Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького, Львів, 2008.

Вивчена роль окисно-відновних процесів у формуванні та забезпеченні фізіологічних показників якості і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв in vivo та in vitro, дозріванні ооцитів, їх заплідненні та розвитку ембріонів корів in vitro. Вказане наукове завдання вирішено шляхом експериментального дослідження перебігу та регуляції окисно-відновних процесів при дозріванні і капацитації сперміїв поза організмом, а ооцитів - у процесі дозрівання та після запліднення - росту ембріонів. Виявлені чинники, які характеризують співвідношення між окисненням та відновленням у статевих клітинах, встановлені маркери їх інтенсивності. На підставі отриманих результатів досліджень, розроблені способи оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, корекції інтенсивності окисно-відновних процесів у сперміях та ооцитах, підвищення запліднювальної здатності сперміїв, запліднення корів і телиць in vivo, ооцитів - in vitro. Розроблені та підтверджені у виробничих умовах „Спосіб захисту сперміїв бугаїв при заморожуванні” та „Спосіб визначення кількості живих сперміїв у еякулятах бугаїв”. Вдосконалено способи оцінювання якості та запліднюючої здатності сперміїв за активністю ферментів дихального ланцюга - сукцинатдегідрогеназою та цитохромоксидазою. Розроблено СОУ 1.42-37-6171:2007 ”Велика рогата худоба. Оцінювання якості еякуляту і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв”. Розроблено високоефективне середовище для вирощування ембріонів поза організмом корів „Середовище для вирощування зигот корів ранніх стадій in vitro”.

Ключові слова: окисно-відновні процеси, антиоксиданти, фізіологічні та біотехнологічні методи, капацитація, запліднення in vitro, спермій, ооцит, ембріон, бугай, корова.

АННОТАЦИЯ

Остапив Д. Д. Окислительно-восстановительные процессы в половых клетках быков и коров, способы оценки качества и повышения оплодотворяемости. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С. З. Ґжицкого, Львов, 2008.

Изучена роль окислительно-восстановительных процессов в формировании и обеспечении физиологических показателей качества и оплодотворяющей способности спермиев быков in vivo и in vitro, созревании ооцитов, их оплодотворении и развитии эмбрионов коров in vitro. Указанная проблема решена путём экспериментального исследования течения и регуляции окислительно- восстановительных процессов при созревании и капацитации спермиев вне организма, а ооцитов - в процессе созревания и после оплодотворения - роста эмбрионов.

Выявлено, что эякуляты быков характеризируются высокими значениями потребления кислорода, активности окислительных ферментов, содержания аскорбиновой кислоты и продуктов ёё окисления. Аналогичные результаты получены при изучении фолликулярной жидкости яичников коров. При сравнительно высоких средних значениях величины биохимических показателей проявляют значительные колебания. Изменчивость значений вышеуказанных показателей в сперме быков обусловлена зрелостью спермиев в эякуляте, индивидуальными и породными особенностями быков, разницей между первым и вторым эякулятами, полученных последовательно в один день и в разные дни от одного и того же быка, сезоном года. В яичниках коров причины вариабельности значений биохимических показателей - физиологическое состояние половой железы и размер фолликула.

Анализом корреляций выявлены факторы, характеризирующие соотношение между окислением и восстановлением, установлены маркеры их интенсивности. Выявлена сильная положительная корреляция между активностью сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, потреблением кислорода спермой, его митохондриальной и азидрезистентной компонентами, физиологическими показателями и оплодотворяющей способностью спермиев.

Изучением влияния аскорбиновой кислоты и глутатиона на потребление кислорода, активность окислительных ферментов, а также физиологические показатели (выживаемость и резистентность) и оплодотворяющую способность спермиев установлено оптимальное соотношение указанных антиоксидантов в разбавителе эякулятов быков.

Изучением капацитации спермиев, полученных из придатка семенника, установлено, что инкубация половых клеток в средах с гомогенатом слизистой оболочки матки коровы, фолликулярной жидкостью, гепарином обеспечивает максимальное их количество с морфологическими и биохимическими показателями, характерными для акросомной реакции и капацитации: сглажевается разделение между акросомой и головкой, половые клетки интенсивно потребляют кислород, повышается активность немитохондриального (азидрезистентного) дыхания, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы. В процессе инкубации спермы и капацитации спермиев происходят изменения в содержании как растворимых фракций белков, так и отдельных протеинов.

Клетки гранулёзы обладают дыхательной и восстановительной способностью, величины значений которых зависят от физиологического состояния яичника и размера фолликула. Ооциты коров также обладают дыхательной и восстановительной способностью. Величина их значений зависит от наличия у ооцитов кумулюса и его состояния.

Дыхательной и восстановительной способностью характеризируются эмбрионы коров. Установлена прямая зависимость интенсивностью потребления кислорода от стадии развития бластоцист и, обратная - со скоростью восстановления феррицианида. У ранних и поздних бластоцист от двух третьих до половины, а у бластоцист без прозрачной оболочки - 21,0% потока электронов генерируются гликолизом и транспортируются во внеклеточное пространство.

На основании полученных результатов исследований, разработаны способы оценки качества половых клеток быков и коров, коррекции интенсивности окислительно-восстановительных процессов в спермиях и ооцитах, повышение оплодотворяющей способности спермиев, оплодотворения коров и тёлок in vivo и ооцитов - in vitro. Разработаны и проверены в условиях производства „Способ защиты спермиев быков при замораживании” и „Способ определения количества живых спермиев в эякулятах быков”. Усовершенствованы способы оценки качества и оплодотворяющей способности спермиев по активности ферментов дыхательной цепи - сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы. Разработаны СОУ 1.42-37-6171:2007 ”Крупный рогатый скот. Оценка качества эякулята и оплодотворяющей способности спермиев быков”, а также высокоэффективная среда для выращивания эмбрионов вне организма коров „Среда для выращивания зигот коров ранних стадий in vitro”.

Ключевые слова: окислительно-восстановительные процессы, антиоксиданты, физиологические и биотехнологические методы, капацитация, оплодотворение in vitro, спермий, ооцит, эмбрион, бык, корова.

ANNOTATION

Ostapiv D. D. Redox processes in the gametes of bulls and cows, methods of quality evaluation and fertilization increase. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of agricultural sciences doctor by the specialty 03.00.13 - Human and animal physiology. - S. Z. Gzhytski Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnology, Lviv, 2008.

Dissertation is devoted to the role of redox processes in forming and providing physiological indicies of quality and impregnation capacity of spermatozoa of bulls in vivo and in vitro ripening of oocytes, their impregnation and development of embryos of cows in vitro. This scientific task was fulfilled by the experimental investigation of flow and regulation of redox processes at ripening and capacitacion spermatozoa in vitro, and oocytes - in the process of ripening and after the impregnation - growth of embryos. The factors, providing and characterizing balance between that oxidation and regeneration in gametes, intensity markers were foundout. With the use of the obtained results of theoretical researches, practical methods of evaluation of bulls and cows gametes quality and correction of redox processes intensity in spermatozoa and oocytes, increase of fertilization of spermatozoa and impregnation of cows and heifers in vivo and oocytes - in vitro were developed. „The methods of bulls spermatozoa protection at freezing” and „The methods of determination of living spermatozoa amount in bulls ejakulate” are developed and experimentally tested. The methods of evaluation of quality and impregnating capabilitiy of spermatozoa at activity of enzymes of respiratory chain - succinic dehydrogenase and cytohrome oxydase were improved. SOU 1.42-37-6171:2007 ”Cattle. Evaluation of ejakulate quality and impregnating ability of bulls spermatozoa” was elaborated. High efficient environment for growing embryos out of cows organism „The environment for cows zygote growing at early stages in vitro” was developed.

Keywords: redox processes, antioxidants, physiological end biotechnological methods, capacitacion, fertility in vitro, spermatozoa, oocyte, embryo, bulls, cow.