Диагноз уретрита у мужчин устанавливается на основании обнаружения 4 и более лейкоцитов в поле зрения микроскопа при увеличении xl000. При наличии цервицита количество полиморфно ядерных лейкоцитов повышено (более 10 при увеличении х1000). При клиническом исследовании следует принимать во внимание наличие или отсутствие слизисто-гнойных цервикальных выделений (зеленовато-желтый гной со слизью на белом ватном тампоне).

При исследовании вагинального мазка у женщин нужно помнить о том, что число лейкоцитов зависит от индивидуальных особенностей организма - от дня менструального цикла, наличия внутриматочной спирали и т.д. Поэтому для диагностикки слизисто-гнойного цервицита рекомендуется использовать оба критерия, т.е. наличие клинических проявлений и воспалительный характер цервикального мазка.

Диагноз уретрита у женщин подтверждается нахождением более 10 лейкоцитов в поле зрения при увеличении микроскопах 1000, Следует помнить, что если во влагалище и/или шейке матки имеется патологический воспалительный процесс и при этом наблюдаются выделения из влагалища, уретральный мазок всегда загрязнён материалом этих выделений (клетки плоского эпителия, лейкоциты, вагинальная микрофлора) и не годится для дальнейшей оценки, поскольку он не имеет ничего общего с уретрой.

D. Оценка результатов микроскопии окрашенных мазков.

На основании микроскопического исследования диагноз гонореи устанавливается по трем признакам гонококка:

· его форме;

· расположению;

· окраске.

Если же отсутствует хотя бы один из них, требуется культуральное исследование.

Решающее значение при микроскопической диагностике гонореи имеет учет расположения диплококков. Гонококки в основном располагаются внутри лейкоцитов и эпителиальных клеток. На основании обнаружения диплококков, расположенных вне клеток, микроскопический диагноз гонореи не ставится, требуется культуральное исследование.

Окраска гонококков (по методу Грама) - красно розовая (грамотрицательный диплококк). При этом ядра лейкоцитов и эпителиальных клеток окрашиваются т фиолетовый цвет.

Оценка мазков, окрашенных метиленовым синим

При микроскопии препарата видны:

· ядра клеток, окрашенные в синий цвет;

· цитоплазма, окрашенная в голубой цвет разной интенсивности;

· бактериальная микрофлора, окрашенная в синий цвет разной интенсивности.

Окраска метиленовым синим является ориентировочной и позволяет оценить морфологию (форму) и расположение микроорганизмов в мазке (внутри лейкоцита и на эпителиальных клетках).

Оценка мазков, окрашенных по Граму

Методика оценки мазка, окрашенного по Граму, принципиально не отличается от методики оценки мазка, окрашенного метиленовым синим. Окраска по Граму позволяет выделять в картине мазка красно-розовые (грамотрицателъные) или сине-фиолетовые (грамположительиые) элементы. Основной целью исследования является выявление грамотрицательных диплококков со специфической морфологией, а также степени выраженности лейкоцитарной реакции.

2.3.2 Культуральное (бактериологическое) исследование

Дополнительно к микроскопии окрашенных мазков бактериологическое исследование на гонорею должно всегда проводиться при обследовании:

· детей, так как у них встречается большое количество непатогенных нейссерий. особенно в полости рта, глотки и гениталиях;

· женщин, так как диагностическая чувствительность микроскопии генитальных мазков женщин низкая;

· пациентов с бессимптомной и экстрагекитальной гонореей (глотки, прямой кишки, конъюнктивы и др.);

· сексуальных контактов пациентов с доказанной гонореей (где при микроскопии не удалось выявить возбудителя);

· пациентов с гонореей после окончания лечения(не раньше 10 дней) и при снятии их с учета;

· с целью окончательной идентификации нейссерий;

· для определения чувствительности нейссерий к антибиотикам;

· в случае если будет проводиться фенотипическая и/или генотипическая диагностика N. gonorrhoeae;

· в случае сексуального насилия, при запросе следственных органов и/или судебно-медицинских экспертов.

Ответ по результатам посева при выделении чистой культуры и её идентификации выдаётся через 5 дней после взятия пробы.

A. Проведение бактериологического анализа

Подученный биологический материал необходимо сразу же поместить одновременно на селективную и неселективную питательную среду, поскольку некоторые штаммы гонококков чувствительны к концентрациям ванкомицина и триметоприма, входящих в состав селективной среды.

Культивирование гонококков следует проводить на чашках Петри диаметром 90 мм с количеством среды не менее 20 мл на чашку или 100 мм с количеством среды 26 мл. После приготовления чашек со средой они ставятся в термостат при 36±1°С на 1 час для удаления конденсата (излишней влажности). Пересушивание среды недопустимо, т.к. это отразится на качестве роста гонококков. Перед проведением посева чашки необходимо прогреть в термостате при температуре +36±1°С в течение 30 минут.

Клинический материал от каждого пациента должен засеваться на отдельную чашку Петри. При использовании больших чашек (90 или 100 мм) материал из уретры и цервикального канала у женщин может засеваться на одну чашку Петри в разные ее секторы с соответствующей маркировкой. Материал из уретры мужчин должен засеваться на отдельную чашку.

Взятый материал тампоном наносится на поверхность. Затем стерильной бактериологической петлей материал распределяется по площади поверхности питательной среды штриховыми движениями в 3 - 4 разных на правлениях с целью создания условий для роста отдельно расположенных колоний гонококков. Чашки немедленно помещаются в анаэростат с содержанием СО₂ 5±2%. влажностью 70%, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±1⁰С. Допускается использование эксикатора, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±1⁰С, в эксикаторе создаются условия повышенного содержания СО₂ при помощи свечении газогенерирующих пакетов и влажности. Чашки просматриваются через 18 - 24 часа инкубации, в случае отсутствия роста - через 48 часов:

· При отсутствии признаков роста через 72 часа инкубации наблюдение прекращают.

· При выявлении характерных колоний проводится первичная и видовая идентификация.

B. Идентификация нейссерии

Первичная идентификация нейссерии проводится путем:

· визуальной оценки вида колоний,

· окраски материала подозрительных колоний по Граму;

· оксидазного теста.

· Оценка вида колоний

Типичные колонии гонококков через 18 - 24 часа инкубации выпуклые прозрачные серо-белого цвета, имеют диаметр 0,5 - 1,0 мм. При дальнейшей инкубации колонии могут увеличиваться в размерах до 3,0 мм и уплощаться. Нередко на одной чашке можно встретить колонии разного вида.

Большие трудности возникают при идеитификации колоний гонококка в посевах из ротоглотки, т.к. при этом часто вырастают менингококки и непатогенные нейссерии, колонии которых сходны с колониями гонококков. Колонии менингококка выглядят голубоватыми, колонии непатогенных нейссерии - беловатыми, а гонококков - бесцветными, слизистыми. Размер, цвет, морфология и консистенция колоний могут варьировать в зависимости от применяемой питательной среды. Идентифицировать возбудителя можно только при определении сахаролитических свойств культур или другими тестами, подтверждающими видовую принадлежность микроорганизма.

· Применение оксидазного теста

Обнаружение оксидазоположительных грамотрицательных диплококков считается достаточным для их идентификации как N. gonorrhoeae при рутинной диагностике. Для определения цитохром-с оксидазы можно использовать один из рекомендованных методов:

· На подозрительную колонию наносится капля оксидазного реагента {тетраметилфенилендиамина, 1%-ный водный раствор). Быстрое изменение цвета реагента, в течение 5 - 10 секунд, на сине-фиолетовый и его сохранение дольше 30 секунд позволяет считать тест положительным. Реагент, используемый в оксидазном тесте, убивает гонококки, поэтому дальнейшая работа с этими колониями будет невозможна.

· Полоска фильтровальной бумаги смачивается несколькими каплями реагента, затем на нее помещается бактериологической петлей материал из подозрительной колонии. Этот способ позволяет сохранить материал на чашке для проведения дальнейших исследований. Высокая чувствительность оксидазного теста не согласуется с его специфичностыо. Оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, выделяющие цитохромную оксидазу, поэтому оксидазоположнтельные колонии микроорганизмов обязательно нужно исследовать микроскопически с окраской по Граму.

· Имеются коммерческие диски и полоски, содержащие диметил-р-фенилендиамина гидрохлорид. Платиновой петлей или стерильной стеклянной палочкой испытуемую культуру наносят на диск, предварительно слегка смоченный дистиллированной водой.

Учет результата

Темно-лиловое или синее окрашивание, появляющееся через 10 - 30 секунд, свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Отсутствие изменения цвета - об отсутствии данного фермента.

При исследовании мазков, окрашенных по Граму, из культур учитываются морфология, расположение и окраска гонококков. После 18 - 24 часов культивирования гонококки представляют собой скопления грамотрицательных кокков и диплококков, имеющих более компактное расположение микроорганизмов в центре и разреженное и неравномерное распределение по периферии.

Наряду с интенсивно окрашенными в розово-красный цвет кокками встречаются и бледно-окрашенные формы. Более старые культуры (48 часов и более) трудно интерпретировать, т.к. отмечается большое количество полностью лизированных клеток. По мере старения культуры увеличивается полиморфность гонококков.

Для подтверждающей идентификации нейссерий используются тесты:

· изучение ферментативной активности;

· иммунологические тесты (прямая иммунофлюоресценция, коагглютинация);

· молекулярно-биологические методы (ПЦР).

C. Изучение ферментативной активности

Ферментативная активность Neis. gonorrеае изучается в реакции окисления сахаров. Реакция может быть ложноположительной из-за контаминации исследуемых культур гонококков другими бактериями и ложноотрицательной при использовании гонококков, культивируемых более 24 часов (вследствие аутолиза микроорганизмов). Для предупреждения этих возможных факторов необходимо выделить чистую культуру гонококков путем пересева типичных колоний на чашки Петри с неселективной средой (шоколадный агар). Инкубация проводится в течение 18 - 24 часов.

Изучение ферментативной активности Neis. gonorrhoeae может проводиться в ростозависимых и ростонезависимых тестах. При проведении ростозависимых тестов сахара и другие субстраты (например, феноловый красный) вводятся непосредственно в питательную среду, на которой осуществляется рост гонококка. Однако в настоящее время эти тесты не могут быть рекомендованы, т.к. широко используемые ростонезависимые тесты дают возможность получить более быстрый (в течение нескольких часов) и специфический результат, позволяя идентифицировать исключительно Neis. gonorrhoeae и исключить другие непатогенные нейссерий. Существуют коммерческие наборы для изучения ферментативной активности Neis. gonorrhoeae.

Оценка проводится по изменению цвета среды: при ферментации сахаров - от красного к желтому (результат положительный). Энзимсубстратные тесты с использованием ферментов (орто-нитрофенил-бета-галактозидаза (ONPG), гамма-глютамил аминопептидаза (GLU-AMP), гидроксипролил аминосинтидаза (PIP), гидроксипролин аминопептидаза (НРА), пролин аминопептидаза (Рго-АР)) предназначены для быстрой дифференциации между N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. tacarnica и некоторыми штаммами N. cinerea и N. Catarrhalis. Результаты теста считаются положительными, если происходит изменение цвета среды - от бесцветного к желтому для ОФГ и от светло-желтого к интенсивно оранжевому для Глю-АП и Про-АЛ. Однако чувствительность и специфичиость этих быстрых энзимсубстратных тестов оказались неоптимальными.

Проведение видовой идентификации возможно также с использованием бактериологических анализаторов и коммерческих наборов реагентов.

D. Иммунологические/антигенные подтверждающие тесты

Иммунологические тесты рекомендуется использовать только в референс-лабораториях для окончательного подтверждения N. gonorrhoeae.

Иммунологические тесты с использованием моноклональных антител для прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), коагглютинации и иммуноферментного анализа являются высокочувствительными и специфичными для точной идентификации N. gonorrhoeae. Эти тесты могут проводиться с культурой нейссерий, выделенных при первичном посеве. При этом не требуется выделение чистой культуры гонококков, и изоляты могут быть идентифицированы на18 - 24 часа раньше, чем при изучении ферментативной активности N. gonorrhoea. Однако эти тесты дороже, чем ферментативные, коммерческие тест системы имеют меньший срок годности.

E. Прямая иммунофлюоресценция

Тест основан на использовании флюоресцирующих моноклональных антител против очищенного Р_roВ белка наружной мембраны гонококка, ранее называвшегося 1 или главный белок наружной мембраны гонококка. Очень важно строгое следование инструкции производителя каждого отдельного теста.

Молекулярно-биологические методы

Для выявления N. gonorrhoeae могут быть использованы ДНК/РНК методы, такие как полимеразно цепная реакция (ПЦР), а также методы, основанные на гибридизации. Однако результаты, полученные при использовании этих методов, должны оцениваться в связи с клинической ситуацией, т.к. после проведенного лечения гонореи в некоторых случаях ДНК может определяться в образцах до 2 - 3 недель после лечения.

Однако с целью получения живого микроорганизма и для определения чувствительности к антибиотикам проведение бактериологического исследования является необходимым у пациентов с клинической симптоматикой. В некоторых ситуациях молекулярно-биологические методы являются более чувствительными, чем культурадьный метод. Чувствительность культурального метода во многом определяется качеством питательной среды и условий транспортирования образца в лабораторию. При соблюдении условий транспортировки клинического материала в лабораторию, использовании качественных питательных сред, строгого проведения условий лабораторного исследования бактериаюгнческое исследование является методом выбора, и наоборот. Следовательно, выбор молекулярно-биологического или культурального метода зависит от организационных условий и качества проведения лабораторного исследования, а также от зпидемиологической ситуации в популяции. В популяции с повышенным риском распространения заболевания бактериологическое исследование является методом выбора. В популяции низкого риска, для скрининга и для исследования неинвазивных образцов, молекулярно-биологические методы подходят больше (к примеру, исследование мочи у мужчин и вагинальных образцов у женщин). Однако если метод используется для исследования популяции низкого риска и он не является высоко специфичным, возможно получение большого количества ложноположительных результатов. Молекулярно-биологические методы являются оптимальными для исследования образцов, полученных неинвазивным способом, но их чувствительность и специфичность вариабельны. Чувствительность молекулярно-биологических методов выше при исследовании образцов мочи у мужчин, по сравнению с женскими образцами. Оптимальным для женщин является исследование вагинальных материалов.

При исследовании пациентов без клинических симптомов заболевания молекулярно-биологические методы обязательно должны подтверждаться бактериологическим методом. Пока еще нет лицензированных молекулярно-биологических методов для исследования ректальных или фарингеальных образцов. ДНК/РНК-методы могут быть использованы для видового подтверждения N.gonorrhoeae из культур. Для этой цели материал, собранный петлей из специфической колонки, может быть перенесен в пробирку типа Эппендорф или любую другую пробирку со 100 мкл забуференного физиологического раствора. Однако этот тест не исключает необходимости предварительной идентификации N. gonorrhoeae.

Для проведения молекулярно-биологических методов из клинического образца необходимо выделить ДНК в соответствии с инструкцией изготовителя. Методы предназначаются для обнаружения N. gonorrhoeae в урогенитальных пробах. В большинстве случаев молекулярно-биологические методы имеют высокую чувствительность и специфичность. Однако наличие субстанций ингибиторов в некоторых образцах, а также тот факт, что у некоторых штаммов N. gonorrhoeae может не быть последовательности, являющейся мишенью для молекулярно-биологического метода, может приводить к снижению чувствительности метода. Известна недостаточная специфичность некоторых ДНК/РНК-методов, и получено большое количество ложноположительных результатов из-за перекрестных реакций с комменсальными видами нейссерий. таких как N. lactamlса, N. cinerea. N subjtava. Высокую специфичность показали новые методы ПЦР-анализа. использующие праймеры, направленные на РогА псевдоген N. gonorrhoeae. Этот ген (PorAJ/псевдо-ген подходит для дифференциальной диагностики N. gonorrhoeae и N. meningitides. Для всех экстрагенитальных образцов или для определения антибиотикочувствительности должно проводиться культивирование с последующей идентификацией нейссерий до вида.

A. Проведение анализа

Выделение ДНК и проведшие амплификации проводится строго в соответствии с инструкцией производителя диагностических наборов. Необходимо строгое соблюдение инструкций по уборке помещений и обработке поверхностей. После окончания работы рабочие поверхности должны обрабатываться ДНК/РНК деградирующими растворами для удаления ранее амплифицированных нуклеиновых кислот.

B. Интерпретация результатов

Разработка и внедрение диагностических методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, позволяют улучшить диагностику гонореи, так же как и многих других инфекционных болезней. Однако особое внимание следует уделять правильной интерпретации результатов молекулярно-биологических тестов, даже если они имеют хорошие диагностические характеристики. Это особенно важно в случае применения этих методов для скрининга гонореи в популяциях с низкой распространенностью инфекции.

2.3.4 Лабораторные критерии диагноза гонореи;

выделение Neisseria gonorrhoeae из клинического образца;

выявление антигена или нуклеиновой кисло ты N. gonorrhoeae:

обнаружение грамотрицательных внутриклеточных диплококков в мазках из уретры мужчин.

3 Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

Морфология, устойчивость и культуральные свойства хламидий

Хламидии (Chlamydia trachomatis) являются мелкими грамотрицательными микроорганизмами. Хламидии составляют группу облигатных внутриклеточных паразитов, не могут размножаться вне клетки хозяина. Наибольший тропизм хламидии проявляют к клеткам цилиндрического эпителия. Цикл развития хламидии включает две формы существования микроорганизма: элементарные тельца (ЭТ) - мелкие (0,15 - 0,2 мкм) неподвижные сферические организмы и ретикулярные (инициальные) тельца (РТ) - более крупные (около 1 мкм). ЭТ представляет собой высоко инфекционную форму возбудителя, адаптированную к внеклеточному существованию. ЭТ адсорбируется на поверхность эпителиальной клетки при помощи специфического поверхностного термолабильного эффектора, структурно связанного с типоспецифическим хламидийным антигеном и комплементарного клеточному рецептору, содержащему сиаловую кислоту. Последняя разрушается нейраминидазой и ЭТ проникает в клетку. Хламидии не имеют активного механизма проникновения в чувствительную клетку. Проникновение ЭТ осуществляется посредством фагоцитарной активности клеток, при этом происходит ингибирование процесса слияния фагосомы, в которой они находятся, с лизосомами и тем самым “выключают” важнейший защитный клеточный механизм.

В клетке начинается процесс деления ЭТ: увеличивается количество рибосом и полирибосом, визуализируется бактериальный нуклеоид, они увеличиваются в размере, появляются формы бинарного деления, формируется РТ, которое далее распадается на ЭТ. Из одного ЭТ образуется от 200 до 1000 новых “инфекционных единиц”, новых ЭТ. Обычно этот процесс длится 18 - 24 часа. Все это время возбудитель персистирует в фагосоме пораженной клетки. Вновь образовавшиеся ЭТ покидают клетку хозяина при ее разрушении, либо путем экзоцитоза, окруженные тонким ободком цитоплазмы. В последнем случае жизнеспособность клетки сохраняется. Предполагается, что данный механизм высвобождения ЭТ является одним из факторов бессимптомного и латентного течения хламидийной инфекции.

Вновь образовавшиеся ЭТ после выхода из пораженной клетки могут инфицировать новые здоровые клетки, что приводит к прогрессированию инфекционного процесса. Длительность инкубационного периода зависит от состояния организма, инфицирующей дозы, локуса поражения и может составлять в среднем от 14 до 35 дней.

В настоящее время различают по антигенной структуре 15 серотипов патогенных штаммов С. trachomatis. Так называемые “глазные” штаммы по эпидемическим особенностям и клиническим проявлениям хламидийной инфекции отличаются от “генитальных” штаммов. Первые (4 серовара С. trachomatis: А, В, Ва, С) вызывают классическую эндемическую трахому, передаются из глаз больного в глаза здорового контактным путем. Вторые (серовары от D до К) поражают отделы урогенитального тракта и передаются половым путем. Возможно инфицирование глаз “генитальными” штаммами хламидий у взрослых и детей при заносе инфицированного материала руками, полотенцами и другими бытовыми предметами, при купании, особенно в бассейнах, а также у новорожденных во время родов при прохождении через родовые пути инфицированной матери.

С.trachomatis различных серотипов имеют общий групповой, родоспецифический антиген - липополисахаридный комплекс, в состав которого входит 2-кето-3-дезоксиоктановая кислота. Данная антигенная особенность позволяет определять хламидийный антиген группоспецифической сывороткой.

Лабораторная диагностика

Диагноз урогенитального хламидиоза основывается на данных анамнеза, клинической картине и подтверждается результатами лабораторных исследований. Результаты лабораторных исследований в процессе лечения позволяют оценить адекватность проводимой терапии, а по окончанию ее оценить полноту излечения.

Диагностическая значимость результатов лабораторных исследований зависит от следующих факторов:

1. Выбор соответствующего метода лабораторного исследования;

2. Правильная подготовка пациента к исследованию;

3. Правильное взятие врачом-клиницистом биоматериала для исследования из соответствующих очагов поражения;

4. Правильная предварительная подготовка биоматериала и своевременное проведение исследования;

5. Материально-техническое обеспечение лабораторного исследования;

6. Уровень квалификации медицинского персонала, проводящего исследование.

Для диагностики хламидийной инфекции используют 4-е группы методов:

1. Культуральный метод;

2. Цитологический метод;

3. Методы, в основе которых лежат иммунологические реакции;

4. Методы, использующие принципы молекулярной биологии.

3.2.1 Культуральный метод

Культивирование С. trahomatis на перевиваемых линиях клеток млекопитающих, либо в клетках желточных мешочков куриных эмбрионов с последующей их идентификацией, является самым специфичным и наиболее чувствительным методом лабораторной диагностики хламидиоза. Культуральный метод считается “золотым стандартом”, с которым сравнивают специфичность и чувствительность всех других методов лабораторной диагностики. Для диагностики хламидиоза культуральным методом нужна специальная лаборатория, оборудованная всем необходимым для работы с культурами тканей и перевиваемыми линиями клеток, специально подготовленный высококвалифицированный медперсонал. Метод трудоемкий, требует значительного времени для получения окончательного ответа (от 3 до 14 дней и более при проведении нескольких пассажей). Поэтому до настоящего времени культуральный метод диагностики урогенитального хламидиоза не получил широкого распространения в практической лабораторной диагностике и используется в основном для научных целей, а также для сравнительной оценки специфичности и чувствительности других методов диагностики хламидиоза.

Цитологический метод

Цитологический метод лабораторной диагностики наиболее простой и доступный. Данный метод дает общее представление о цитологической картине, морфологии клеток из очага поражения, наличии микробного обсеменения, мицелия грибковой флоры и простейших. Специфические морфологические признаки позволяют определить наличие хламидий в препарате.

Препарат фиксируют метиловым спиртом (5 мин), либо 96% этиловым спиртом (5 мин), либо смесью Никифорова (1 часть этилового спирта и 2 части этилового спирта - 5 мин), либо охлажденным безводным ацетоном (3 - 5 мин).

После фиксации высушенные мазки окрашивают по Романовскому-Гимзе или по Маккиавело.

Окраска по Романовскому-Гимзе: краску Романовского-Гимзе разводят в соотношении 1:10 фосфатным буфером с рН 7.2 - 7.6 (1 часть краски и 9 частей фосфатного буфера) и наносят на мазок на 1 - 2 часа, далее препарат промывают под проточной водой, прополаскивают дистиллированной водой, дифференцируют, погружая на 1 - 3 секунды в 96% этиловый спирт, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы при общем увеличении микроскопа в 900 - 1500 раз (ок. 10-15, об. 90-100).

При микроскопии ЭТ хламидий представляют собой мелкие (0.15 - 0.3 мкм) образования округлой формы, окрашенные в розовый или красноватый цвет. Они могут находиться как внеклеточно (преимущественно), так и внутриклеточно. Более крупные РТ (0.5 - 1.5 мкм) окрашиваются в различные оттенки от голубого до темно-синего цвета и находятся внутриклеточно, при микроскопическом исследовании они обнаруживаются в виде скоплений вокруг ядра эпителиальной клетки в форме “шапочки жандарма” или диффузно.

Ядра клеток при данной окраски имеют вишневый оттенок различной интенсивности, а цитоплазма прокрашивается в нежно-голубой цвет.

Окраска по Маккиавелло: мазок-отпечаток на предметном стекле фиксируют над пламенем горелки несколько секунд и далее окрашивают 0.25% раствором основного фуксина в течение 5 минут. Затем краску смывают под проточной водой. Препарат помещают на несколько секунд в 0.5% раствор лимонной кислоты и затем промывают под проточной водой. Последний этап - дополнительное окрашивание 1% раствором метиленового синего в течение 20 - 30 сек, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы при общем увеличении микроскопа в 900 - 1500 раз.

Ядра клеток окрашиваются в бледно-розовый цвет, цитоплазма - в нежно-голубой. РТ (внутриклеточные) окрашиваются в различные оттенки голубого цвета (от светлого до темного), ЭТ имеют красноватый цвет и могут находиться как внутриклеточно, так и внеклеточно (преимущественно).

Цитологические методы просты в выполнении, дешевые, не требуют сложного оборудования, больших временных затрат, специальной подготовки и дополнительных навыков у лаборантов и врачей-лаборантов, владеющих техникой световой микроскопии. Однако их диагностическая значимость очень низкая: у больных мужчин диагностировать хламидийную инфекцию цитологическим методом в соскобах из уретры удается лишь в 10 - 15% случаев, а у женщин - до 30 - 40% случаев (в соскобах из цервикального канала).

В тоже время цитологический метод позволяет выявить неспецифические морфологические изменения эпителиальных клеток, которые могут косвенно свидетельствовать о наличии поражения урогенитального тракта, в том числе и хламидийной этиологии. Нормальные эпителиальные клетки имеют круглое ядро диаметром 10 - 15 мкм, цитоплазма при окраске по Романовскому-Гимзе прокрашивается в голубой цвет, хроматин - в пурпурный. Сама клетка - округлой формы, диаметр ее достигает 20 - 25 мкм. В соскобах у больных с хламидийной урогенитальной инфекцией могут быть следующие морфологические изменения эпителиальных клеток: клетки увеличены в размере, диаметром до 30 мкм и более, цитоплазма их нередко вакуолизирована, может иметь включения различного размера - от 0.3 до 0.5 мкм и более. Иногда можно наблюдать клетки с явлениями фагоцитоза. В клетках происходит изменение морфологии ядра: отмечается полиморфизм, макронуклеоз - увеличение ядра до 15 мкм и более, полинуклеоз (2 и более ядер в клетке). В соскобах также могут встречаться лимфоциты, полиморфноядерные лейкоциты, плазмоциты и мононуклеарные клетки. Выраженность морфологических изменений часто коррелирует с выраженностью патологического процесса.

Описанные клеточные изменения могут служить косвенным признаком хламидийной инфекции. Цитологический метод пригоден для проведения массовых и первичных обследований урологических и гинекологических больных с последующим обследованием их более специфическими и диагностически значимыми методами при получении патологических или сомнительных результатов.

Методы, в основе которых лежат иммунологические реакции

Данная группа методов основана на комплементарном взаимодействии специфического антигена (АГ) с антителом (АТ) с последующим проявлением продукта флюорохромом или посредством цветной биохимической реакции.

При диагностике урогенитального хламидиоза можно определять в биологическом материале либо наличие родоспецифического (группового) антигена (в моче, отделяемом половых органов, в материале из соскоба), либо специфические антихламидийные антитела - иммуноглобулины различных классов: А, М, G - в сыворотке крови. Для этого используют два основных метода: иммуноферментный анализ (ИФА) и реакцию иммунофлюоресценции (РИФ).

A. ИФА

ИФА известен давно и широко применяется для диагностики в инфекционной патологии. В настоящее время на рынке диагностических тест-систем предлагается большое количество наборов как зарубежных, так и отечественных фирм-производителей. Методом ИФА определяют наличие и титр (либо количество) противохламидийных антител - иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови обследуемого. Хламидии обладают слабой антигенной активностью, вследствие чего выработка и накопление антител в организме происходит в малых количествах. Кровь для исследования следует брать в период ярких клинических проявлений преимущественно системного характера. Сыворотку, полученную после центрифугирования, при необходимости можно хранить при +4 - +8°С до 5 дней, либо при -20°С 1 месяц. Рекомендуется исследовать парные сыворотки для выявления динамики титра антител в процессе течения заболевания и проводимого лечения. Наборы ИФА-метода содержат в своем составе положительный и отрицательный контроли, по соотношению с которыми судят о наличии или отсутствии специфических антител и их количестве в сыворотке крови обследуемого. Методика постановки ИФА приводится в инструкции к каждому конкретному набору и включает этапы:

1. Инкубация соответствующего разведения сыворотки крови обследуемого на планшете (или с шариком в пробирке) сенсибилизированным родоспецифическим хламидийным антигеном для взаимодействия с ним специфических противохламидийных антител (иммуноглобулинов) - образование комплекса антиген-антитело (АГ - АТ);

2. Отмывание планшета (шарика) от непровзаимодействовавших иммуноглобулинов;

3. Инкубация образовавшегося комплекса АГ-АТ с антисывороткой к иммуноглобулинам человека (общим или какого-либо определенного класса, в зависимости от того - определяется ли просто факт наличия АТ к хламидиям или наличие АТ, относящихся к определенному классу иммуноглобулинов А, М, G), меченой ферментом;

4. Отмывание планшета (шарика) от непровзаимодействовавших меченых антител;

5. Проведение ферментативной биохимической реакции в результате которой образуется цветной продукт. Интенсивность окраски раствора соответствует количеству фермента в реакционной смеси, следовательно количеству образовавшихся комплексов АГ-АТ, число которых определяется содержанием противохламидийных антител в сыворотке крови обследуемого. Количество окрашенного продукта промеряют на ридере (специальный фотоколориметр).

В последнее время появились ИФА тест-системы, в которых на 3 этапе используют антитела, меченые флюорохромами. В этом случае 5 этап не проводят, количество антихламидийных антител определяют измерением свечения образовавшихся сложных комплексов АГ-АТ-меченое АТ на ридере флюориметре.

Некоторые фирмы предлагают ИФА тест-системы для обнаружения хламидийного антигена в отделяемом, соскобах из урогенитального тракта и других локусов (конъюнктива, слизистая прямой кишки и пр.). Биоматериал берут специальными зондами и помещают в транспортную среду для хранения и предварительной обработки. Дальнейшее проведение анализа имеет те же этапы, как при исследовании сыворотки крови. Обнаружить хламидийный антиген ИФА методом удается у 50-70% больных.

ИФА методы диагностики хламидийной инфекции получают все более широкое распространение в последнее время. Но необходимо отметить, что наличие противохламидийных антител в сыворотке крови свидетельствует о контакте организма с хламидиями. Обнаружить антихламидийные АТ удается лишь у 55 - 65% больных, количество ложноположительных результатов может составлять 2 - 5%. Уровень антител зависит как от иммунореактивности организма, так и от скорости их элиминации из организма. Поэтому постановка диагноза хламидиоза по единичному анализу возможна лишь при наличии высокого титра противохламидийных антител преимущественно IgМ класса. Наиболее корректно использовать определение уровня противохламидийных АТ для оценки динамики течения заболевания и корректности проводимой терапии. Для этого проводят исследование парных сывороток крови. Четырехкратное и более увеличение титра АТ свидетельствует об обострении или прогрессировании заболевания. Снижение титра антител в процессе лечения свидетельствует об адекватности и эффективности проводимых лечебных мероприятий. Противохламидийные АТ могут сохраняться в организме после излечения до года и более.

ИФА методы сравнительно просты в выполнении, не требуют значительных временных затрат (время реакции от момента взятия материала до получения ответа составляет 1.5 - 3.5 часа). Однако для их выполнения необходим комплект оборудования для проведения ИФА (инкубатор, шейкер, вошер, ридер и набор автоматических микродозаторов), соответствующее помещение и подготовка медицинского персонала. Диагностическая значимость (специфичность и чувствительность) ИФА при урогенитальном хламидиозе составляет 50 - 70% по сравнению с культуральным методом.

B. РИФ

Реакция иммунофлюоресценции основана на взаимодействии противохламидийного АТ с родоспецифическим хламидийным антигеном. Существует два типа реакции иммунофлюоресценции - прямой и непрямой. В первом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования. Во втором случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса АГ-АТ, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к антихламидийным антителам. Результат реакции оценивают визуально при помощи люминисцентного микроскопа.

Помимо импортных появились отечественные наборы для диагностики хламидийной инфекции реакцией прямой иммунофлюоресценции, которые практически не уступают по специфичности и чувствительности, но имеют значительно более низкую цену.

Материалом для исследования служат мазки-отпечатки, приготовленные с соблюдением правил. Мазки для РИФ готовятся на специальных деколированных стеклах в пределах ограниченной площадки диаметром 8 - 10 мм. После этого их высушивают на воздухе и фиксируют, погружая на 5 - 10 минут в холодный 96% (лучше абсолютный) этиловый спирт или нанося на препарат 0.1 - 0.15 мл охлажденного безводного ацетона до полного его испарения. Фиксированные препараты можно исследовать сразу или при необходимости хранить при комнатной температуре в течение суток или при -20°С в течение 2 недель (при этом необходимо исключить доступ влаги при хранении и доведении препарата до комнатной температуры перед исследованием при помощи полиэтиленового пакета и селикагеля).

При проведении прямой РИФ на препарат наносят раствор меченых антител в количестве, необходимом для полного покрытия мазка (25 - 30 мкл). Препарат инкубируют в горизонтальном положении во влажной камере в течение 15 минут при +37°С. Подсыхание реагента недопустимо во избежание ложноположительных результатов. Далее мазок промывают в проточной воде 30 сек, прополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и готовят к микроскопии.

При проведении непрямой РИФ на препарат наносят необходимое количество раствора антихламидийных антител и проводят первую инкубацию в тех же условиях, что и при проведении прямой РИФ. Затем препарат промывают, высушивают на воздухе и наносят второй реагент - меченые антитела к хламидийным АТ и проводят вторую инкубацию так же во влажной камере при +37°С 15 минут. После промывания препарат высушивают и готовят к микроскопии. Готовые препараты рекомендуется просматривать сразу. При необходимости возможно хранение окрашенных препаратов в течение 1 - 2 суток при +2-8°С в темном месте без доступа влаги.

Микроскопию проводят с использованием иммерсионной системы. Возможны два варианта иммерсионной микроскопии:

1. Масляная иммерсия: На готовые высушенный препарат наносят 20 - 25 мкл монтирующей жидкости (глицерин, забуференный фосфатным буфером с рН 7.2 - 7.6), покрывают его обезжиренным покровным стеклом, на которое затем наносят каплю нефлюоресцерующего иммерсионного масла и микроскопируют объективом (маркировка “Л” - люминисцентный) с увеличением 90 и окуляром с увеличением 5.

2. Водная иммерсия: на готовый препарат наносят каплю 20 мкл фосфатного буфера с рН 7.4 и микроскопируют объективом для водной иммерсии (маркировка - белая полоса и “Л” - люминисцентный) с увеличением 60 и окуляром с увеличением 5. Водная иммерсия дает более ровное, яркое и четкое свечение.

РИФ позволяет выявлять антигенные структуры как элементарных, так и ретикулярных телец. ЭТ расположены преимущественно внеклеточно, округлой формы с ровными краями, мелкие (размер 1:100 - 1:150 по отношению к окружающим их клеткам), однородной структуры, имеют яркое специфическое изумрудно-зеленое свечение, которое при работе микровинтом может давать дифракционные кольца (кольца Дилекторского). РТ встречаются значительно реже, располагаются преимущественно внутриклеточно, имеют менее однородную структуру, более полиморфны, но также с четкими краями и обладают ярким специфическим изумрудно-зеленым свечением. Любой другой флюоресцирующий материал неправильной формы, неровными нечеткими краями, имеющий неяркую зеленую окраску, либо свечение другого цвета относится к артефактам. Интенсивность, яркость и оттенок специфического свечения зависит от рН монтирующей жидкости или буфера используемого для микроскопии. Большая интенсивность свечения ФИТЦ в щелочной среде увеличивает чувствительность метода, но ведет к увеличению числа объектов с неспецифическим свечением, а, следовательно, к ложноположительным результатам. В кислой среде интенсивность свечения ФИТЦ падает, что может дать ложноотрицательный результат. Сопутствующая микрофлора, а также ядра окружающих клеток неспецифически окрашиваются в различные оттенки оранжевого цвета бромистым индием, их цитоплазма - в различные оттенки кирпично-коричневого цвета синькой Эванса.

Для получения достоверного результата рекомендуется просматривать многие поля зрения препарата. Результат считается положительным в том случае, если препарат содержит клетки эпителия и удается обнаружить не менее 6 элементарных телец, имеющих все вышеперечисленные признаки.

Обнаружение меньшего количества возбудителя делает результат сомнительным и требует повторного исследования, желательно на фоне провокации (пищевая - алкоголь, медикаментозная - инъекция пирогенала, механическая - массаж уретры на буже). Контроль излеченности следует проводить не ранее чем через две недели, так как возможно сохранение не элиминированного антигенного материала нежизнеспособного возбудителя, что будет давать ложноположительные результаты. Получение 3 отрицательных результатов исследования у мужчин в течение месяца и у женщин в течение 3 менструальных циклов, отсутствие клинических проявлений хламидийной инфекции свидетельствует о выздоровлении.

РИФ при правильной подготовке пациента, соблюдении правил взятия материала и постановки реакции является высокочувствительным и специфичным методом диагностики урогенитального хламидиоза и позволяет выявлять возбудителя у 90 - 95% больных. Данный метод относительно дешев, прост в выполнении, высокоинформативен, не требует специального дорогостоящего оборудования, позволяет быстро получить результат (0.5 - 1 час) и визуально контролировать качество взятия материала для исследования.

Методы, использующие принципы молекулярной биологии

В группу входят методы ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые позволяют выявить генетический материал возбудителя в исследуемом биоматериале. Наборы для диагностики хламидиоза ДНК-зондами находятся пока на стадии разработки и клинических испытаний.

ПЦР активно внедряется в практику лабораторной диагностики. Метод основан на выделении специфической последовательности ДНК или РНК возбудителя при помощи комплементарных праймеров, последующего ее многократного копирования и накопления для дальнейшего выявления обычными методами детекции (электрофорез или ИФА). Данный метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, практически приближающейся к культуральному и позволяет обнаружить единичных возбудителей в исследуемом материале. Метод ПЦР требует специального дорогостоящего оборудования, отдельной специально оснащенной лаборатории, соответствующей подготовки и высокой квалификации медицинского персонала. Вместе с тем, отсутствие сертификации используемых в России праймеров и достаточного опыта применения метода ПЦР, специфичность исследуемого материала, частая его контаминация сопутствующей микрофлорой (что может давать ложноположительные результаты) не позволяет однозначно судить о его ценности при диагностике урогенитального хламидиоза.

Таким образом, в настоящее время наиболее доступным, простым и в то же время высокоинформативным методом диагностики урогенитального хламидиоза и установления излеченности является реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ). Контроль за динамикой течения заболевания и эффективностью лечения следует проводить, определяя титр антихламидийных антител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА).

4 Урогенитальный трихомониаз

Урогенитальный трихомониаз - широко распространенное инфекционное воспалительное заболевание, передаваемое преимущественно половым путем, вызывается простейшими Trichomonas vaginalis.

Трихомонады являются жгутиковыми эукариотами и относятся к простейшим из класса Flagellata, семейства Trichomonadida, рода Trichomonas. В человеческом организме паразитируют 3 вида трихомонад: Trichomonas intestinalis - кишечная трихомонада, Trichomonas elongata (tenax, buccalis) - ротовая трихомонада и Trichomonas vaginalis - влагалищная трихомонада. Только Tr. vaginalis поражает урогенитальный тракт и является патогенной для человека, вызывая воспалительные заболевания: уретрит, простатит, эндоцервицит, вагинит, бартолинит и т.д.

Биологические свойства Tr. vaginalis

Влагалищные трихомонады являются одноклеточными простейшими. Форма их вариабельна, чаще грушевидная - в нативных препаратах (висячая капля), но наряду с этим могут наблюдаться овальные, шарообразные, несколько удлиненные - веретенообразной формы. Длина тела влагалищной трихомонады колеблется от 5 до 30 мкм, ширина - 5 - 8 мкм. Она покрыта оболочкой - пелликулой. Тело влагалищной трихомонады состоит из цитоплазмы, ядра, парабазального тела, блефаропласта, ризопласта, аксостиля, ундулирующей мембраны, краевой и парабазальной фибриллы и жгутиков. Цитоплазма состоит из тонкозернистой массы. Ядро продолговато-овальной формы, расположено в передней трети тела. Впереди ядра, на переднем конце тела трихомонады, находится блефоропласт, от которого берут начало направляющиеся вперед 4 свободных жгутика. Они выполняют роль органоидов движения и принимают участие в захватывании пищи. Обнаружение жгутиков при просмотре нативных препаратов служит дифференциально-диагностическим признаком влагалищных трихомонад от других элементов материала (лейкоциты, эпителиальные клетки). Степень подвижности жгутиков отражает биологическую активность возбудителя. В окрашенных препаратах жгутики трудно различимы, что обусловлено их хрупкостью и повреждением при фиксации и окраске препарата.

Влагалищные трихомонады размножаются делением, как простым продольным делением на две части, так и множественным. Полный цикл деления занимает от 0.5 до 1.5 - 3 часов. Перед делением движение трихомонады замедляется, разделяется блефаробласт и жгутики, число которых удваивается. Далее делится ядро, дочерние ядра расходятся к противоположным полюсам. После перешнуровки цитоплазмы образуются две новые особи.

Трихомонады являются факультативными анаэробами. Оптимум роста наблюдается при +37°С. Они легко культивируются в питательных средах в присутствии или отсутствии других микроорганизмов.

Встречаются штаммы влагалищных трихомонад, которые авирулентны для их носителей и не вызывают у них видимых клинических реакций со стороны слизистых мочеполовых органов. Однако, при передаче их в процессе полового акта партнеру с переменой условий обитания они становятся патогенными и вызывают развитие воспалительного процесса в слизистой мочеполовых органов. Возможен переход асимптомной формы трихомониаза в манифестную при нарушении равновесия между макроорганизмом и влагалищной трихомонадой вследствие изменения реактивности организма, происходящим при инфекционных заболеваниях, переохлаждении, переутомлении, изменении гормонального статуса, при действии нервно-психических травм и других стрессорных факторов, приводящих к снижению как местной, так и общей иммуннорезистентности.

Инвазия влагалищной трихомонады способствует переходу постоянных сапрофитов уретры и влагалища у здоровых лиц в вирулентное состояние, что ведет к усилению токсигенного воздействия на ткани органов урогенитального тракта. В результате этого развивается смешанный трихомонадно-бактериальный воспалительный процесс, в котором первичным этиологическим агентом является Tr. vaginalis.

Вагинальные трихомонады способны фагоцитировать бактерии и другие частицы, которые затем перевариваются. Однако возможна персистенция бактерий (гонококков) внутри трихомонады, что способствует их длительному существованию в организме в скрытом, недоступном для антибактериальной терапии состоянии.

Влагалищные трихомонады могут сохранять жизнеспособность в неразведенных выделениях или в культурах, разведенных физиологическим раствором, или в других солевых растворах в течение нескольких часов, однако они плохо переносят гипотонические растворы, а высушивание и температура свыше 45°С убивает их мгновенно.

4.2 Лабораторная диагностика

Для обнаружения Tr. vaginalis используют следующие основные методы:

1. Микроскопия нативных препаратов;

2. Микроскопия окрашенных препаратов;

3. Культуральный метод;

4. Иммунологический метод.

4.2.1 Микроскопия нативных препаратов

При микроскопии нативных препаратов, возбудителя обнаруживают по его специфическому движению среди клеточных элементов и микроорганизмов в препарате, приготовленном непосредственно перед исследованием. Просмотр влагалищной трихомонады в нативных препаратах проводят методом раздавленной капли - “капли-суспензии” и реже методом “висячей” капли.

При приготовлении препарата “капли-суспензии” на сухое, обезжиренное и предварительно прогретое до 37°С предметное стекло наносят каплю теплого физиологического раствора хлорида натрия и смешивают в нем исследуемое отделяемое из очага заболевания (теплый физиологический раствор активирует влагалищную трихомонаду и увеличивает ее подвижность). Взвесь накрывают покровным стеклом, избегая образования воздушных пузырьков в препарате. Избыток жидкости, вышедшей за границы покровного стекла удаляют фильтровальной бумагой. Смывы со слизистой уретры, влагалища и негустые осадки центрифугатов, полученных на физиологическом растворе, а также культуры трихомонад, выделенные на жидких средах исследуются в нативных препаратах без дополнительного разведения.

При приготовлении препарата “висячая капля” на середину покровного стекла, края которого предварительно смазываются вазелином, наносится теплый (37 - 38°С) физиологический раствор, к которому добавляется исследуемый материал, осторожно перемешивается. Покровное стекло переворачивают и накладывают каплей вниз над лункой специального предметного стекла для просмотра “висячей капли”. Капля должна свободно свисать в углублении предметного стекла, не соприкасаясь с его краями и дном.

Ввиду того, что при длительном пребывании препаратов при комнатной температуре трихомонады теряют подвижность, исследование следует проводить возможно быстрее после получения материала (в течение не более 1 часа).

Исследование нативных препаратов проводят под микроскопом с естественным или искусственным освещением немедленно после его приготовления при общем увеличении 280 - 400 раз (объектив 40, окуляр 7 или 10). Влагалищная трихомонада определяется по грушевидной, округлой или овальной форме тела по размерам близким к лейкоцитам. Она имеет характерные толчкообразные движения ундулирующей мембраны и жгутиков, которые особенно хорошо видны при исследовании в микроскопе с темнопольным или фазовоконтрастным конденсором. Трихомонады совершают активные движения поступательного и вращательного характера.

При исследовании нативных препаратов влагалищные трихомонады трудно отличимы от жгутиковых семейства бодонидов, которые могут быть занесены в препарат из воды, загрязненной посуды и т.д. В отличие от трихомонад, бодониды имеют 2 жгутика и быстро двигаются по прямой. К ошибкам может привести наличие в препарате подвижных бактерий, которые, прикрепляясь к лейкоцитам, создают впечатление большого количества подвижных трихомонад.

Метод нативных препаратов высоко специфичен. Однако обнаружить в них влагалищные трихомонады можно лишь при наличии жизнеспособного возбудителя с активной подвижностью, что достигается технически правильным взятием материала и своевременным его просмотром. Чувствительность метода снижена при бессимптомном течении заболевания. Измененные формы трихомонад, неподвижные особи редко выявляются данным методом.