Дослідження антагоністичних властивостей сучасних пробіотиків

1.2 Антагоністичні властивості пробіотичних препаратів

Поряд із підсиленням протиінфекційного імунітету молочнокислі бактерії виявляють також і протипухлинну активність. Протипухлинна активність пробіотиків та їх вплив на кишкову моторику є результатом непрямої дії. Одним із напрямків є руйнування ферментів, таких як азотредуктаза, нітроредуктаза, які переводять проканцерогени в канцерогени [48]. Інша точка зору полягає в тому, що живі або вбиті нагріванням лактобактерії індукують в організмі зростання активності макрофагів, лімфоцитів, виключаючи синтез ендогенних цитотоксинів та пухлино-некротизуючого фактору (TNF). Таким чином, дія на пухлину може здійснюватись як за рахунок прямої цитотоксичної діїї, так і щляхом стимуляції імунних механізмів. Нарешті, пробіотичні штами знижують рівень мутагенів у фекаліях, можливо шляхом зв`язування або сорбції мутагенів на бактеріальних клітинах [49].

І.Г. Богдановим одним із перших in vivo на мишах з саркомою 180, карциномою Ерліха, меланомою В-16 та аденокарциномою АСОТОЛ установленні протипухлинні властивості L.delbrueckii, коли введення культурального фільтрату призводило до повного зникнення пухлин майже у 50% лабораторних тварин [49,50]. Ним було запропоновано декілька лікарських засобів із L.bulgaricus. Із клітинної фракції лактобацил було виділено три глікопептиди: 1,2 та 10кД. Один з найбільш активних препаратів отримав назву бластолізин.

Протипухлинну дію встановлено також і при використанні інших видів лактобактерій, наприклад, L.casei. Субстанцією цих бактерій особливо успішно лікували мишей за введенням її підшкірно в область лімфатичних вузлів, які дренували пухлину.

При лікуванні хворих з різними локалізаціями злоякісних пухлин хіміо- чи променевою терапією рекомендується використовувати молочнокислі бактерії, які значно покращують загальний стан хворих та знижують побічні дії лікарських засобів.

Епідеміологічні дослідження багатьох країн світу показали, що виникнення раку товстого кишечника спостерігається більше в популяції людей, які споживають західні рафіновані дієти, порівняно з тим, що вживають вегетаріанські та молочнокислі продукти. Було відмічено, що у пацієнтів з раком товстої кишки в фекаліях знаходиться в середньому на порядок менше молочнокислих бактерій. У людей з високим ризиком рака товстої кишки переважали Bifidumbacterium, Peptococcus, Clostridium, а в людей з малим ризиком виникнення раку товстої кишки домінували Bac.pneumoniae, Lactobacilus[51].

На значній виробці хворих виявлено, що ризик виникнення раку молочної залози позитивно корелював з частотою вживання жирних сирів та молока корів і негативно - з частотою вживання йогуртів з живими лактобацилами.

В останні роки спороутворюючі бактерії роду Bacillus як найбільш відомі представники екзогенної мікрофлори привертають увагу дослідників. Досить великий арсенал видів цього роду використовувався в якості терапевтичних речовин при лікуванні гострих і хронічних інфекцій: B.cereus, B.polymyxa, B.brevis, B.megaterium, B.pumilus, B.coagulans та ін. Однак найбільш розповсюдженні і вивчені види B.subtilis i B.licheniformis [52].

Ці мікроорганізми завдяки високим адаптивним властивостям широко розповсюдженні в природі і зокрема в тих об`єктах, з якими людина контактує найбільш близько. Завдяки цьому бацили постійно і в значній мірі кількості потрапляють в організм людини і, оскільки є стійкими до літичних і травних ферментів, зберігають життєдіяльність напротязі всього ШКТ.

Серед різних представників екзогенної мікрофлори бацили характеризуються рядом переваг, які дозволяють вважати їх найбільш ефективними в якості нових біопрепаратів:

ці бактерії (окрім B.anthracis і B.cereus), як правило, є нешкідливими для макроорганізму навіть у концентраціях, які значно перевищують рекомендовані для вживання;

при пероральному вживанні ці мікроорганізми істотно підвищують неспецифічну резистентність макроорганізм;

антагоністична активність їх більш виражена і проявляється до більш широкого спектру патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, ніж у інших представників екзогенної і ендогенної мікрофлори.

бацили характеризуються високою ферментативною активністю, яка дозволяє їм регулювати і стимулювати травлення, виявляти протиалергійну і антитоксичну дію;

ці мікроорганізми стабільні при зберіганні;

вони екологічно безпечні [53, 54, 55].

Бацили не формують біоплівок, оскільки їх адгезивні властивості слабо виражені. Їх активність проявляється в кишечнику і пов'язана перед усім не з конкурентними взаєминами за місця прикріплення до слизової, а з високою антагоністичною активністю у відношенні до багатьох патогенних бактерій. В той самий час бактерії роду Bacillus не виявляють антагоністичної дії на представників нормальної мікрофлори, що створює умови для безконкурентного відновлення мікрофлори [55].

Антимікробна активність аеробних спороутворюючих бактерій роду Bacillus може бути обумовлена літичними ферментами, які вони синтезують. Так, деякі вчені виділили із B. subtilis еластазу, яка надає літичної дії на грамнегативні та грампозитивні мікроорганізми.

Завдяки високій і різноманітній ферментативній активності бактерій роду Bacillus, які входять до складу біопрепаратів-пробіотиків, можуть відігравати суттєву роль в стимуляції і збагаченні травної системи хазяїна необхідними ферментами [56,57]. Так, наприклад, бацили характеризуються вираженою амілолітичною активністю, причому деякі амілази відрізняються тим, що при гідролізі крохмалю, який каталізують ці ферменти, утворюються сахара б-конфігурації і олігосахара не більше мальтотетрози. Характерною для бацил являється висока протеолітична активність. Із культуральної рідини B.subtilis виділили протеолітичний фермент, який володіє властивістю стимулювати регенераційні процеси. Інший протеолітичний фермент із бацил являється тромболітичним препаратом, який проявляє свою активність навіть при пероральному вживанні. Цікаво, що деякі ферменти бацил зберігають активність навіть в неживих клітинах.

Позитивну роль відіграє здатність бацил продукувати в значних кількостях екзоцелюлярні амінокислоти, в тому числі і незамінні (треонін, аланін, тирозин, гистидин, валін та ін.). Важливою також являється вітамінсинтезуюча активність бактерій роду Bacillus.

Наявність бацил в пробіотичній суміші мікроорганізмів сприяло значно ефективніше зниженню холестерина в крові тварин, чим при їх відсутності. На дослідах також спостерігали більш виражену здатність зв'язувати жирні кислоти і зменшувати утворення холестеринових міцел при наявності бактерії роду Bacillus[58].

Отже, аеробні спороутворюючі бактерії роду Bacillus - перспективна група мікроорганізмів для створення нових високоефективних біопрепаратів. По-перше, вони характеризуються найбільш вираженою антагоністичною активністю по відношенню до патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів. По-друге, відомо, що на основі аеробних спороутворюючих бактерій можна отримувати штами із заданими властивостями, оскільки ці бактерії являються досить гарно вивченою системою для клонування.

Ряд робіт присвячено пробіотикам на основі представників роду Aerococcus [59], а також про використання дріжджів для виробництва пробіотиків. Так, лікування препаратом, до складу якого входили Saccharomyces boulardii, виявилось ефективним при кишкових інфекціях обумовлених Clostridium dificile. Виражений клінічний ефект отримали також при використанні Saccharomyces cerevisiae.

Вище викладене свідчить, що спектр мікроорганізмів складових пробіотичних препаратів досить широкий. Звичайно, найбільш поширеними серед них є молочнокислі бактерії, як одна із широко розповсюджених у біосфері груп мікроорганізмів. Вивчення молочнокислих бактерій як антагоністів патогенної та умовно-патогенної мікрофлори, грибів та вірусів має велике значення для підтримки гомеостазу організму людини, який в значній мірі обумовлений станом мікрофлори, створеної по ходу еволюційного процесу симбіонтного та природного відбору.

Дослідження по визначенню антимікробної активності молочнокислих бактерій дозволяють виявити індивідуальні особливості кожної культури, що представляється значимим для подальшого вивчення природи і механізму дії бактеріоцинів. Знання антагоністичних властивостей кожної культури, оптимальних умов для їхнього максимального прояву необхідне при складанні рецептури лікувально-дієтичних продуктів із заданими властивостями. Участь симбіонтів біопрепаратів у формуванні імунологічного статусу відкриває перспективи застосування їх при хворобах інших систем організму, окрім кишкового тракту.

1.3. Використання пробіотиків для підтримання нормобіоценозу людини

Фундаментальні дослідження сучасної біологічної та медичної наук дозволили розробити і впровадити в практику біопрепарати, домінуюче положення в яких займають препарати з живих непатогенних бактерій - представників нормальної мікрофлори - пробіотики (еубіотики). Піонером цього напрямку був І.І.Мечніков, який обгрунтував споживання ферментованого молока, виділив і застосував для ферментації лактобацилу, яка дійшла до нашого часу як Bulgarian bacillus. Після наукового обгрунтування І.І.Мечніковим позитивного впливу на організм людини ферментованого молока та простеження антагоністичного ефекту між штамами бактерій, в мікробіології розпочався етап використання мікробів для посилення захисту від інфекійних хвороб. Останні десятиріччя, враховуючи зростаючий інтерес в суспільстві до здорового способу життя, повязанні з вивченням ферментованих продуктів як пробіотичних препаратів, а використання живих мікроорганізмів - із створенням стратегії пробіотиків.

Термін “пробіотик” був введений в 1965 році Lilley, Stillwell. R.Parker в 1974р. використав цей термін для обозначення живих мікроорганізмів. Пізніше R.Fuller сформулював це поняття як “добавка до корму, що містить живі мікроорганізми, яка позитивно діє на організм тварин, внаслідок чого виздоровлює мікрофлора кишечника”. Це визначення було застосовано й до організму людини і отримало широке розповсюдження в якості збірного поняття, що об`єднує живі мікроорганізми, які поступають в ШКТ та покращують життєдіяльність хазяїна за рахунок нормалізації його мікробної екосистеми [4].

Неперетравленні харчові добавки іншого походження, які мають позитивну дію на організм хазяїна через селективну стимуляцію росту і/або активності представників нормальної мікрофлори кишечника, R.Fuller пропонує називати пребіотиками. В якості пребіотиків розглядаються біфідобактерії, рідше - Lactobacillus, а по даним деяких авторів - і E.faecium [44]. Автор концепції пред`являє до пребіотиків наступну вимогу, вони не повинні гідролізуватись і абсорбуватись у верхніх відділах ШКТ.

Шендеров проаналізувавши речовини, які здатні стимулювати ріст нормальної мікрофлори, і запропонував розділити пребіотики на наступні групи:

моносахариди і спирти (ксилоза, ксилобіоза, рафіноза, сорбіт);

олігосахариди (лактулоза, фруктоолігосахарид, галактоолігосахарид,

ксилоолігосахарид);

полісахариди (пектини, декстрин, інуліні ін.);

ферменти (в-галактозидаза мікробного походження, протеази сахароміцетів і ін.);

пептиди (соєві, молочні);

антиоксиданти (вітаміни групи В, вітамін Е, аскорбінова кислота), а також інші біологічно активні добавки - амінокислоти, рослинні екстракти, органічні кислоти і т. д. [52]

Більшість спеціалістів і дослідників відносять до бактерій-пробіотиків в основному так звані еубіотики (представники нормальної мікрофлори шлунку) і частіше всього біфідобактерії і молочнокислі мікроорганізми роду Lactobacillus, називаючи їх класичними пробіотиками. Це пов'язано з тим, що найбільша кількість позитивно впливаючих на здоров'я людини бактерій, виділено саме із кишечника людини, і саме ці бактерії, заповнюючи КШТ беруть на себе основну захисну функцію, в той час як інші мікроорганізми яляються транзитними. Пробіотичними властивостями володіють молочнокислі палички та коки, яких немає в кишечнику людини, а також інші мікроорганізми - B.subtilis, B.licheniformis, B.cereus, L.acidophilus, L.delbrueckii, L.plantarum, L.fermentum, L.salivarius, L.casei, L.rhamnosus, L.reuteri, B.bifidum, B.longum, B.adolescentis, E.coli, Ent.faecium, Str.saliverius subsp. thermophilus, Saccharomyces boulardii) [52].

Крім того, автори використовують різні сполучення цих мікрорганізмів, а також форми застосування. В нашій країні традиційно склалося ділення препаратів, що містять живі бактерії, на медичні препарати і харчові добавки. При цьому зазначається, що “терапевтичним мінімумом” вважається 10 живих мікробних клітин в 1г продукту. Саме зберігання достатньої кількості життєздатних клітин є однією з найбільш проблематичних сторін використання пробіотиків. Крім того, введені бактерії мають ще прижитись в кишечнику людини і виробляти in situ активні речовини.

Залежно від природи складових компонентів і форми використання, можна виділити такі основні групи пробіотиків:

-препарати, котрі містять живі мікроорганізми (монокультур або їхні комплекси);

-препарати, котрі містять структурні компоненти мікроорганізмів - представників нормальної мікрофлори або їхніх метаболітів;

-препарати мікробного або іншого походження, котрі стимулюють ріст та активність мікроорганізмів - представників нормальної мікрофлори;

-препарати, котрі є комплексами живих мікроорганізмів, їхніх структурних компонентів та метаболітів у різних поєднаннях, а також сполук, що стимулюють ріст представників нормальної мікрофлори;

-препарати на основі живих генно-інженерних штамів мікроорганізмів, їхніх структурних компонентів і метаболітів із заданими характеристиками;

-продукти функціонального харчування на основі живих мікроорганізмів, їхніх метаболітів, інших сполук мікробного, рослинного або тваринного походження, здатних підтримувати та відновлювати здоров'я шляхом корекції мікробної екології організму людини) [44]. Класифікація пробіотичних препаратів залежно від складових компонентів представлена в таблиці 1.2.

Таблиця 1.2 Класифікація пробіотичних препаратів

1.3.1 Біопрепарати для корекції мікрофлори організму людини

Пробіотики на основі компонентів мікробних клітин або метаболітів реалізують свій позитивний вплив на гомеостаз, безпосередньо впливаючи на метаболічну активність клітин відповідних органів і тканин або опосередковано - регулюючи активність мікрофлори на слизовій оболонці кишечнику.

Більшість пробіотиків, які маємо на теперішньому фармацевтичному ринку, застосовують для лікування та профілактики дисбактеріозів ШКТ. Одиничні розробки пробіотиків для санації ротової порожнини та урогенітальної системи. Розглянемо перелік основних із них.

Кишкові палички почали застосовувати в якості основи біопрепаратів ще з 1918 року в складі мутафлора. Ефективність препарату пов'язували із різким зменшенням утворення в кишечнику токсичних речовин під впливом нормалізованої кишкової мікрофлори. В СРСР для розробки нового пробіотика використали штам E.coli М17, який вирощували на молоці. “Коліпростокваша” мала короткий термін зберігання і тому не отримала широкого розповсюдження. В 1961р. було отримано ліофільно висушенний препарат - сухий колібактерин, котрий по ефективності не поступав рідкій молочній формі.

В наш час розробленні нові форми колібактерина - таблетки, капсули, свічки. Кишкові палички являються основою і інших препаратів - нормофлорина, коліфлорана, севакола, мутафлора, нормофлора [52,69].

Першим із пробіотиків, як було вказано вище, був створений колібактерин, пізніше - лактобактерин, біфідумбактерин та біфікол. Ці препарати містять ослаблені живі штами нормальної мікрофлори кишечника.

Колібактерин представляє собою живі бактерії кишкової палички М17 по 10-30 млрд мікробних клітин в одній дозі. Форма випуску - ампули і таблетки.

Біфідумбактерин - містить ліофільно висушені живі клітини штамів B.bifidum №1, 791. В одній дозі препарату не менше 10 живих клітин. Випускається в таблетках, капсулах, пакетах, флаконах [19].

Лактобактерин - препарат із L.fermenti 90 TC-4, в одній дозі 5млн. живих мікробів. Цей препарат відрізняється високим антагонізмом по відношенню до ешеріхій, ентерококів, протея та грибів.

А-бактерин - входить до групи бактерійних препаратів із представників нормальної мікрофлори людини. У складі препарату використана ліофілізована культура виробничого штаму №167 Aerococcus viridans, виділеного із грудного молока. Препарат у вигляді порошка. 1 доза - 2*10 живих клітин аерококів. Застосовується при лікуванні гнійних інфекцій стафілококової, протейної, ешерихіозної етіології, а також перорально з цілю корекції мікрофлори кишечника.

Препарат “Лактінекс” (виробництво США) містить комбінацію штамів L.acidophilus і L.bulgаricus та використовується для профілактики діареї мандрівників, викликаної ентеропатогенною кишковою паличкою. В препараті “Lactobacillus gg” використовуються живі клітини L.casei із тією ж ціллю.

Біолактон - представляє собою висушену ліофільним способом культуру ацидофільної палички штаму 12Б, яка володіє високою антибактеріальною і ферментативною активністю.

“Мальтідофілюс”- пробіотик містить висушені при низьких температурах живі активні клітини L.acidophilus, L.bulgаricus, B.bifidum на основі мальтодекстрина. Представляє собою порошок, який містить в 1 г 3*10:9 КУО. Випускається в капсулах.

У групі монокомпонентних виділяють такі препарати як нормофлор (L.acidophilus), біофлорин (Ent.faecium 68), аеробакт та ін.

Виділяють ще групи полікомпонентних, комбінованих, рекомбінантних та самоелімінуючих препаратів.

Наприклад, такий препарат як лінекс, який містить сублімаційно висушені біфідобактерії, лактобактерії та фекальний стрептокок (S.faecium), забезпечує бактерицидну та антидіарейну дію.

Серед полікомпонентних препаратів слід відмітити також біфіформ - пробіотик компанії “Ферросан” (Данія) призначений для профілактики і лікування дисбактеріозу кишечника. Випускається в капсулах, кожна із яких містить 10 B.longum, 10E.faecium. Препарат володіє широким спектром антагоністичної активності по відношенню до патогенних та умовно-патогенних мікрооорганізмів. Завдяки спеціальній, стійкій до шлункового соку оболонки, бактерії вивільняються із капсули безпосередньо в кишечнику, і тим самим не піддаються дії кислому середовищу шлунка. Приймають до 4 капсул на добу [57].

Біфікол сухий - комплексний препарат, який представляє собою суміш живих біфідобактерії штам №1 і кишкові палички штам М17. Випускається у флаконах [19].

Можна виділити, ще таку групу препаратів як самоелімінуючі. Особливістю цих біопрепаратів являється те, що не вступаючи в конфлікт з іншими мікроорганізмами, бактерії, які входять до їх складу, займають свою екологічну “нішу” і сприяють нормалізації біоценозу кишечника, відновлюють процеси синтезу вітамінів, регулюють бродильні процеси.

До цих пробіотиків відноситься флонівін (Bacillus spp.), субалін (Штам-мутант JP5832), біоспорин (B.subtilis + B.licheniformis), ентерол (S.boulardii) та інші препарати. Ці препарати особливо ефективні при лікуванні дисбактеріоза кишечника, який обумовлений використанням антибіотиків.

Препарат субалін має не тільки виражену стабілізуючу дію на мікрофлору кишечника, але й володіє інтерфероногенними властивостями, впливає на клітинний імунітет і неспецифічну резистентність організму. Для його отримання автори використали один із штамів, який входив до складу пробіотика біоспорину, а саме B.subtilis 3. В новий рекомбінантний штам B.subtilis2335/105 був вставлений ген антивірусної активності, який відповідав за продукцію універсального антивірусного агента б-інтерферона. Штам продукує інтерферон у вигляді гібридного білку із сигнальним -амілазним пептидом, котрий обумовлює екскрецію інтерферона через клітинну стінку. Таким чином новий штам на фоні високої антибактеріальної активності, які присутня материнському штаму, володіє противірусними властивостями. Поєднання таких властивостей робить субалін досить перспективним для лікування вірусних і змішаних інфекцій[52,69].

Одним із перших бацилярних пробіотиків, які з`явилися на фармацевтичному ринку, являється “Бактисубтил”. Його синоніми - Bacitracin, Orobicin, Subticetin. В основі цього препарату штам ІР B.cereus 5832. В 1 капсулі міститься 1 млрд спор бактерій культури B.subtilis IP 5832. B.subtilis, попадаючи в кишечник, протягом декількох годин перетворюється у вегетативну форму. Вегетативні форми бактерій володіють вираженою антагоністичною дією по відношенню до патогенної і умовно-патогенної мікрофлори, селективно стимулюють ріст лакто- і біфідофлори, вивільняють ферменти, які розщеплюють жири, білки, вуглеводи, покращують синтез вітамінів груп Р і К. Препарат рекомендований не тільки для лікування діарей різної етіології, він надає лікувальну дію і при піелонефритах, визваних ентеробактеріями або протеєм, при лікуванні інфікованих варикозних ран. Всі автори відмічають високу безпечність при застосуванні.

Високу лікувальну ефективність при терапії діарей у дітей продемонстрував препарат “Cereobiogen”, основу якого складає B.cereus. Автори вважають, що бактеріальний штам являється стимулятором росту біфідобактерій кишкової мікрофлори і саме з цим пов'язують отриманні клінічні результати. В той же час B.cereus являється умоно-патогенним мікроорганізмом [52,69].

В 1989 р. був створений, а в 1992 введений в практику новий пробіотик - біоспорин. До складу препарату входять два штами спороутворюючих бактерій - B.subtilis №3 та B.licheniformis №31, які знаходяться в вегетативній і споровій формах. Штами доповнюють один одного по антагоністичній активності та ефективні по відношенню до клінічних штамів бактерій родів Salmonella, Staphylococcus, Klebsiella, Citrobacter, Campylobacter, Proreus, Yersinia, патогенній E.coli і грибам роду Candida. Препарат використовують для профілактики і лікування дисбактеріозів та гострих кишкових інфекцій. Виявлена його активність і при лікуванні після радіаційних ускладнень. Випускається біоспорин в ампулах, застосовується по 1-2 дози 3-4 рази на день. Курс лікування 10-14 днів[19].

Єдиним дріжджовим препаратом, який є на Європейському фармацевтичному ринку, являється Перентерол (Бельгія), в якому міститься Saccharomyces boulаrdii. Цей пробіотик випускається у ліофілізованній формі.

Лабораторія “Біокодекс” (Франція) випускає цей дріжджовий пробіотик під назвою Ентерол-250. Його випускають в пакетиках або капсулах, кожний із яких містить 282,5 мг ліофілізованих Saccharomyces boulаrdii (250 мг дріжджів і 32,5 мг лактози). Ентерол антагоністично діє на клостридії, шигелли, стафілококи, кишкові палички, сальмонели, а також на простіші (амеб, лямбій), антитоксично діє по відношенню до цитотоксину Cl.dificile, підсилює місцевий імунний захист кишечника внаслідок збільшення вироблення IgA і його секректорного компонента, лізоциму, збільшує активність дисахаридаз тонкого кишечника (лактази, сахарози, мальтози), покращує переносимість молока і молочних продуктів. Швидко виводиться із організму, не затримуючись в шлунково-кишковому тракті. Можна застосовувати разом із антибіотиками [52,69].

З ціллю корекції глибоких порушень мікробіоценоза кишечника, коли фіксуються не типові форми мікрорганізмів-симбіонтів, використовуються комбіновані мікробні препарати, які містять цілий комплекс підібраних штамів, однотипних за механізмом своєї дії. Серед них виділяють такі, як кипацид (L.acidophilus + комплексний імуноглобуліновий препарат), гастрофарм (L.bulgaricus + протеїн + сахароза), біфіліз (Bifobacterium + лізоцим), карболевур (S.cerevisiae + кремній-органічний сорбент), біфілакт (B.bіfidum + Lactobacillus sp. + лізоцим) та ін.

Біфідумбактерин-форте - ліофільно висушенні живі клітини біфідобактерій, іммобілізовані на сорбенті (кісточкове активоване вугілля). В одній дозі не менше 10КУО. Іммобілізовані біфідобактерії забезпечують високу локальну колонізацію слизистих оболонок, швидше відновлюють нормофлору кишечника.

Такий препарат як нутролін В (лактобацили із комплексом вітамінів групи В) випускаються у двох лікарських формах - капсули і сироп. Кожна капсула містить Lactobacillus Sporogenes 4*10МК (грампозитивні молочнокислі бактерії - представники нормальноїкшкової флори, які сприяють виробленню вітаміна В в кишечнику і пригнічують ріст патогенних бактерій і грибів), а також тіаміна моноцитрат, нікотинамід, рибофлвін.

Препарати на основі лактобактерій, біфідобактерій, кишкової палички та інших мікрорганізмів мають ряд недоліків пов`язаних з тим, що при запальних захворюваннях кишечника формуються несприятливі умови, які знижують їх ефективність. Крім того на них впливає рН середовища і ферментів, чутливих до антибіотиків, хіміо- та променевої терапії. Бактерійні лікарські речовини потребують особливих умов зберігання. На думку С.М.Захаренко [60], препарати метаболітного типу (хілак, дуфалак та ін.) мають ряд переваг щодо живих бактерій. Вони містять продукти обміну грампозитивних і грамнегативних бактерій лактозу, амінокислоти, жирні кислоти і інші біологічно активні речовини, які сприяють створенню оптимального рН в кишечнику і при цьому не чутливі до дії антибіотиків і хіміопрепаратів. Отже, маємо ще одну групу - рекомбінантних пробіотиків (які не містять живих мікроорганізмів). До них відносять хілак, хілак-форте, дуфалак, інулін,фродо, нормазе, порталак та ін.

Виділяють групу препаратів, виготовлених на основі мультисорба - екстралакт, біфілакт-екстра, біфідумбактерин-екстра. Мультисорб унікальний завдяки високому вмісту лігніна - біополімера, який може сорбувати жовчні кислоти, підсилювати розпад холестерина і виводити токсини і шлаки із організму.

Біфідус флора Форс - біологічно активна добавка до їжі, яка відновлює мікрофлору кишечника, нормалізує синтез вітамінів Е і К, захищає організм від гелікобактеріоза та вірусної інфекції. Випускається компанією NSP, форма випуску - капсули, кожна із яких містить L.acidophilus - 25*10 і B.longum - 1,0*10 КУО. Приймають по 1 капсулі 3 рази на день.

Біофлор - препарат складається із екстрактів овочів, трав і прополіса, які частково ферментовані живими бактеріями E.coli (шт. М17). Препарат починає діяти одразі після вживання. В кишечнику створюється конкурентноздатна концентрація E.coli. Саме за рахунок цього досягається витіснення умовно-патогенної мікрофлори, відбувається активізація захисних сил організму під дією біологічно активних екстрактів.

Окарін сухий - представляє суміш мікробних культур E.coli і Ent.faecium, ліофілізованих в середовищі культивування із добавленням цукрово-желатинового середовища. Випускається у флаконах від 1 до 5 порцій і має вид кристалічної або пористої маси рожевого кольору. Застосовується при дисфункціях різної етіології, при авітамінозі (нестача вітамінів В, С, К), при онкологічних і туберкульозних станах, а також в якості радіопротекторної речовини; крім того, ефективний з ціллю профілактики маститу і при аденомі.

“Біококтейль К плюс” автори відносять до пробіотиків нового покоління. В його складі живі клітини E.coli штаму М17 у активній формі в комплексі із екстрактом сої, буряку, петрушки, м'яти, часнику і приполісу, які ферментовані по певній технології. Випускається у флаконах. Ефективний при гастритах, колітах, цукровому діабеті, дерматитах, анеміях, порушеннях жирового і мінерального обміну і т. д.[52,69].

В наш час пробіотики використовуються досить широко і джерелами надходження їх в організм людини різноманітні. В першу чергу це фармацевтичні форми біологічних препаратів та біологічно активні добавки (БАД) до їжі. По друге - природні харчові продукти на молочній та рослинній основі, виготовленні біотехнологічним способом із використанням різних мікроорганізмів. Особливе місце серед них для забезпечення пробіотичного ефекту займають лікарські кисломолочні продукти [24].

Препарати та БАД, як було розглянуто вище, містять мікроорганізми як у вигляді чистих монокультур (в захисних поживних середовищах або без них), так і в комбінаціях, частіше всього в ліофільно висушеному стані в капсулах, порошках, таблетках для перорального вживання, в ректальних та вагінальних свічках, жувальних цукерках і гумках, рідше - в рідкому вигляді. Комбінації можуть включати поєднання культур (декілька штамів одного роду або виду, різних таксономічних груп).

За кордоном зараз досить популярні препарати, які складаються із 6-8 пробіотиків. В літературі з`явилися навіть відповідні терміни - “симбіотики” (від слова симбіоз), “мультипробіотики”. Деякі автори висловлюють ідею, згідно якій кожний штам мультипробіотика в кишечнику знаходить для себе найкращі умови і займає властиву йому мікроекологічну нішу - біотоп. Тому для створення препаратів повинно відбирати штами, перевірені на симбіотичість та селекційовані до виживання в несприятливих умовах.

Отже, в сучасний період застосування пробіотиків і пребіотиків, в звязку із встановленням позитивної дії останніх на організм людини, набуває все більшого поширення. Значно збільшується число пробіотичних мікроорганізмів і препаратів на їх основі та розширюється спектр їх використання з профілактичною та лікувальною ціллю. В таблиці 1.3. представлено перелік пробіотичних препаратів, які найчастіше використовуються в клінічній практиці.

Таблиця 1.3 Пробіотики та пребіотики, які використовуються в клінічній практиці в Україні.

Позитивний вплив пробіотиків на здоров'я людини проявляється різного роду позитивними ефектами, які в цілому характеризуються як пробіотична взаємодія. Цей розділ мікроекології людини представляє собою інтенсивно розвиваючу галузь науки, і тут можна привести суть тих ефектів, на вивченні яких ґрунтується успіх застосування пробіотиків. Основними з них являються наступні:

- колонізація ШКТ пробіотичними мікроорганізмами, які проявляють антагонізм по відношенню до умовно-патогенних та патогенних бактерій, вірусів, грибів та дріжджів. Постійна присутність в кишечнику достатньої кількості прикріплених до його стінки резидентних мікрорганізмів запобігає розмноженню патогенних агентів, їх інвазію в ентероцити і проходження через кишкову стінку шляхом створення в своєму біотопі несприятливого для сторонньої мікрофлори рН середовища, вироблення бактеріоцинів (антибіотичних субстанцій), а також лишение конкуруючих мікроорганізмів їх нутріентів та місць адгезії;

- корисна і адекватна метаболічна активність - продукція вітамінів К, біотина, ніацина, пиридоксина і фолієвої кислоти; гідроліз жовчних солей і холестерину та регуляція його рівня; участь в регуляції жіночих статевих гормонів та ін. [24].

- захисна роль; запобігання негативного впливу радіації, хімічних домішок в їжі, канцерогенних факторів, токсичних ендогенних субстратів, забрудненої води за рахунок стимулювання імунної відповіді і підвищення неспецифічної імунорезистентності - потенціювання продуктів інтерферона, інтерлейкінів, підвищення фагоцитарної здатності макрофагів та ін.

Ця функція пробіотиків в наш час визиває досить великий інтерес і активно досліджується, проводиться пошук штамів із найбільш вираженими імуногенними властивостями. В літературі можна зустріти судження про пробіотики - молочнокислі бактерії як пероральні вакцини, альтернативних подібним препаратам із аттенуйованих мікрорганізмів. Молочнокислі бактерії розглядаються як живі носії імуногенів і захисних антигеннів, а розробка ефективних імунних препаратів із пробіотиків являється одним із самих пріоритетних напрямків сучасної вакцинології. В той же час відомо успішне використання при імунодефіцитах пероральних та ректальних препаратів із пробіотиків - представників кокових мікрорганізмів Lactococcus, Enterococcus, Micrococcus, Streptococcus - у високих концентраціях.

Таким чином, приведені дані свідчать про те, що використання живих культур мікроорганізмів - представників нормальної мікрофлори в складі пробіотичних препаратів для лікування і профілактики дисбактеріозів різноманітної етіології являються новим і перспективним направленням у медицині. Ці дослідження потребують продовження в плані більш глибшого вивчення механізмів взаємовідносин мікро- та макроорганізма.

1.3.2 Застосування у ветеринарній практиці

Використання пробіотиків, як лікарських засобів досить поширене у ветеринарній практиці. Аналізуючи дані літератури бачимо, що для здоров'я тварин дуже важливим є наявність балансу між нормальною і потенційно патогенною мікрофлорою кишечника. Будь-яка зміна в цій рівновазі супроводжується функціональними порушеннями, які призводять до зниження продуктивності тварин.

В наш час більшість авторів доводить, що важливою умовою виникнення сальмонельозів, колібактеріозів, клостідіозів і інших кишкових інфекцій являється дія провокуючих факторів аліментарної природи: різке переведення молодняку на концентрований тип годування, взаємодія комплексу стрес-факторів. До останніх відноситься неправильне транспортування тварин, зміна кліматичних умов, застосування у великих дозах лікарських препаратів, особливо антибіотиків. У молодняку всіх видів тварин неонатальний період характеризується домінуванням кишкових хвороб. Це пов'язано в першу чергу з тим, що отриманий від матері після народження тварин імунітет згасає, а стабільність набутого залежить виключно від складу нормальної мікрофлори в кишечнику. Тому у вказаний період необхідно стабілізувати баланс за рахунок застосування пробіотиків. Пробіотики стимулююють процеси харчування завдяки нормалізації мікрофлори, яка в свою чергу слугує джерелом адьювантно-активних речовин, останні, попадаючи в кров, надають стимулюючий вплив на імунокомпетентну систему організму тварини [61].

Вченими встановлено, що використання пробіотиків, які містять живі культури B.subtilis, B.licheniformis, L.fermentum, L.salivarius, Str.bovis, Megasphaera elsdenii, Selenomonas ruminantium і ін., стимулює біосинтетичні процеси в травному тракті і сприяє збільшенню продуктивності тварин [62,63].

Найбільш перспективними вважають пробіотики створенні на основі мікроорганізмів, які відносяться до родів Bacillus, Lactobacillus, Propionibacterium, а серед них - ті види, котрі являються складовою частиною мікробіоценозів рубця жуйних тварин, зобу птахів, ШКТ поросят і ін. Відповідно аналізу даних літератури, проведеного Миршуновою і Киржаєвим [61], в більшості країн світу застосовують пробіотичні препарати для тварин, основані на монокультурах. В той же час, по даним інших авторів, ветеринарні спеціалісти, які використовують пробіотики для профілактики і лікування різних захворювань, віддають перевагу комплексним біопрепаратам, мікробним компонентом яких являється сполучення декількох видів мікрорганізмів (стрептококи, лактобацили, бактероїди, біфідобактерії і ін.). Такі пробіотики, як стверджують автори, сприяють збереженню голів великої рогатої худоби, овець, свиней, птиць. Звертаючись до зарубіжних даних, автори стверджують, що пробіотики, які використовують для підвищення продуктивності тварин, приймають в мінімально ефективній дозі (10-10 КУО в 1 г корму). При цьому їх вводять кожен день напротязі 1-2 місяців до досягнення результату. Для пробіотика важлива його постійна присутність в порожнині кишечника в значних кількостях, щоб отримати ефект при варіаціях, пов'язаних із годуванням і умовами утримання.

Приводимо перелік пробіотиків, які найбільш часто застосовуються для сільськогосподарських тварин [64]. У Франції запропонований препарат до складу якого антибіотикостійкі штами молочнокислих бактерій - L.acidophilus, L.bulgаricus, Lactococcus lactis. Крім того, в цій країні використовують препарат ліо-біфідус і біфідаген, в Австрії - сугалон, в Німеччині - омніфлора, які представляють собою суміш чистих ліофілізованих культур біфідобактерій, ацидофільної і кишкової паличок. В Угорщині для боротьби із дизентерією застосовують лактомікс, який складається із суміші ентерококів і лактобацил. У Швеції розроблені і користуються великою популярністю серед ветеринарів пробіотики фірми “Medifarm”, основою яких являються також ентерококи і лактобацили, - лактиферм, лакктомікс, пробіоз, пигфегс, лако, ферлак, галако, овікарб, бовіферм і ін [65]. В Росії в практику сільського господарства впроваджено ряд біопрепаратів на основі бактерій-симбіонтів ШКТ, такий як лактовіт, що містить молочнокислі бактерії і вітамін В. З ціллю профілактики шлунково-кишкових захворювань молодняку сільськогосподарських тварин застосовують препарату СБА (L.lactis, L.acidophilus, B.bіfidum), пропацид АВК (L.acidophilus). В США для профілактики діарей молодняку в ранньому віці застосовують ацидофільно-дріжджове молоко (L.acidophilus + S.cerevisiae). В Інституті мікробіології і вірусології НАН України створено три пробіотичних препарати на основі лактобацил і ентерококів - Бовілакт, Лактосан, Лакктин-К для сільськогосподарських тварин [66].

Штами спороутворюючих молочнокислих бактерій застосовують в Південній Кореї в якості стимуляторів росту курчат. Широке розповсюдження у ветеринарній практиці знайшли пробіотики із бацил. Відомий пробіотичний препарат на основі живих клітин B.subtilis і B.licheniformis - бактерин SL, розроблений в Інституті мікробіології і вірусології НАН України. Препарат широко впроваджений у ветеринарну практику і являється високоефективною терапевтичною речовиною при профілактиці і лікуванні діарей телят в післяпологовому періоді. В ІМВ НАНУ розроблений також новий пробіотик ендоспорин, призначений для лікування і профілактики післяпологових захворювань сільськогосподарських тварин. За своєю ефективністю немає аналогів в практиці ветеринарної медицини [52].

Представників роду Bacillus використовують для профілактики і терапії стафілококової, сальмонельозної, колібактеріозної і синєгнойної інфекцій (препарат Qiangsite). Новий бацилярний пробіотик “Biomate 2B Plus”, який складається із B.subtilis і B.licheniformis розроблений для поросят. Його застосування покращує засвоєння їжі, збільшує вагу, позитивно впливає на всі показники стану здоров'я тварин.

Введення бацил у склад комплексних препаратів і спеціальних кормових сумішей, призначених для профілактики сальмонельоза у домашніх птиць, показало їх високу ефективність в пробіотиках “Primalas” і “Protexin”. Також відомий препарат БСП, створений Українським інститутом сільськогосподарської мікробіології (м.Чернігів). Уробактерин (Казахстан) містить уробактерії, які стимулюють продукцію вітаміну В в організмі тварин. “Бовітокс” (Інститут ветеринарної медицини, Київ) - комплексний пробіотик, котрий містить непатогенні штами роду Bacillus і мікробні культури заквасок кисломолочних продуктів. Володіє загально-стимулюючою дією, викликаючи в організмі новонароджених телят індукцію інтерферона [52].

Отже, виходячи із висновку спеціалістів ветеринарної медицини, пробіотики являються ефективними лікувально-профілактичними і ростостимулюючими препаратами. Їх застосовують для нормалізації мікрофлори екологічних систем організму тварин, особливо в умовах, промислового ведення тваринництва, птахівництва, свинарництва. Це екологічно чисті препарати, вони фізіологічні і безпечні за своєю дією для тварин [64].

Потреба у пробіотиках досить висока. Враховуючи несприятливу екологічну ситуацію в Україні, а також рівень загальної захворюваності понад 72 - 86 % населення України, особливо дітей, повинні не менше як двічі на рік проводити курс пробіотикотерапії чи пробіотикопрофілактику.

На сьогодні пробіотичні препарати в Україні виробляють досить мало підприємств. Серед них Одеське підприємство з виробництва імунобіологічних препаратів, Київське підприємство з виробництва бактерійних препаратів “Біофарма”, Харківське орендне підприємство “Біолік”. Це такі препарати, як біфідобактерин, лактобактерин, біфікол. На превеликий жаль технологія виготовлення флаконних лікарських форм пробіотиків, що використовується українськими виробниками, настільки несучасна, що говорити про забезпечення населення України вітчизняними пробіотиками нині неможливо. Підходи до технології виробництва, що існують в Україні (відсутність порошкоподібних форм) не дозволяють вирішити питання повноцінного широкого профілактичного застосування пробіотиків на цивілізованому рівні.

Винятком є деякі молокозаводи, що виробляють кисломолочні суміші з включенням біфідобактерій. Слід розробляти препарати пробіотиків, збагачені компонентами, які сприяють кращій проліферації і адсорбції біфідо- і лактобактерій (лактулоза, вітаміни, харчові і синтетичні волокна). Необхідно розширювати спектр кисломолочних харчових продуктів.

Отже, в сучасний період застосування пробіотиків та пребіотиків, в звязку із встановленням позитивної дії останніх на організм людини, набуває все більшого поширення. Значно збільшується кількість пробіотичних препаратів, розширюється спектр їх використання. Часто, однак, активність пробіотиків в експерименті та клінічних умовах не співпадають, що потребує подальшого збагачення знань відносно способу дії окремих препаратів, проведення коректних досліджень з метою визначення показів для застосування пробіотичних препаратів.

Розділ 2. Матеріали та методи досліджень

2.1 Матеріали досліджень

Обєктом дослідження являлись:

- виробничі штами: E.coli M17 (препарат “Колибактерин”) та B.cereus IP 5832 (“Бактисубтил”).

Препарат “Колибактерин сухой” (Colibacterinum siccum) представляє собою ліофілізовану мікробну масу живих кишкових паличок - штам E.coli М17, виготовлений Київським підприємством з виробництва бактерійних препаратів “Біофарма”. Випускається у флаконах. Одна доза містить 1*10МК.

“Бактисубтил” (Bactisubtil) - кожна капсула препарату містить 1млрд. спор бактерій культури B.cereus IP 5832. Фірма-виробник Hoechst Marion Roussel.

- колекція свіжевиділених та музейних тест-культур (включаючи набір тест-штамів, які використовуються при контролі антагоністичної активності пробіотиків: Shigella sonnei 2802, 5063 Shigella flexneri 337, 170; Escherichia coli 157; Proteus vulgaris 177; Proteus mirabilis 24а, 249; Staphylococcus aureus 209): 24 клінічних штами роду Shigella (збудники дизентерій); 26 клінічних штамів - представників патогенної та умовно патогенної мікрофлори людини (родів Escherichia, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter, Proteus); 4 колекційні штами (Staphylococcus epidermidis) та 11 музейних штамів, які були люб`язно надані нам для проведення досліджень Київським науково-дослідним інститутом епідеміології та інфекційних хвороб ім.Л.В. Громашевського (КНДІЕІХ), за що висловлюємо вдячність.

2.2 Методи дослідження культурально-біохімічних властивостей штамів

Дослідження культуральних і ферментативних властивостей штамів продуцентів проводили загальноприйнятими методами, використовуючи диференціально-діагностичні середовища (середовище Ендо, Левіна, Плоскірева, Сабуро, КА,Цейсслера).

2.3 Метод визначення антагоністичної активності мікроорганізмів

Для оцінки явища мікробного антагонізму окремих компонентів та композицій пробіотичних продуктів, а також офіціальних препаратів-пробіотиків в умовах in vitro використовували відповідні методики [68]. Антагоністичну активність визначали по відношенню до патогенних та УПМ з колекції живих культур лабораторії загальної мікробіології КНДІЕІХ і до клінічних ізолятів, виділених із обстежених осіб, використовуючи метод відстроченого антагонізму.

Тест-культури

З метою оцінки антагоністичної активності виробничого штаму використовують тест-культури, які повинні знаходитись в S-формі клітинного циклу, володіти типовими морфологічними, серологічними, біохімічними властивостями і вірулентністю, яка визначається для мікробів кишкової групи величиною LD50 при внутрішньочеревному заражені білих мишей; для шигелл Флекснера повинна бути не більше 250 млн МК при зараженні суспензії живих мікроорганізмів в 0.9% розчині хлориду натрію або не більше 20 млн МК при зараженні в 0.4% голодному агарі; для S. sonnei - не більше 50 млн МК при зараженні в 0.9% розчині хлориду натрію; для штамів Proteus - не більше 350 млн МК в 0.9% розчині хлориду натрію і 30-50 млн МК в 0.4% голодному агарі.

Тест-культури шигелл Флекснера і Зонне повинні давати позитивну кератоконюктивну пробу у морських свинок.

Тест-культури стафілококу повинні володіти наступними властивостями: утворювати зону гемолізу розміром (3-5) мм через (191) годин росту на МПА з 0.5% крові (людини, барана, кроля), розлитому в чашки Петрі шаром (2-3) мм; коагулювати плазму крові кроля на протязі (21) годин; викликати некроз при підшкірному введенні 200 млн МК добової культури в 0.2 см3 0.9% розчину хлориду натрію кролям вагою (1.50.2) кг на протязі 48-72 годин.

Антагоністичну активність штамів перевіряли до таких музейних штамів як S.flexneri, S.sonnei, ентеропатогенних E. coli, S.aureus, Proteus vulgaris i Proteus mirabilis (стандартних тест-штамів, які використовуються для контролю антагоністичної активності пробіотиків) та клінічних ізолятів. Стандартні тест-штами ідентифіковані по тестам сучасної класифікації, мають певні властивості, які визначають їх видову характеристику.

Виробничі штами повинні володіти високою антагоністичною активністю по відношенню до всіх вказаних тест-культур. Зони відсутності росту тест-культур повинні бути не менше 10 мм.

Музейні культури мікроорганізмів перед використанням активізували із ліофілізованого стану перенесенням в середовище м`ясо-пептонного бульйону (3-5 мл на одну ампулу), інкубували при 37?С 1-3 доби та після одержання густої суспензії мікробних клітин переводили на агаризоване середовище (МПА).

Для визначення антагонізму виробничих штамів використовували метод препендикулярних штрихів на твердому поживному середовищі, сутність якого полягала в наступному: на підсушені чашки Петрі із середовищем МПА по діаметру петлею діаметром (3,50,5)мм висівали штрихом суспензію двохдобової культури пробіотичних мікроорганізмів в концентрації 1 млрд МК в 1мл ізотонічного розчину NaCl. Посіви інкубували в термостаті при (371)?С. Через 2 доби перпендикулярним штрихом до отриманої полоси росту відступив на 1-2мм підсіювали суспензію однодобових культур тест-штамів мікроорганізмів в концентрації 10 МК в 1 мл. Досліди проводили в 3-х повторюваннях. Результати враховували через 18год інкубування за величиною зон пригнічення росту тест-штамів (вимірюючи ці зони лінійкою: від дослідженої культури до початку росту тест-культури в мм). Контролем росту тест-культур слугував їх паралельний посів штрихом на чашки із тим же середовищем (МПА) без досліджуваної культури. Позитивним вважали результат при відстані затримки росту тест-штаму більший за 7 мм.

В кожному випадку розраховували для кожного тест-штаму середнє арифметичне значення затримки росту та його похибку (Мm).

2.4 Методи математичної обробки результатів досліджень

Для обробки експериментальних матеріалів, отриманих при проведені досліджень, застосовують методи математичної статистики. За допомогою математичної статистики можна оцінити відтворюваність аналізу; встановити величину випадкових похибок; виключити результати, які містять промахи; встановити правильність отриманого результату; оцінити надійність результатів досліджень [67].