В разделе 2.3.1 дано описание методики фотометрического определения таурина в условиях проведения нингидриновой реакции с образованием фиолетового (синего) Руэмана [18-20], установленных в работе после предварительно проведенных исследований. Были апробированы некоторые рекомендации для определения капролактама [20] и аминокислот [18].

Поиск условий проведения фотометрической реакции с нингидрином с целью определения низких концентраций таурина заключался в следующем:

изучение влияния рН буферного раствора;

изучение влияния температуры и режима нагревания;

изучение влияния добавок гидриндантина (ГД), органических растворителей;

изучение влияния порядка введения реактивов на величину устойчивого аналитического сигнала.

Попытка получения окрашенного в сине-фиолетовый цвет продукта реакции нингидрина (НГ) с таурином по методике [18] (разд. 2.2.4 - пропись I) не удалась. Причиной этого может быть, с одной стороны, неполное соблюдение условий, связанных с невозможностью использования NaCN в составе буферного раствора, и отсутствие рекомендованного изопропанола. С другой стороны, что вероятнее, указанное значение рН буфера (5,3-5,4) не подходит для проведения реакции (образуется продукт желто-оранжевого цвета).

Поэтому возникла необходимость поиска других условий, в частности, с использованием рекомендаций работы [20]. При проведении эксперимента варьировались: соотношение компонентов, порядок их введения, рН буферного раствора, концентрация таурина. Измерение оптической плотности окрашенного продукта проводилось при 570 нм. Результаты представлены в таблице 3.1.

Таблица 3.1.

Влияние условий проведения реакции таурина с нингидрином на получение окрашенного продукта

Примечания к таблице: Раствор реагентов Й: 0,2 г НГ и 0,03 г ГД растворяли в 10 мл этилцеллозольва. Раствор реагентов ЙЙ по методике [20]: 0,2 г НГ и 0,03 г ГД растворяли в 7,5 мл этилцеллозольва.

При проведении фотометрической реакции необходимо было получить устойчивый аналитический сигнал в течение времени, достаточного для анализа, высокий и постоянный выход окрашенного продукта, обеспечивающий определение концентрации таурина менее 1·10-5 моль/л (для исследования десорбции). Наиболее подходящими условиями для получения красителя оказались результаты опытов с 2- кратным избытком ГД по отношению к рекомендуемому в методике [20] и увеличение количества буферного раствора практически в 2 раза (п.14 табл.4.1). В этом случае аналитический сигнал получается и при низких концентрациях таурина, а оптическая плотность стабильна в течение 20 мин (рис. 4.1). Для получения более стабильной окраски рекомендуют [18] проводить реакцию в присутствии солей меди или кадмия. В данном эксперименте в качестве стабилизатора использовался CuSO4 с концентрацией 10-3 моль/л (1 мл). Однако на устойчивость окраски добавка соли меди практически не повлияла, с течением времени она также убывает.

Таким образом, показано, что ГД увеличивает интенсивность окраски продукта реакции, повышает ее стабильность (рис. 3.1).

Рис. 3.1. Влияние ГД на получение и стабильность красителя

Однако введение ГД приводит к появлению плохо воспроизводимой окраски холостого опыта красных оттенков, которая налагается на окраску продукта, как это можно видеть из спектров поглощения (рис. 3.2а).

Рис. 3.2. Спектры поглощения продукта нингидриновой реакции.

Концентрация таурина 6,4·10-5 моль/л. Условия реакции:

а - в присутствии гидриндантина по п.14 (табл. 4.1) (разбавление в 3 раза);

б - без гидриндантина при рН 6,2 с добавкой этанола.

Анализируя полученные результаты, приведенные в табл. 3.1, можно сделать следующие обобщения:

Раствор реагентов Й - “не работает”, т.к. все реакции с этой смесью не дали окрашенного продукта.

ГД повышает устойчивость окраски во времени; без ГД интенсивность окраски раствора ниже и устойчивость снижается.

Важна также последовательность добавления веществ для получения окрашенного продукта и дальнейшего анализа, а именно: раствор реагентов, буферный раствор, раствор таурина.

Необходимо использовать ацетатный буферный раствор с рН 6,50-6,55, в отличие от 5,3-5,4 по методике [18].

Таким образом, методика анализа с введением ГД имеет следующие недостатки: плохую воспроизводимость результатов, высокий аналитический сигнал холостого опыта (рис. 4.2а) и ограниченную стабильность продукта. В связи с этим был необходим поиск иных условий проведения реакции таурина с нингидрином без введения ГД.

Исследование влияния рН в интервале 5,1 - 6,5, создаваемом ацетатным буфером, показало, что синий продукт образуется при рН 6,5 и без ГД, в отличие от капролактама [20]. То есть для проведения нингидриновой реакции с таурином необходимы более высокие значения рН, чем указанные в работе [18]. При этом время нагревания при температуре 80єС пришлось увеличить до 60 минут, вместо 22 мин [20].

Согласно литературным данным на стабильность и интенсивность окраски продукта оказывают влияние добавки спиртов в реакционную смесь. Вводить спирт для стабилизации окраски рекомендуется или после реакции (изопропиловый, амиловый) или во время реакции (этиловый вместе с изобутиловым) [18]. Введение в смесь реагентов этилового спирта и проведение реакции при температуре 100єС в течение 10 минут позволило получить окрашенный продукт сине-фиолетового цвета (рис. 3.2б), устойчивый в течение суток. Порядок введения реактивов не влияет на аналитический сигнал. При этом аналитический сигнал холостого опыта существенно ниже, чем в присутствии ГД (рис. 3.2).

При использовании такого смешанного растворителя установлено, что наибольшая величина полезного аналитического сигнала получается при рН 6,2 и приготовлении раствора нингидрина в этилцеллозольве с добавлением спирта в соотношении 1:1. При рН 6,55 в присутствии этанола практически в 2 раза увеличивается оптическая плотность холостого опыта, что нежелательно. На образование окрашенного продукта влияет режим нагревания. Для лучшей повторяемости результатов в присутствии этанола, как показали наблюдения, нагревание следует проводить в вертикально установленных на кипящую водяную баню открытых колбах одинакового калибра. При этом получается окрашенный продукт, сходимость измерений оптической плотности которого (А570) на уровне 0,1 (при концентрации таурина 1,3·10-5 моль/л) при п = 67 характеризуется Sr не превышающим 3%.

Таким образом, использование спирта позволило в определенной степени решить поставленные задачи. Установлены наиболее приемлемые условия проведения нингидриновой реакции с таурином: растворитель нингидрина - этилцеллозольв, стабилизатор окраски - этиловый спирт (их соотношение в смеси реагентов 1:1); буферный раствор с рН 6,2; температура реакции 100єС; время нагревания 10 минут. Нагревание следует проводить в тонкостенных открытых колбах с большим свободным объемом (100 мл при объеме реакционной смеси 10 мл). Методические детали выполнения анализа в отработанных условиях приведены в разд. 2.3.1.

3.2 Характеристики градуировочной зависимости для определения таурина в выбранных условиях

В выбранных условиях проведения фотометрической реакции (разд. 2.3.1) была получена градуировочная зависимость оптической плотности растворов при 570 нм (А570) от концентрации таурина, линейная в диапазоне концентраций таурина 0,06·10-4 - 1,0·10-4 моль/л и проходящая через начало координат (рис. 3.3).

Рис. 4.3. Зависимость оптической плотности продукта нингидриновой реакции от концентрации таурина в растворе.

Исходная концентрация таурина в препарате «Тауфон», установленная методом кислотно-основного титрования, составила (0,0414 ± 0,0001) г/мл.

Характеристики градуировочной зависимости:

b = 8170; a = -0,0023 (не значим);

Sb = 174; Sа = 0,007;

Cb = 480;

y = (8170 480)x;

ymin = 0,020 (Аmin при 570 нм);

Предел обнаружения: сmin= 4,20·10-6 М (5,25·10-4 мг/мл).

Следует отметить, что характеристики градуировочной зависимости практически не изменяются в присутствии физраствора.

Значение экспериментального молярного коэффициента поглощения, близкое к 8100 М-1·см-1, занимает промежуточное среди указанных в работе [18,20] для продуктов с различными аминопроизводными (от 1,6·103-20·103). Это может быть связано с недостаточно высоким выходом продукта реакции, но стабильность и воспроизводимость окраски полученного в условиях методики красителя свидетельствует о ее применимости для проведения анализа.

Таблица 3.2.

Метрологические характеристики методики определения таурина с нингидрином в установленных условиях (р = 0,95).

Примечание: 1) исходная концентрация таурина, установленная методом кислотно-основного титрования (разд. 3.3.1) 41,3 г/л (0,331 моль/л), разбавлена в 500 раз; взятые объемы, соответственно, равны 0,10; 0,20; 0,34 и 0,80 мл.

Отработанная методика имеет хорошие метрологические характеристики. Полученная градуировочная зависимость использовалась при исследовании обменных свойств МКЛ по отношению к препарату «Тауфон».

3.3 Результаты исследования обменных свойств МКЛ и их обсуждение

Подготовка линз к проведению исследования.

МКЛ на основе материала «Кемерон-1» были выточены специально для изучения обменных свойств и представляли собой в сухом состоянии прозрачные неэластичные образцы диаметром 12,000,01 мм и толщиной в центральной части 0,60 мм.

После взвешивания сухих МКЛ проводили их насыщение водой до постоянной массы. При набухании линзы увеличивались в размере и приобретали эластичность. Набухшие линзы хорошо встряхивали, а затем взвешивали (работа проводилась с 3 линзами). Взвешивание повторяли не менее 5 раз. Данные представлены в виде таблицы 3.2.

Таблица 3.3.

Массы линз из материала «Кемерон-1»

3.3.1 Результаты исследования сорбции таурина

Сорбцию таурина МКЛ изучали следующим образом: каждую линзу (предварительно насыщенная до постоянной массы водой) помещали в 2 мл препарата на разное время до полного насыщения веществом. По истечении этого времени линзы извлекали, а оставшийся раствор анализировали в соответствии с отработанной методикой, отбирая на анализ определенную аликвоту раствора. Предварительная проверка показала, что независимо от объема аликвоты, определяемые значения количества таурина в растворе после извлечения таурина одной и той же линзой практически одинаковы (табл. 3.4), что подтверждает работоспособность методики (такая проверка тождественна проверке на отсутствие систематической погрешности путем кратного увеличения размера пробы).

Таблица 3.4.

Результаты анализа раствора после сорбции таурина одной линзой из объема раствора 2,00 мл с массой таурина 86,6 мг

Изучение динамики сорбции проводилось на трех линзах, характеристики которых представлены в табл. 3.1. Для трехчасовой сорбции проведена статистическая обработка результатов (табл. 1, Приложение 1). Относительное стандартное отклонение без поправки на массу линз не превышает 5% при определении таурина, оставшегося в растворе (тп) и 8% при определении массы поглощенного таурина (т).

Результаты сорбции в статических условиях при разном времени насыщения МКЛ в растворе «Тауфона» представлены в табл. 4.5 и на рис. 3.4.

Таблица 3.5.

Результаты сорбции таурина МКЛ из объема раствора 2,00 мл с массой таурина 86,6 мг

Рис. 4.4. Кривые сорбции таурина из раствора «Тауфона»

МКЛ из материала «Кемерон-1»

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что полное насыщение препаратом линз происходит за три часа ( 15-17 мг на одну линзу). Причем за первый час извлекается более 60%, а через 3 часа достигается сорбционная емкость. Ее величина составляет около 160 мг/г (0,16 г на 1 г безводного материала). Данных по сорбции таурина МКЛ нами не найдено. Можно, однако сравнить полученную величину сорбционной емкости с приведенными в работе [28] значениями при сорбции другими материалами МКЛ аминогликозидов и цефалоспоринов из глазных капель. В зависимости от химической природы сополимеров, влагосодержания гидрогелей и исходной концентрации капель она составляет 2 - 500 мг/г. На примере сорбции гентамицин-сульфата сополимером ГЭМА-ММА показано, что при уменьшении концентрации препарата в 10 раз сорбционная емкость уменьшается также практически в 10 раз: от 22 до 2 мг/г [28].

Если провести оценку коэффициента распределения таурина между гидрогелем и раствором в состоянии равновесия согласно [30] как отношение , то его величина составит 4,6. Его величина ближе к коэффициентам распределения, приведенным в работе [31] для гидрофильных веществ, поглощаемых в пленках гидрогелей из поли-2- оксиэтилметакрилата, сшитого этиленгликольдиметакрилатом (водопоглощение около 40%). Наибольшее значение (5,84) указано для метотрексата натрия. Для гидрофобных транспортируемых веществ KD имеют в десятки раз большие значения. Авторы считают, что в гидрогеле гидрофильные вещества диффундируют и распределяются, в основном, в псевдообъемной воде.

Согласно полученным результатам для насыщения МКЛ из материала «Кемерон-1» препаратом «Тауфон» достаточно трех часов.

3.3.2 Результаты изучения десорбции таурина

Исследование десорбции проводилось на тех же линзах, характеристики которых представлены в табл. 3.1.

При изучении десорбции линзу после насыщения препаратом извлекали из раствора «Тауфона» и помещали в склянки с 2 мл бидистиллированной воды или физраствора последовательно, выдерживая линзу в каждой из склянок по 30 минут. Такой схемой пытались смоделировать смену слезной жидкости. Полученные растворы анализировали. Общее время десорбции составило 1,5 часа. Выдерживание в воде или в физрастворе (замену склянок) прекращали, когда при анализе проб значения оптической плотности соответствовали холостому опыту. Для сравнения десорбция из предельно насыщенного таурином гидрогеля на основе «Кемерон-1» осуществлялась также в суммарный объем в течение 1,5 часов. Оценка погрешности определения массы десорбированного таурина показала, что относительное стандартное отклонение не превышает 3,5%, причем десорбция в воду и физраствор происходит одинаково (табл. 2, Приложение 1).

Результаты представлены в табл. 3.6 и на рис. 3.5.

Таблица 3.6.

Результаты исследования десорбции таурина линзами после выдерживания в бидистиллированной воде

Рис. 3.5. Кривые десорбции таурина из МКЛ при указанном времени предварительной сорбции.

Полученные результаты показали, что степень десорбции таурина из МКЛ зависит от времени предварительного насыщения: при полуторачасовой десорбции она уменьшается от 52-67 до 39% в зависимости от времени сорбции (табл. 3.6, рис. 3.5). Причем, при малых временах насыщения (30 минут, 1 час) процесс десорбции идет быстрее (~50% за первые 0,5 часа) и полнее, чем при более длительном насыщении (за 2 и 4 часа - 30 и 35%, соответственно). Увеличение общего объема воды для десорбции таурина из насыщенной линзы приводит к возрастанию степени десорбции за те же 1,5 часа (табл. 3.6).

Таким образом, в данных условиях для таурина имеет место необратимая сорбция. Причиной подобного поведения может быть различие в размещении молекул таурина в объеме гидрогеля. При малых временах насыщения молекулы таурина при абсорбции диффундируют в псевдообъемной (не связанной) воде гидрогеля. Возможно также, что при этом задействован не весь объем гидрогеля. При больших временах насыщения могут иметь место более сложные процессы, обусловленные более глубоким проникновением молекул таурина в объем линзы. Возможна диффузия препарата в пограничную и связанную воду [31] гидрогеля, даже с частичным ее вытеснением вплоть до проявления специфических взаимодействий между функциональными группами полимера и молекулами таурина.

Удаление оставшегося в линзе таурина осуществляется нагреванием в склянке с водой на кипящей водяной бане в течение 20 минут с последующей заменой воды и выдерживания при комнатной температуре до восстановления массы линзы. Повторное использование линзы для исследований приводит к тем же результатам по сорбции (Приложение 1).

Если рассматривать гидрогель МКЛ как транспортное средство для доставки таурина в глаз, то можно провести простые расчеты. При инстилляционном введении препарата вводится 1,7 мг/капля или 3,3 мг/2 капли. Часть препарата сразу вымывается слезой. При постепенном поступлении таурина из насыщенной линзы может быть десорбировано 6,5 мг.

Проведенное исследование не позволяет судить о скорости поступления препарата в реальных условиях. На основании выводов работы [27] можно предположить, что она на 10-15% ниже наблюдаемой.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности пролонгированного введения препарата в ткани глаза с использованием МКЛ из материала «Кемерон-1» в качестве транспортного средства.

ВЫВОДЫ

1. Выбраны условия проведения фотометрической реакции таурина с нингидрином: растворитель нингидрина - этилцеллозольв, стабилизатор окраски - этиловый спирт (их соотношение в смеси реагентов 1:1); буферный раствор с рН 6,2; температура реакции 100єС; время нагревания 10 минут.

2. Получена градуировочная зависимость для определения таурина и определены ее характеристики: y = (8170 480)x; ymin = 0,020; xmin = сmin = 4,20·10-6 М. Диапазон определяемых концентраций 6,5·10-6 - 7,0·10-5 моль/л.

3. Установлено, что время насыщения МКЛ таурином составляет 3 часа; масса таурина, поглощенного одной линзой, составляет 15 - 17 мг.

4. Показано, что степень десорбции таурина уменьшается с увеличением степени сорбции. Для насыщенных линз она достигает ~40%, причем более 50% поглощенного таурина десорбируется за первые 30 минут.

5. Показано, что МКЛ из материала «Кемерон-1» можно использовать для местного введения препарата «Тауфон» в орган зрения.

ЛИТЕРАТУРА

Приложение 1

Таблица 1.

Статистические данные по сорбции таурина за 3 часа тремя МКЛ из раствора «Тауфона» объемом 2,00 мл с массой таурина 86,6 мг

Результаты по 3 линзам:

масса таурина, оставшегося в растворе: ()= 68,32,9; S =1,3; Sr= 4,4%;

масса извлеченного (т) таурина: ( С) = 17,9 3,2; S = 1,3; Sr = 7,3 %.

Таблица 2.

Статистические данные по десорбции таурина из насыщенных МКЛ в воду и физраствор

Средние значения по трем линзам для массы десорбированного (тв) таурина:

( С) = 11,6 1,0; S = 0,41; Sr = 3,5 %.