексом TFPI-Xa в присутствии и в отсутствие Xa. Концентрации реагентов: TF=1 нM, TFPI-Xa=1 нM, Xa=0 или 100 нM. Сверху вниз: кривая в отсутствие Xa; кривая с Xa, если реакции нет; кривая с Xa, если реакция есть. Кривые проведены численным моделирование системы уравнений (69-78) с одним изменением: считалось, что Xa-TFPI ингибирует не X-VIIa-TFPI, а Xa-VIIa-TFPI. Все константы соответствуют Таблице 2

В целом, рассмотренные в гипотезы механизма действия TFPI дают хорошее объяснение известным на настоящий момент экспериментам. Однако, имеющихся данных недостаточно, чтобы сделать выбор между их вариантами и более подробно оценить кинетические параметры этих реакций. Как показывают расчеты, это можно сделать в сравнительно несложных экспериментах (Рис 7А, Б). Используя избыточные концентрации Xa или VIIa-TF, можно создать довольно высокую концентрацию комплекса Xa-VIIa-TF по сравнению с концентрацией свободного лимитирующего компонента. Тогда, при добавлении ингибитора лимитирующего компонента (Xa-TFPI или TFPI, соответственно) скорость реакции ингибирования лимитирующего компонента заметно увеличится по сравнению со скоростью, наблюдаемой в отсутствие избыточного компонента.

Кинетические константы гипотетических реакций ингибирования, найденные с помощью варьирования (Рис. 7А, Б), были использованы для описания кинетики реконструированных систем. На Рис. 9 показано, что с помощью этих констант можно успешно описать влияние TFPI на эти системы.

Рис. 10. Влияние TFPI на образование тромбина в очищенной системе, содержащей факторы IX, X, VIII, V, II в концентрациях, указанных в Таблице 1. Активация производится 1.25 пМ комплекса VIIa-TF. Концентрация TFPI 2.5 нМ (Ў) или 0 нМ (¦). Экспериментальные данные взяты из работ [87, 88]. Теоретические расчеты (гладкие кривые) произведены по модели (9-34).

4.2 Реакция активации фактора XI тромбином

Фактор XI входит в ту ветвь каскада свертывания, которая традиционно называется внутренним путем. При контакте с чужеродной поверхностью фактор XIIa активирует фактор XI, который, в свою очередь, активирует фактор IX. Таким образом, при контактной активации фактор XI является необходимым звеном в цепи реакций.

Однако, как было отмечено выше (см. раздел 1.1), на сегодняшний день общепринятым является мнение, что in vivo значимым является только внешний путь активации свертывания, при котором напрямую активируется фактор X. Тем не менее, в клинике дефицит фактора XI связан со склонностью к кровотечениям, болезнью, называемой гемофилией С [3]. Это заболевание является более легким, чем гемофилии А и Б, связанные с дефицитом факторов VIII и IX, соответственно. При нем опасные кровотечения возникают лишь при глубоких ранениях или при хирургическом вмешательстве [27]. Все же, связь дефицита фактора XI с геморрагией показывает, что фактор XI играет важную, хотя и не критическую роль в гемостазе. Открытие в начале 90-х годов XX века реакции активации фактора XI тромбином послужило причиной возникновения оживленной дискуссии. Как будто бы, эта реакция вполне была способна объяснить описанное разногласие между биохимией свертывания и его клинической картиной. В ранней работе [34] было показано, что в растворе тромбин способен активировать фактор XI в медленной реакции с =0.0078 мин^-1, =50 нМ. В присутствии отрицательно заряженных поверхностей типа декстран сульфата скорость этой реакции на порядки возрастала, что дало авторам основание предположить, что похожий механизм ускорения может работать in vivo, и реакция может быть физиологически значимой. С другой стороны, в работе [74] было показано, что присутствие плазменных концентраций фибриногена почти полностью блокирует реакцию в присутствии декстран сульфата, что было интерпретировано, как свидетельство в пользу неэффективности этой реакции. В работе [94], посвященной математическому моделированию пространственной динамики роста тромба, было исследовано влияние этой реакции на рост сгустка и показано, что даже при малых скоростях эта реакция может оказывать сильнейшее влияние на поведение тромба вдали от активатора, там, где она является единственным источником фактора XIa и, следовательно, IXa. В недавних работах [14, 64] исследовалась влияние тромбоцитов на эту реакцию. В работе [14] 1.25 нМ тромбина за 2 минуты практически полностью активировали 60 нМ фактора XI, фибриноген не оказывал на скорость реакции влияния. В работе [64] в полностью идентичных условиях, напротив, 100 нМ тромбина за 30 минут активировали 30 нМ фактора XI лишь на несколько процентов, что соответствует разнице в каталитической эффективности по сравнению с работой [14] на 4 порядка.

Перечисленные сильнейшие противоречия в результатах экспериментальных исследований этой реакции послужили причиной проведения в настоящей работе отдельного исследования роли этой реакции и определения скорости ее протекания в плазме. С этой целью была проведена оценка значений констант активации фактора XI в эксперименте в цельной крови в гомогенной постановке. Если подставить в уравнения значения, полученные в очищенных системах в работе [34], то отличие между нормой и гемофилией С, если судить по кинетике тромбин-антиромбинового комплекса, будет сильно выражено (Рис. 10). Однако, в эксперименте эти два случая практически неразличимы. Это показывает, что константы, измеренные в очищенных системах, на порядки превышают те, что существуют в крови.



Рис. 11. Кинетика тромбин-антитромбинового комплекса при активации цельной крови добавлением 25 пМ тканевого фактора, эксперимент и теория. Свертывание в норме (?, сплошные линии) и при гемофилии С (Ў, пунктир). Расчеты проведены по гомогенному варианту модели (41-56). Экспериментальные данные взяты из работы [27]

Для более точной оценки кинетической константы активации фактора XI были использованы результаты опытов по росту тромба в цельной крови. На Рис. 11 изображены зависимости размера сгустка от времени при различных значениях каталитической константы активации тромбина. Видно, что наилучшее описание достигается при значении 0.00005 мин^-1.



Рис. 12. Теоретическая зависимость размера сгустка от времени при различных концентрациях фактора XI. Каталитическая константа активации фактора XI (сверху вниз): 0.0001, 0.00005, 0.000025, 0.0000125, 0.00000625, 0.000003125, 0.0000005, 0 мин^-1. Все остальные константы соответствуют Таблице 2. Расчет проводился по модели (41-56). Концентрация клеток фибробластов на поверхности активатора была равна 100 кл/мм². Экспериментальные данные (¦) взяты из [5]

4.3 Влияние тромбоцитов и фосфолипидов на скорость реакций свертывания

Как упоминалось выше (раздел 1.1), для прохождения почти всех реакций свертывания необходимо наличие фосфолипидных мембран. Известно, что существует три механизма, с помощью которых скорость реакции на мембране может увеличиваться [98]:

1. Ориентация молекул, сидящих на мембране, может приводить к тому, что большее число столкновений окажутся результативными.

2. Эффект "сгущения" реагентов из объема в тонкий слой, прилегающий к поверхности мембраны [61].

3. Большая эффективность двухмерной диффузии по сравнению с трехмерной (так называемая "редукция размерности").

Эти механизмы приводят к увеличению скоростей мембранно-связанных реакций на порядки при добавлении в систему фосфолипидных поверхностей. При этом кинетические параметры таких реакций зависят от концентрации добавленных поверхностей. При построении модели возникает проблема: как быть, если значения констант определялись при одной концентрации фосфолипидов, а моделируемый эксперимент проводится при другой?

Пусть у нас есть реакция, в которой и фермент, и субстрат связаны с поверхностью искусственных фосфолипидов (например, активация протромбина протромбиназой (или фактором Xa) или активация фактора X внутренней теназой (или фактором IXa)). Пусть S^B и E^B - концентрации связанных реагентов по отношению к всему реакционному объему V. Если реакция связывания быстрая, то эти величины будут зависеть от полных концентраций по закону вида

(79)

где [PCPS] - концентрация фосфолипидов, S^E - стехиометрия связывания, K_d - константа диссоциации. Пусть S^sh и E^sh - их концентрации в тонком примембранном слое, суммарный объем которого - V^sh. Очевидно,

(80)

(81)

Внутри оболочки реакцию считаем подчиняющейся кинетике Михаэлиса-Ментен. Скорость увеличения концентрации продукта в оболочке

(82)

Увеличение объемной концентрации при этом

= (83)

Отсюда получаем, что наблюдаемая константа Михаэлиса для такой системы пропорциональна концентрации фосфолипидов, [PCPS], а каталитическая константа от нее не зависит, результат, хорошо согласующийся с экспериментальными данными для упомянутых выше белков [72, 84, 70]. В случае, если фермент представляет собой комплекс, например, протромбиназы, концентрация его равна:

(84)

В литературе есть экспериментальные данные по человеческой теназе только для [PCPS]=25 мкМ. В моделируемых нами экспериментах [PCPS]=200 мкМ, на порядок больше. На этом основании мы увеличили константу Михаэлиса с 190 до 4000 нМ, используя для верификации Рис. 12.



Рис. 13. Образование фактора Xa в очищенной системе, содержащей факторы IX, X, VIII, V, II в концентрациях, указанных в Таблице 1. Активация производится 1.25 пМ комплекса VIIa-TF. Экспериментальные данные (?) взяты из работы [87]. Теоретические расчеты (гладкие кривые) произведены по модели (9-34). Константа Михаэлиса для активации фактора X внутренней теназой равна 190 нМ (пунктир) или 4000 нМ (сплошная линия). Все остальные константы соответствуют Таблице 2

Рассмотрим аналогичную задачу для реакции протромбиназы, протекающей на тромбоцитах. В отличие от искусственной поверхности, на тромбоцитах сначала связывается фактор Va, а затем с ним связывается фактор Xa [83]. Концентрация связанного с мембраной фактора Va есть

(85)

где - концентрация специфичных сайтов, - константа диссоциации. Концентрация протромбиназы определяется аналогичной формулой для Xa, только вместо числа сайтов подставляется концентрация связанного Va:

(86)

Для скорости активации протромбина имеем:

v== = (87)

4.4 Влияние кинетических констант реакций свертывания на кинетику системы

Естественный вопрос, возникающий при построении модели, связан с зависимостью результатов моделирования от параметров системы. Он имеет два аспекта: во-первых, ответ на него позволяет глубже понять объект, оценить роль отдельных параметров в функционировании системы; во-вторых, подобное исследование помогает оценить устойчивость модели по отношению к варьированию параметров и необходимость дополнительного исследования наиболее важных из них.



Рис. 14. Зависимость лаг-фазы (панель А) и максимальной скорости производства тромбина (панель Б) в очищенных системах от концентрации активатора. Система содержит факторы IX, X, VIII, V, II в концентрациях, указанных в Таблице 1

Активация производится комплексом VIIa-TF, концентрации указаны на рисунке. Экспериментальные данные (?) взяты из работы [88]. Теоретические расчеты (гладкие кривые) произведены по модели (9-34). Константы реакций соответствуют Таблице 2. Все графики кинетики тромбина в реконструированных системах в отсутствие ингибиторов имеют один и тот же вид: лаг-фаза, когда тромбин заметно не нарабатывается, быстрый разгон, почти линейный рост, торможение, плато. Используя эту однородность, можно попробовать выделить несколько параметров, характеризующих график. В работе [88] вводятся два таких параметра: лаг-фаза и угол наклона псевдолинейного участка графика (максимальная скорость производства тромбина). Можно предложить следующий способ формализации данных параметров: псевдолинейная часть по своей сути есть область точки перегиба графика. Максимальная скорость производства тромбина -- это значение первой производной в этой точке. Если провести через нее прямую с наклоном, равным этой первой производной, эта прямая пересечет ось времени в точке, соответствующей лаг-фазе. На Рис. 13 приведены экспериментальные и теоретические зависимости лаг-фазы и максимальной скорости производства тромбина от концентрации активатора. Интересно отметить, что в двойных логарифмических координатах зависимости становятся линейными. Представляется интересным вопрос о влиянии различных кинетических констант реакций на форму зависимости концентрации тромбина от времени. Введение двух параметров, вполне характеризующих форму этой кривой, позволило свести все результаты этого исследования в 2 небольшие таблицы. Каждая из каталитических констант реакций, входящих в полную прокоагулянтную систему без ингибиторов, увеличивалась и уменьшалась в 2 и в 10 раз. В левом столбце таблицы стоят названия констант, которые менялись. В остальных -- изменение лаг-фаза и угла наклона линейного участка в процентах.

Таблица 4. Зависимость лаг-фазы от кинетических констант модели

Константа	1/2	2	1/10	10
	16.8	-18.5	56.8	-60.1
	7.4	-8.3	15.1	-25.7
	1.1	-1.1	3.6	-3.6
	18.8	-12.6	91.7	-23.6
	1.2	-1.2	3.8	-4.5
	3.7	-3.1	13.6	-8.0
	0.5	-0.7	0.7	-3.5
	2.4	-2.1	6.9	-5.9
	7.4	-8.3	15.1	-25.6

Таблица 5. Зависимость максимальной скорости производства тромбина от кинетических констант модели

Константа	1/2	2	1/10	10
	1.4	2.1	11.1	40.9
	-22.3	31.1	-50.2	154
	0.4	-0.4	1.4	-1.4
	-23.3	27.5	-61.2	101.6
	0.5	-0.5	1.5	-1.8
	1.5	-1.2	5.4	3.3
	0.16	-0.3	0.3	-1.3
	0.8	-0.8	2.2	-2.3
	-22.3	30.9	-50.2	152

Из этих цифр можно заключить, что:

1. Константы и оказывают совершенно одинаковое влияние на форму кривой тромбина. Это является следствием того, что фактор IXa является лимитирующим компонентом теназы. Видно, что константа , при своем настоящем значении, оказывает очень слабое влияние на форму кривой, -- несколько более сильное.

2. Как и следовало ожидать, очень сильно влияние константы протромбиназы .

3. Прокоагулянтные константы , , при увеличении уменьшают максимальную скорость производства тромбина.

4. Изменение констант , , почти одинаково влияет на максимальную скорость.

Обсуждение результатов

В работе построена количественная математическая модель системы свертывания крови. В отличие от предыдущих моделей [4, 67, 43, 46, 50, 51, 91, 94], она способна количественно описывать широкий класс экспериментальных систем: реконструированные системы очищенных факторов свертывания, имитирующие плазму [43, 87, 88], свертывание в цельной крови [27], рост сгустка в пространстве при активации по внешнему и внутреннему пути [5].

С помощью модели было показано, что классический двух шаговый механизм действия TFPI, при котором TFPI сначала связывает фактор Xa, а потом комплекс VIIa-TF, слишком слаб и не может описать эксперимент; в случае, если бы этот механизм был единственным, добавление TFPI к реакционной смеси не повлекло бы за собой заметных изменений в поведении системы (Рис. 4). Гипотетический альтернативный механизм [18], согласно которому TFPI напрямую ингибирует фермент-продуктный комплекс Xa-VIIa-TF, также давал результаты, качественно расходящиеся с экспериментом (Рис. 6). Однако, если дополнить его гипотезой об ингибировании фермент-субстратного комплекса X-VIIa-TF комплексом Xa-TFPI, получившаяся модель успешно описывает экспериментально наблюдаемые зависимости (Рис. 7, Рис. 9). Разумеется, конечное суждение об устройстве блока реакций TFPI может вынести только эксперимент. Наиболее простым экспериментом, в котором может быть подтверждено или опровергнуто существование этих реакций, может быть постановка, в которой концентрация фермент-продуктного или фермент-субстратного комплекса искусственно увеличена: при избытке одного из компонентов комплекса второй будет почти целиком входить в него. В результате, реакции, идущие через комплекс, станут намного эффективнее и будут хорошо заметны (Рис. 8).

Был проведен анализ влияния реакции активации фактора XI тромбином на свертывание. Результаты показали, что, если эта реакция в плазме идет с такой же скоростью, что и в очищенных системах, то как в гомогенной, так и в пространственной постановке модель качественно не может описать эксперимент. Поскольку фактор XI находится на самой вершине усилительного каскада, положительная обратная связь даже при малых скоростях реакции оказывается очень сильной. Для того, чтобы успешно описать эксперимент, эффективность реакции должна быть уменьшена на два порядка. Механизм такого уменьшения остается за рамками данного исследования. Наиболее вероятно, что оно связано с оккупацией тромбина многочисленными субстратами в плазме, которое, возможно, не всегда можно учесть с помощью простой формулы (8). Вполне возможна аллостерическая регуляция активности тромбина. Также возможно, что скорость реакции регулируется изменениями, связанными с субстратом, фактором XI. Необходимо подчеркнуть, что до сих пор дискуссия в литературе велась вокруг поиска доказательств заметности столь слабой реакции в плазме [34, 74], в то время как данные настоящей работы поднимают вопрос о том, что скорость реакции в очищенных системах, в отсутствие всяких кофакторов, наоборот, на два порядка выше, чем требует описание экспериментов в плазме.

Была исследована зависимость кинетики производства тромбина в реконструированных системах от кинетических констант реакций, входящих в каскад. Основным результатом явилась очень высокая устойчивость системы по отношению к возмущениям констант реакций. При десятикратном их варьировании только и меняли лаг-фазу больше, чем на 20-25%. На максимальную скорость тромбина эффект, больший 25%, оказывали они же и и . Ни одна из констант при 10-кратном изменении не меняла лаг-фазу или скорость более чем вдвое. Эти данные свидетельствуют в пользу достаточной устойчивости модели: ошибки в экспериментах по определению констант сравнительно слабо сказываются на ответе системы в целом. С другой стороны, это говорит о устойчивости моделируемой системы, что физиологически выглядит вполне разумно: неконтролируемое свертывание может представлять смертельную опасность для организма. Интересно также, что константы и оказывают совершенно одинаковое влияние на форму кривой тромбина, что можно интерпретировать, как результат того, что фактор IXa является лимитирующим компонентом теназы.

Модель была предназначена для моделирования систем, содержащих в качестве прокоагулянтной поверхности 200 мкМ искусственных фосфолипидов или же тромбоциты (тромбоцитарные микровезикулы) в концентрациях, близких к нормальной. Одним из дальнейших направлений исследования является включение в нее концентрации поверхности любого типа как переменной величины. Шагом в этом направлении было выведение формул зависимости скоростей реакций теназы и протромбиназы от концентрации тромбоцитов и фосфолипидов.

На настоящий момент модель может успешно применяться для планирования разнообразных экспериментов, предсказания и объяснения их результатов. Однако, хотя результаты опытов in vitro, особенно экспериментов по пространственному росту тромба, хорошо корреллируют с наблюдающейся клинической картиной, модель в перспективе может позволить описание ситуации in vivo, что является перспективой этих исследований. Первыми шагами в этом направлении должны быть введение в модель механизма активации и агрегации тромбоцитов, а также потока, который служив важным формообразующим элементом в формировании тромбоцитарного сгустка.

Выводы

1. Проведен анализ литературы и построена модель системы свертывания, количественно описывающая эксперименты по исследованию: 1) реконструированных систем очищенных белков, имитирующих систему свертывания; 2) цельной крови; 3) пространственного роста сгустка в плазме.

2. Показано, что общепринятый двух шаговый механизм действия TFPI слишком слаб и не может описать экспериментальные данные по активации фактора X внешней теназой в присутствии TFPI. Показано, что введение двух реакций, ингибирования фермент-продуктного комплекса Xa-VIIa-TF при участии TFPI и ингибирования комплекса Xa-VIIa-TF или X-VIIa-TF с помощью Xa-TFPI, позволяет описать все существующие экспериментальные данные единым набором констант. Предложена постановка эксперимента для проверки этой гипотезы.

3. Показано, что реакция активации фактора XI влияет на поведение системы в пространстве вдали (1 мм) от активатора. Показано, что эффективность этой реакции в плазме должна быть значительно ниже (не менее 2 порядков), чем в очищенных системах, чтобы описать существующие экспериментальные данные.

4. Получены формулы для зависимости скорости реакций внутренней теназы и протромбиназы от концентрации искусственных фосфолипидных поверхностей и тромбоцитов.

5. Исследована зависимость кинетики системы от констант реакций в случае очищенных систем и показано, что: а) система устойчива по отношению к сильным изменениям констант; б) наиболее сильно воздействуют на систему константы работы внешней и внутренней теназ и протромбиназы; в) при это реакции активации фактора IX внешней теназой и фактора X внутренней теназой оказывают совершенно одинаковое воздействие на кинетику системы.

Список сокращений

АДФ - аденозиндифосфорная кислота.

a_0, АТ-III - антитромбин III.

HK - высокомолекулярный кининоген.

i₀, I, TFPI - ингибитор пути тканевого фактора.

К - калликреин.

mIIa - мезотромбин.

PK - прекалликреин.

, E - комплекс VIIa-TF.

- комплекс VII-TF.

, TF - тканевый фактор.

- фибрин.

- фактор IIa.

- фактор Va.

- фактор VIIa.

- фактор VIIIa.

- фактор IXa.

, P - фактор Xa.

- фактор XIa.

, PCa - активированный протеин С.

- фибриноген.

- фибриноген, средняя плазменная концентрация.

- фактор II.

- фактор II, средняя плазменная концентрация.

- фактор V.

- фактор V, средняя плазменная концентрация.

- фактор VII, средняя плазменная концентрация.

- фактор VIII.

- фактор VIII, средняя плазменная концентрация.

- фактор IX, средняя плазменная концентрация.

, S - фактор Xa.

-фактор X, средняя плазменная концентрация

- фактор XI, средняя плазменная концентрация.

, PC - протеин С, средняя плазменная концентрация.

Список использованной литературы

1. Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., Сафрошкина А.И. (1994) Пространственные аспекты динамики свертывания крови. II. Феноменологическая модель. Биофизика, т. 39, стр. 97-106.

2. Барынин И.А., Старков И.А., Ханин М.А. (1999) Математические модели в физиологии гемостаза. Известия Академии наук, н. 1, стр. 59-66.

3. Исследование системы крови в клинической практике, М., "Триада-Х", 1998.

4. Козлов А.А., Берковский А.Л., Качалова Н.Д., Простакова Т.М. Пособие для врачей-лаборантов по методам исследования гемостаза. М., ГНЦ РАМН, 2001.

5. Пантелеев М.А., Зарницына В.И, Морозова О.Л., Лобанов А.И., Ованесов М.В., Коротина Н.Г., Лобанова Н.С., Атауллаханов Ф.И. (2001) Математическое моделирование пространственно-временной динамики свертывания крови, Труды Международной конференции "Параллельные вычисления и задачи управления". т. 6, стр. 54-78.

6. Тихонов А.Н., Васильева А.Б., Свешников А.Г., Дифференциальные уравнения. М., Наука, 1998.

7. Физиология человека (том 2), под редакцией Р. Шмидта и Г. Тевса, М, Мир, 1996.

8. Хайрер Э., Нерсетт С., Ваннер Г., Решение обыкновенных дифференциальных уравнений. Нежесткие задачи. М. Мир, 1990.

9. Ahmad S.S., Scandura J.M, Walsh P.N. (2000) Structural and functional characterization of platelet receptor-mediated factor VIII Binding, J. Biol. Chem, vol. 275, pp. 13071-13081.

10. Andrews D.A., Low P.S. (1999) Role of red blood cells in thrombosis. Curr. Opin. Hematol. vol. 6, pp. 76-82.

11. Ataullakhanov F.I., Molchanova D.A., Pokhilko A.V. (1995), A simulated mathematical model of the blood coagulation system intrinsic pathway, Biophysics, vol. 40, pp. 413-421.

12. Bach R., Gentry R., Nemerson Y. (1986) Factor VII binding to tissue factor in reconstituted phospholipid vesicles: induction of cooperativity by phosphatidylserine. Biochemistry, vol. 25, pp. 4007-4020.

13. Baglia F.A., Walsh P.N. (2000 ) Thrombin-mediated feedback activation of factor XI on the activated plateletsurface is preferred over contact activation by factor XIIa or factor XIa. J. Biol. Chem., vol. 275, pp. 20514-20519.

14. Baglia F.A., Walsh P.N. (1998) Prothrombin is a cofactor for the binding of factor XI to the platelet surface and for platelet-mediated factor XI activation by thrombin, Biochemistry, vol. 37, 2271-2281.

15. Bajaj M.S., Birktoft J.J., Steer S. A., Bajaj S.P. (2001) Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor . Thromb. Haemost., vol. 86, pp. 959-72.

16. Bajaj S.P., Rapaport S.I. Russel W.A. (1983) Determination of the rate limiting step in the activation of factor IX by factor XIa and by factor VIIa/tissue factor. Explanation for different electroforetic radioactivity profiles obtained on activation of 3H- and 125I-labelled factor IX. Biochemistry, vol. 22, pp. 4047-53.

17. Baugh R.J., Krishnaswamy S. (1996) Role of the activation peptide in human factor X activation by the extrinsic tenase complex, J. Biol. Chem., vol. 271, pp. 16126-16134.

18. Baugh R.J., George J.B., Krishnaswamy S. (1998) Regulation of extrinsic pathway factor Xa formation by tissue factor pathway inhibitor, J. Biol. Chem., v. 273, pp. 4378-4382.

19. Baugh R.J., Dickinson C.D., Ruf W., Krishnaswamy S. (2000) Exosite interactions determibe the affinity of factor X for the extrinsic Xase complex. J. Biol. Chem., v. 275, pp. 28826-28833.

20. Beltrami E., Jesty J. (1995) Mathematical analysis of activation thresholds in enzyme-catalyzed positive feedbacks: application to the feedbacks of blood coagulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 92, pp. 8744-8748.

21. Bom V.J.J., Bertina R.M. (1990) The contribution of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal, vol. 265, pp. 327-336.